RISULTATI E DISCUSSIONE

RISULTATI E DISCUSSIONE

I valori di efficacia e di potenza dei composti testati e l’eventuale azione di bloccanti, quali il TEA e l’IbTX, sono riportati nella seguente tabella: Composto Efficacia (% Emax 3x10-5M) Potenza (pIC50) TEA 10mM IbTX 100nM KCl 60mM IG 10 78.5 ± 8.0 4.89 ± 0.03 + N.T. N.T. MP 9 84.6 ± 6.6 4.80 ± 0.02 + + N.T. IG 188 47.3 ± 8.6 N.C. - N.T. N.T. IG167b 77.2 ± 19.8 4.81 ± 0.08 + N.T. N.T. MP 56 a 88.2 ± 2.7 4.92 ± 0.01 - N.T. - MP 61 b 76.8 ± 2.6 4.81 ± 0.02 + N.T. N.T. MP 53 b 80.6 ± 5.6 4.90 ± 0.04 + N.T. + MP 32 39.6 ± 13.7 N.C. + N.T. N.T. IG 176 37.6 ± 5.3 N.C. + N.T. N.T. IG 181 30.5 ± 6.7 N.C. + N.T. N.T. IG 200 53.1 ± 15.7 4.51 ± 0.19 + N.T. N.T. MG 21 e 77.5 ± 3.7 4.98 ± 0.06 N.T. N.T. N.T.

IG 208 d 61.2 ± 2.6 4.72 ± 0.16 + N.T. N.T. IG 202 b 33.5 ± 9.5* N.C. + N.T. N.T. IG 174 b 53.3 ± 9.5 4.52 ± 0.07 N.T N.T. N.T. IG 173 46.3 ± 10.0 N.C. N.T N.T. N.T. MG 21 c 79.1 ± 10.8 5.34 ± 0.11 + - N.T. MG 25 b 64.6 ± 3.5 4.82 ± 0.07 + N.T. N.T. IG 203 b 69.8 ± 7.0 5.11 ± 0.11 + + N.T. IG 204 b 54.0 ±5.0 4.55 ± 0.13 - N.T. N.T. IG 209 53.7 ± 3.5 4.44 ± 0.10 N.T N.T. N.T. TM 33 98.3 ± 1.1 5.26 ± 0.03 + + N.T. TM 18 62.5 ± 12.3 4.70 ± 0.14 + N.T. N.T. FS 95 89.3 ± 4.7 5.04 ± 0.04 + N.T. N.T. AT 47 54.0 ± 4.5 4.58 ± 0.14 + N.T. N.T. GP 375 66.0 ± 6.3 4.97 ± 0.08 + + N.T. GP 380 94.3 ± 1.9 5.66 ± 0.03 + + N.T. GP 405 49.6 ± 9.1 N.C. - N.T. N.T. AGU (OCH3,Cl) an2 92.3 ± 2.6 5.59 ± 0.03 + + N.T.

Composto Efficacia (%Emax a 3x10-5M) Potenza (pIC50) TEA 10mM VKC 9 64.3 ± 10.0 4.99 ± 0.27 + VKC 10 58.9 ± 4.5 4.79 ± 0.06 + VKC 11 29.3 ± 2.7 N.C. + VKC 16 42.7 ± 4.4 N.C. + VKC 17 43.6 ± 1.1 N.C. + VKC 18 Inefficace N.C. - VCK 19 39.3 ± 8.1 N.C. - VKC 20 33.8 ± 4.5 N.C. - VKC 21 46.5 ± 9.6 N.C. - VKC 22 66.8 ± 7.7 4.85 ± 0.12 + VKC 23 31.3 ± 2.4 N.C. - Legenda * = Fino a 10-5M per mancanza di composto

Emax = Efficacia mostrata alla massima concentrazione somministrata.

pIC50 = Potenza espressa come logaritmo negativo della concentrazione necessaria ad inibire il 50% della concentrazione max. ottenuta con KCl 25mM. TEA = Tetraetilammonio, bloccante non selettivo dei canali al potassio.

