CAPITOLO 3 FATTORI DI TRASCRIZIONE
Negli ultimi anni, sia lo studio dei meccanismi e dei fattori coinvolti nella differenziazione e diversificazione dei cardiomiociti, sia lo studio della morfogenesi cardiaca hanno rivelato la presenza di un network molecolare evolutivamente conservato e costituito da una fitta rete di fattori di trascrizione, i quali esercitano un importante controllo sull'identità cellulare, sui segnali extracellulari e sulle informazioni di posizione durante la vita embrionale (Cripps RM and Olson EN., 2002).
In particolare, Gata4 e Nkx2.5, espressi nelle prime fasi della morfogenesi cardiaca, interagiscono tra loro in maniera estremamente complessa al fine di garantire una corretta settazione cardiaca e un corretto sviluppo vascolare.
3.1 GATA-BINDING PROTEIN 4 (Gata4)
La famiglia dei fattori di trascrizione GATA è composta da sei proteine (GATA 1-6), caratterizzate da una regione altamente conservata costituita da un dominio di due zinc finger adiacenti (Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys); questo dominio è responsabile del legame con una specifica sequenza nucleotidica nei promotori di geni target: 5'-(A/G)GATA(A/T)-3' (Pikkarainen S et al.,2004). Anche le regioni N-terminale e C-terminale sono regioni altamente conservate e sono fondamentali per l'interazione con altri fattori di trascrizione, quali Fog2, Nkx2.5, Hand2, Mef2c e Nf-At3 (Nemer G et al.,2006).
I membri della famiglia GATA hanno pattern di espressione diversi, ma sovrapposti sia dal punto di vista temporale che spaziale (Patient RK et al.,2002). Gata 1, 2 e 3 sono espressi nelle cellule della linea emopoietica (megacariociti, eritroblasti,cellule T ed eosinofili), nei testicoli, nelle cellule endoteliali e a livello di cervello e fegato dell'embrione. Gata 4, 5 e 6 sono riscontrati nei tessuti mesodermici ed ectodermici di cuore, polmoni, stomaco, intestino, gonadi e vasi sanguigni (Garg V et al.,2003). In accordo con questi diversi pattern di espressione, modelli murini knockout per il gene GATA hanno evidenziato il ruolo cruciale di questi fattori di trascrizione nella differenziazione cellulare durante l'organogenesi e nella morfogenesi cardiaca (Heikinheimo M et al.,1994) (Fig.6).
Fig.6. Struttura ed omologia delle proteine GATA. (Roberts V et al / Molecular endocrinology 2008)
Fig.8. Posizione del gene Gata4 sul cromosoma 8.
Fig.9. Struttura del gene Gata4. (Reamon-Buettner SM et al / BMC Med Genet
2007)
Studi su modelli murini hanno dimostrato che la totale assenza di Gata4 (Gata4-/-) nella linea germinale è causa di morte dell'embrione entro il decimo giorno di vita fetale, a seguito della mancata differenziazione dell'endoderma extra embrionale, fondamentale per la corretta settazione cardiaca (Kuo et al. 1997, Molkentin et al. 1997). Varianti in eterozigosi per Gata4 (Gata4+/-) sono invece associate all'insorgenza di difetti del setto atrio-ventricolare (Garg V et al.,2003; Rajagopal SK et al.,2007; Wessel MW et al.,2010).
Ad oggi, più di 67 mutazioni sono state descritte nel gene Gata4 (47 nella porzione codificante e 20 nella regione non codificante del gene) (Fig.10). Esse comprendono mutazioni missenso e piccole delezioni e tutte sono state osservate in pazienti con CC sia familiare che sporadica (Zhang W. Et al.,2008). Le mutazioni con le conseguenze più gravi si localizzano nelle regioni N-terminale e C-terminale, poiché distruggono la struttura secondaria della proteina, inibiscono il legame con il DNA e/o alterano l'interazione e la sinergia tra Gata4, Nkx2.5 e Tbx5.
Fig.10. Mutazioni riscontrate in Gata4. (Chen Y et al / Clinica Chimica Acta., 2010).
