5. Discussione
Il DNA genomico estratto dei 99 miceli sterili analizzati in questo lavoro, è stato amplificato con successo mediante un protocollo di PCR con un unico primer: il minisatellite M13. Questa tecnica risulta vantaggiosa in quanto, permette di partire da piccole quantità di micelio e quindi di DNA e di ottenere fingerprinting chiari e riproducibili.
Un importante aspetto della tecnica della PCR fingerprinting, che prevede l’utilizzo di un unico minisatellite come primer, è indubbiamente la riproducibilità dei risultati. Tali primer, rispetto a quelli random 10mer, hanno una lunghezza nucleotidica superiore e presentano una temperatura di ibridazione maggiore. Quindi, l’alta specificità di riconoscimento del target, da parte di questi primer, riduce la competizione tra i primer stessi, un effetto ad esempio osservato nella tecnica RAPD-PCR (Weising et al., 1995).
Per lo scopo di questo lavoro, la dereplicazione di miceli sterili, la tecnica del fingerprinting molecolare, utilizzando il minisatellite M13 come unico primer in reazioni di PCR, si è rivelata estremamente utile. Infatti sono stati ottenuti fingerprinting identici per numerosi isolati confermando una delle caratteristiche fondamentali del minisatellite M13: la possibilità di dar luogo a fingerprinting individuo specifici (Ryskov et al., 1988).
I minisatelliti hanno aperto la strada del DNA fingerprinting per studi di variabilità inter e intraspecifica e per l’identificazione di singoli individui (Jeffreys et al., 1985; Weising et al., 1995). Nel caso specifico dei funghi sono stati impiegati per studi di differenzazione a livello di genere e di specie consentendo, inoltre, l’individuazione di cloni di un singolo isolato attraverso fingerprinting identici (Ryskov et al.,1988; Meyer et al., 1992; De Scenzo e Harrington, 1994).
Meyer et al. (1990), utilizzando l’M13 come sonda hanno analizzato ceppi noti e i loro cloni, appartenenti a tre generi e a cinque specie diverse, di funghi filamentosi (Penicillium janthinellum, P. citrinoviridae, P. chrysogenum, Aspergillus niger, Trichoderma harzianum). I risultati ottenuti dall’analisi dei
pattern, hanno evidenziato come questa tecnica, sia un metodo applicabile con successo per la differenziazione a livello di genere, di specie e di singolo isolato.
Da un’analisi globale dei fingerprinting dei miceli sterili isolati sia dal terreno sabbioso che da quello argilloso è emerso che il numero di bande ottenute è compreso tra 4 e 13. Tali valori risultano in accordo con numerosi lavori svolti sui funghi filamentosi (Weising et al., 1995).
L’analisi dei fingerprinting ha permesso di costruire matrici di somiglianza con le quali è stata condotta un’analisi cluster sia per i miceli sterili isolati dal terreno sabbioso che da quelli isolati dal terreno argilloso.
L’analisi cluster oltre a confermare l’identità degli isolati dereplicati, che mostravano una percentuale di somiglianza pari a 100, ha evidenziato anche
alcuni gruppi di isolati simili che mostravano percentuali di somiglianza uguali o superiori al 75%. I restanti isolati si sono raggruppati in numerosi cluster con percentuali di somiglianza inferiori a 60.
Meyer et al. (1990) analizzando 11 isolati e i loro cloni, appartenenti a tre generi e a cinque specie diverse di funghi filamentosi, hanno osservato che non esiste similarità apprezzabile tra i fingerprinting originatisi da funghi appartenenti a generi diversi e sono state riscontrate basse percentuali di similarità tra i fingerprinting ottenuti da isolati di specie appartenenti allo stesso genere. Inoltre, i fingerprinting di isolati della stessa specie mostravano un’elevata similarità e quelli dei cloni di uno stesso individuo erano identici.
Sulla base dei risultati ottenuti nel presente lavoro è possibile ipotizzare che gli isolati che si raggruppano in cluster con percentuali di somiglianza superiori al 75% appartengano alla stessa specie. Nei rimanenti casi è ipotizzabile che gli isolati appartengano a specie dello stesso genere o a generi diversi.
L’analisi dei fingerprinting ottenuti dalle specie note analizzate, sebbene sia stata condotta su un esiguo numero di isolati, appartenenti a quattro generi diversi e a tre specie dello stesso genere, sembra confermare tale ipotesi.
La dereplicazione dei miceli sterili è stata, quindi, effettuata in entrambi i tipi di terreno. Nel terreno sabbioso sono stati dereplicati 11 miceli sterili sui 42 analizzati (26%) e nel terreno argilloso ne sono stati dereplicati 20 sui 57 inizialmente saggiati (35%).
I gruppi di isolati dereplicati provengono da paglia trattata con Deossinivalenolo (DON), o da paglia non trattata (CTRL) ma sono stati individuati anche gruppi costituiti da miceli sterili isolati da paglia in presenza e in assenza di DON. Tali risultati sono in accordo con quanto osservato in una precedente ricerca nella quale sono stati isolati i miceli sterili oggetto del presente lavoro. Non sono state osservate infatti differenze rilevanti nelle percentuali di identificazione dei vari funghi isolati ottenute per i controlli e per le tesi trattate con DON (Matarese, 2006).
I risultati ottenuti possono essere considerati incoraggianti per sviluppare la metodologia di dereplica di miceli sterili mediante l’analisi di fingerprinting molecolari ottenibili con il primer M13. Attualmente non vi sono notizie di lavori di dereplicazione di funghi filamentosi con l’utilizzo del minisatellite M13 come primer in esperimenti di PCR.
L’approccio molecolare impiegato per la dereplicazione consente di ridurre considerevolmente il numero di individui da analizzare nel caso in cui si conducano indagini su comunità fungine complesse nelle quali sono comunemente presenti miceli sterili. Tali funghi sono spesso trascurati per le notevoli difficoltà che si incontrano nel loro studio, ma risultano di estremo interesse viste le loro potenzialità applicative come promotori della crescita delle piante o agenti di biocontrollo.
I risultati ottenuti nel presente lavoro costituiscono una buona base di partenza per il proseguimento e l’approfondimento delle ricerche sui miceli
sterili analizzati. La consistente riduzione del numero di isolati da saggiare potrà infatti semplificare i programmi di screening di tali organismi per saggi biologici e fisiologici e per studi molecolari rivolti alla loro identificazione.