IbTX = Iberiotossina, bloccante selettivo dei canali BK. N.T. = Non testato nelle condizioni descritte

N.C. = Non calcolabile perché il composto mostra un’efficacia inferiore al 50% + = Composto sensibile all’azione del bloccante

I composti di nuova sintesi che sono stati utilizzati sono strutturalmente correlabili al resveratrolo il quale presenta valori di efficacia (% Emax 3x10

-5

M) pari a 83 ± 5 e potenza (pIC50) pari a 5.16 ± 0.13. Come precedentemente mostrato nel capitolo “Scopo della ricerca”, i composti IG 10, MP 9, IG 188, IG 167b, MP 56a, MP 61b, MP 53b e MP 32 presentano una struttura con una rigidità superiore al resveratrolo a causa di una modifica del linker tra i due benzeni. Da un doppio legame stilbenico si passa alla formazione di sistemi ciclici irrigiditi che impediscono la libera rotazione. Questa modifica porta alla formazione di bicicli idrocarburici come nel caso del primo composto oppure di bicicli eterociclici come nel caso di altri composti. Dai risultati ottenuti, presentati nella precedente tabella, è possibile ipotizzare che diminuendo i gradi di libertà, attraverso questa modifica, la molecola assume una conformazione tridimensionale non ottimale per l’interazione con il canale, infatti risultano valori di potenza inferiori rispetto al resveratrolo.

Per i composti TM 33, TM 18 e FS 95 i valori risultano invariati rispetto al resveratrolo nonostante presentino la stessa rigidità dei composti precedenti. E’ tuttavia da notare che la loro struttura è correlabile più agli estrogeni che al resveratrolo e tale analogia potrebbe comportare l’acquisizione di proprietà farmacodinamiche

peculiari. E’ possibile osservare l’andamento della curva concentrazione-risposta del composto TM 33 nel grafico 1.

Maggiore interesse invece è stato destato dai i composti GP 375 e GP 380, anch’essi dotati di struttura rigida ma con la porzione eterocicla nella posizione più esterna rispetto al linker. Questa differenza ha portato a valori sia di efficacia che di potenza maggiori rispetto al resveratrolo ed è ipotizzabile che tale miglioramento possa essere attribuito a fattori di tipo elettronico. Sono state riportate in seguito le curve concentrazione-risposta di GP 375 e GP 380 rispettivamente nel grafico 2 e nel grafico 3, nel primo si può notare un marcato antagonismo da parte di TEA e di IbTX mentre nel secondo si può notare che l’effetto antagonista da parte dell’IbTX è significativo solo nella parte sinistra della curva concentrazione-risposta di GP 380. Per quanto riguarda altre modifiche del linker, è stato inserito un gruppo ammidico, già rivelatosi vantaggioso in studi precedenti che in alcuni casi avevano portato a molecole più potenti dei farmaci di riferimento (Biagi et al., 2004; Caderone et al., 2008). Nonostante questo, per i composti IG 176, IG 181, IG 200, MG 21e, IG 208d e IG 202b che presentano questa modifica, non sono stati osservati effetti superiori al resveratrolo. Sono stati inseriti anche dei gruppi tioammidici come nel caso dei composti IG 174b, IG 173, MG 21c,

MG 25b, IG 203b, IG 204b e IG 209, e questo ha portato a valori migliori rispetto ai precedenti ma sempre inferiori o comparabili al resveratrolo, infatti confrontando i due composti IG 200 e IG 203b che hanno solamente la differenza del gruppo ammidico, per il primo e del gruppo tioammidico, per il secondo, si può vedere che il secondo raggiunge valori pari al resveratrolo mentre il primo è inferiore. Per il composto IG 203b è stata riportata nel grafico 4 la curva concentrazione-risposta, dalla quale è possibile notare il netto effetto antagonista dell’IbTX.

Interessante anche il profilo del composto MG 21c che rispetto al composto MG 25b presenta un gruppo –OH metossilato. Questa modifica ha portato dai valori di potenza bassi del composto con il gruppo ossidrilico a valori molto superiori, rispetto al resveratrolo, del composto metossilato. Questo miglioramento però non è del tutto correlabile ai canali BK, infatti gli effetti del composto MG 21c risultano antagonizzati dal TEA ma non dall’IbTX, come è possibile notare anche dal grafico 5, per cui è stato dedotto che il composto agisce su altri tipi di canali del potassio probabilmente diversi dai BK. Sono stati utilizzati anche dei composti che presentano un ampliamento del linker con sistemi polieterociclici, quali VKC 9, VKC 10, VKC 11, VKC 12, VKC 14 e VKC 15. Tali composti,

tuttavia, presentano effetti farmacologici poco interessanti, probabilmente attribuibili alle notevoli divergenze strutturali rispetto ai requisiti farmacoforici tipici dei BK-attivatori. I composti VKC 16, VKC 17, VKC 18, VKC 19, VKC 20, VKC 21, VKC 22 e VKC 23, ancora caratterizzati da linker ampliati, presentano una catena lineare molto più lunga del resveratrolo ed un anello a cinque termini al posto di un benzene. Anche questa modifica ha portato ad un peggioramento delle proprietà farmacodinamiche.