Altre varianti geniche sono state, invece, riscontrate nella regione 3' non tradotta (3'-UTR) del gene Gata4, costituita da 1525 pb nella porzione terminale dell'esone 7 (Reamon-Buettner SM et al., 2007). Questa regione è essenziale per la corretta espressione di vari geni sia durante la gametogenesi che lo sviluppo embrionale.
3.2. NK2 transcription factor related, locus 5 (Nkx2.5) La proteina codificata dal gene Nkx2.5 fa parte della famiglia dei fattori di trascrizione (classe delle chinasi nucleotidiche NK-2) contenenti un omeo-dominio di 60 aminoacidi altamente conservato, il quale interagisce con il DNA attraverso un motivo ad elica-giro-elica (Stallmeyer B et al.,2010). Il gene Nkx2.5 mappa sul cromosoma 5q34 e consiste di due esoni che codificano per una proteina di 324 aminoacidi (Reamon-Buettner SM et al., 2004).
La proteina è costituita da tre regioni altamente conservate (Fig.12):
• il dominio TN, posto nella regione amino-terminale e con funzione non nota;
• l'omeo-dominio;
• il dominio NK2, ulteriore sito di legame con il DNA e responsabile delle interazioni con altre proteine (Stallmeyer B et al.,2010).
Fig.11 Posizione del gene Nkx2.5 sul cromosoma
Fig.12. Struttura del gene Nkx2.5.
Molti studi hanno esaminato i meccanismi attraverso i quali Nkx2.5 regola la morfogenesi cardiaca e le sue interazioni con altri fattori di trascrizione (Lints TJ et al.,1993; Shiojima I et al.,1996; Tanaka M et al.,1999). Nkx2.5 inizia ad essere espresso nel cuore fetale intorno al settimo giorno di vita embrionale e continua ad essere espresso nel miocardio degli atri e dei ventricoli durante tutto sviluppo e nella vita adulta (Tanaka et al.,1998). E' risultato, quindi, evidente che Nkx2.5 gioca un ruolo fondamentale non solo nella differenziazione delle cellule miocardiche nel feto, ma anche nella vita postnatale (Thompson JT et al., 1998).
La maggior parte delle mutazioni fino ad oggi descritte su Nkx2.5 interessano l'omeo-dominio (Reamon-Buettner SM., 2004). Esse comprendono sia mutazioni missenso con sostituzione di un singolo aminoacido, sia mutazioni non-senso che generano una proteina tronca (Fig.13) (Hirayama-yamada K et al., 2005). Dal punto di vista biochimico, queste mutazioni sono responsabili di una ridotta capacità di legare il DNA e di una perdita della funzione regolatrice della proteina (Stallmeyer B et al.,2010).
Fig.13. Mutazioni riscontrate nel gene Nkx2.5.
Mutazioni riscontrate in casi familiari sono sottolineate. (Stallmeyer B. et al / Clin Genet 2010)
Studi su modelli murini hanno dimostrato che l'assenza di questo gene (Nkx2.5-/-) è per lo più letale in quanto responsabile di un'anormale morfogenesi cardiaca con morte dell'embrione intorno al decimo giorno per insufficienza emodinamica (Clark KL et al.,2006). Varianti in eterozigosi (Nkx2.5+/-) presuppongono principalmente all'insorgenza di difetti del setto atrio-ventricolare, spesso accompagnati da un'importante atrofia del sistema di conduzione per mancata interazione con il fattore di trascrizione Tbx5 (Jay PY et al.,2004). Sono inoltre state descritte mutazioni che non interessano l'omeo-dominio e che sembrano responsabili di difetti cardiovascolari, quali anomalie conotruncali, trasposizione delle grandi arterie, sindrome del cuore sinistro ipoplasico e ventricolo destro a doppia uscita (McElhinney DB et al.,2003). Tuttavia, non è ancora stata individuata una correlazione certa tra le conseguenze
funzionali delle mutazioni a carico di Nkx2.5 ed il fenotipo clinico del paziente (Pabst S et al.,2007).
Studi recenti hanno voluto dimostrare la natura somatica di alcune mutazioni riscontrate in Nkx2.5 (Reamon-Buettner SM et al.,2006). Sembra che tali mutazioni si sviluppino da errori nella divisione cellulare durante i primi stadi dell'embriogenesi e che siano presenti solo nel tessuto malato del paziente (Pabst S et al.,2007).