Il composto ureidico AGU(OCH3,Cl)an2 può essere considerato un derivato di NS 1619, attivatore dei canali BK (con valori di efficacia totale e pIC50 pari a 5.18 ± 0.06), in cui tuttavia rimangono evidenti delle analogie strutturali con il resveratrolo. Lo studio funzionale sull’aorta di ratto ha rivelato dei valori di efficacia e di potenza superiori al composto di riferimento ed è osservabile anche dal grafico 6, che l’effetto vasorilasciante è antagonizzato sia dall’IbTX che dal TEA.

Questo derivato ureidico è stato selezionato per un approfondimento sperimentale. In particolare, è stato svolto uno studio basato su tecniche spettrofluorimetriche e finalizzato a determinare gli effetti di AGU(OCH3,Cl)an2 sul potenziale di membrana di cellule muscolari lisce vascolari di aorta umana. Gli effetti elettrofisiologici del

composto sono stati comparati con valinomicina, farmaco con proprietà iperpolarizzanti dovute alla capacità di aumentare la permeabilità selettiva della membrana cellulare verso gli ioni potassio e con NS 1619, BK-attivatore di riferimento. E’ stato usato KCl ad una concentrazione di 60mM come depolarizzante di membrana. Da questo studio è stato possibile costruire il grafico 7 dal quale si può notare come la diminuzione di fluorescenza relativa, correlabile ad effetti di iperpolarizzanti del composto in esame, sia superiore al BK-attivatore di riferimento, e paragonabile alla valinomicina. In conclusione osservando i risultati ottenuti è stato possibile sostenere che le modifiche effettuate al composto di partenza NS 1619 si sono rivelate molto interessanti in quanto la funzione ureidica come linker sembra soddisfare i requisiti farmacoforici per i canali BK.

Grafici

Grafico 1: Curve concentrazione-risposta di TM 33 ottenute sull’aorta contratta con KCl 25mM in condizioni di controllo e in presenza di TEA 10mM, IbTX 100nM.

Composto GP 375 O N NH₂ OH HO GP 375 -8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 0 25 50 75 100 +TEA 10mM GP 375 +IbTX 100nM Log [GP375] % E ff e tt o V a s o ri la s c ia n te

Grafico 2: Curve concentrazione-risposta di GP 375 ottenute sull’aorta contratta con KCl 25mM in condizioni di controllo e in presenza di TEA 10mM, IbTX 100nM.

Composto GP 380 HO OH S N OH GP 380 -8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 0 25 50 75 100 GP 380 + TEA 10mM +IbTX 100nM Log [GP 380] % E ff e tt o V a s o ri la s c ia n te

Grafico 3: Curve concentrazione-risposta di GP 380 ottenute sull’aorta contratta con KCl 25mM in condizioni di controllo e in presenza di TEA 10mM, IbTX 100nM.

Composto MG 21c N H S OCH₃ OH HO MG 21 c -8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 0 25 50 75 100 MG21c +TEA 10mM +IbTX 100nM Log [MG21c] % E ff e tt o V a s o ri la s c ia n te

Grafico 4: Curve concentrazione-risposta di MG 21c ottenute sull’aorta contratta con KCl 25mM in condizioni di controllo e in presenza di TEA 10mM, IbTX 100nM.

Composto IG 203b N H S OH OH OH HO IG 203 b -8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 0 25 50 75 100 IG203b +TEA 10mM +IbTX 100nM Log [IG 203b] % E ff e tt o V a s o ri la s c ia n te

Grafico 5: Curve concentrazione-risposta di IG 203b ottenute sull’aorta contratta con KCl 25mM in condizioni di controllo e in presenza di TEA 10mM, IbTX 100nM.

Composto AGU(OCH3,Cl)an2 N H NH O OCH3 HO Cl Cl -8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0 0 25 50 75 100 AGU(OCH3,Cl)an2 + TEA 10mM +IbTx 100nM

Log [AGU(OCH₃,Cl)an2]

% E ff e tt o V a s o ri la s c ia n te

Grafico 6: Curve concentrazione-risposta di AGU(OCH3,Cl)an2

ottenute sull’aorta contratta con KCl 25mM in condizioni di controllo e in presenza di TEA 10mM, IbTX 100nM.

0 5 10 15 20 25 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 -0.0 0.1 0.2 0.3 NS1619 10µM AGU(OCH₃,Cl)an2 10µM Valinomicina 2µM KCl 60mM Min (F t-F o )/ F o

Grafico 7: effetti elettrofisiologici di AGU(OCH3,Cl)an2, NS 1619, valinomicina e KCl sul potenziale di membrana di cellule muscolari lisce vascolari di aorta umana. L’incremento di fluorescenza relativa ([Ft-F0]/F0) è correlabile ad effetti depolarizzanti, mentre una diminuzione della fluorescenza relativa è indice di effetti iperpolarizzanti. I farmaci sono stati somministrati alle cellule al tempo 0.