Analisi eritroblast

Di particolare interesse è l’espressione degli antigeni specifici per gli eritroblasti, CD71 e GlyA (Glicoforina A detta anche CD235a). La doppia positività di questi due antigeni si riscontra nei midolli ossei normali e in tutti i casi di disordini non clonali. In alcuni casi di MDS, invece, vi è una parziale perdita di CD71 o una deficienza di entrambi gli antigeni[101]_.

Negli ultimi quindici anni svariati studi hanno esaminato le caratteristiche fenotipiche dei precursori emopoietici nelle sindromi mielodispalstiche. Molti di questi sono retrospettivi e con i più diversi approcci che esaminano differenti caratteristiche e utilizzano combinazioni differenti di monoclonali. In tutti questi studi però, si mostra sempre l’incremento delle cellule CD34+ e l’asincronia o l’aberrante espressione antigenica dei vari precursori delle linee emopoietiche nel midollo osseo[96,99,100,102-104]_.

L’utilizzo sopra descritto dei monoclonali permette un soddisfacente approccio per la rilevazione dei fenotipi anormali nella serie eritroide e milelomonocitica, riscontrando almeno un anomalia in ogni caso di sindrome mielodisplastica. Vari studi hanno quantificato una percentuale di anormalità fenotipiche tra il 62 e il 78%[95,98,102,105,106]_{. Aberrazioni della linea} mileomonocitica si riscontrano nel 77% dei casi, come le asincronie

maturative, la parziale o totale perdita di un antigene (molto comune l’aberrazione del CD13).

Aberrazione della linea eritroide si riscontrano nel 64% dei casi nei pazienti affetti da sindrome mielodisplastica. La combinazione CD71/GlyA è la più efficace nel riscontrare anomalie di questa linea; anche se non molto specifica, poiché modificazioni fenotipiche di questo tipo si riscontrano anche in patologie non clonali.

Tra i più importanti parametri di carattere generale non linea specifici nel distinguere una MDS da una patologia non clonale sono: un basso SSC dei blasti (cellule CD34+) e dei promielocitici. Questi dati possono essere un’ evidenza di un asincronia maturativa in molti precursori grunulocitari o un fallimento della granulazione da parte di queste stesse cellule.

L’ipogranulità nei granulociti è una caratteristica morfologica ben conosciuta nelle MDS, ma nella citometria a flusso la prima caratteristica che spicca è la diminuzione del SSC blastico e dei promielociti. La variazione nel fenotipo dei blasti, ma non nella granulazione, viene decritta con l’analisi della co- espressione del CD38, CD33 e HLA-DR[98,102]_.

Come descritto prima alcune caratteristiche trovate nei monociti possono aiutare a discriminare le sindromi mielodisplastiche con le patologie non clonali. Se in entrambi le tipologie patologiche si riscontra un aumento dei monociti in rapporto a midolli di pazienti normali, d’altra parte i monociti e i granulociti condividono un precursore comune e quindi si comportano entrambi come cloni neoplastici. In effetti sono stati riscontrate aberrazioni fenotipiche descritte nei monociti delle MDS e nella leucemia mieloide cronica, ovvero la parziale o totale perdita di CD13,CD14 e CD15. In oltre sempre per la linea monocitaria si rileva un incremento dell’espressione dei CD64 e CD45. Altri studi mostrano l’espressione del CD16 aumentato. I monociti CD16+ sembrano infatti incrementare nei campioni midollari dei

pazienti affetti da sindrome mielodisplastica in parte correlabili ad infezioni virali e ad una condizione pro-infiammatoria[107]_.

Tutte questi dati si tengono assieme con i cambiamenti infiammatori/ immunologici del microambiente midollare descritto nelle sindromi mielodisplastiche. Rimane ancora da determinare se i monociti sono coinvolti in un meccanismo autocrino di immuno-modulazione che coinvolga i cloni ematopoietici anormali.

Molti studi hanno mostrato che il numero di abberrazioni immunofenotipiche aumenta con il progredire della malattia e sono correlabili al IPSS (International Prognostic Score System). Dunque la somma delle aberrazioni immunofenotipiche rilevate dalla citometria a flusso è un buon indicatore del grado di danno funzionale del clone MDS, il quale ha un ruolo prognostico[95,98]_.

Possiamo quindi concludere che l’immunofenotipizzazione è un buon approccio per rilevare eventuali aberrazioni funzionali dell’emopoiesi nelle sindromi mielodisplastiche. La citometria a flusso ha un alta riproducibilità e rimuove la soggettività correlata alla morfologia. Oltre tutto l’analisi citometrica permette di studiare le linee emopoietiche aiutando il clinico a formulare una diagnosi specialmente nei casi con cariotipo normale ove la diagnosi differenziale con le patologie non clonali è difficoltosa. La citometria permette di discriminare bene tra patologie clonali e non nei campioni di sangue periferico che presentino una citopenia all’emocromo.

I futuri studi della citometria dovranno concentrarsi sul tre filoni di ricerca: • standardizzazione del metodo

• ricercare nelle MDS i parametri più efficaci per la rilevazione di un eventuale progressione in leucemia mieloide acuta

3.3 La citogenetica

Le anomalie citogenetiche sono identificate alla diagnosi dal 30 al 70% dei casi di mielodisplasie de novo; la frequenza cresce con un aumento del rischio della malattia. L’accumulo di anormalità cariotipiche associate a progressione patologica della malattia fornice la prova che la trasformazione delle MDS a leucemia mieloide acuta è un processo multi-step della trasformazione neoplastica. Si è dimostrato che la sopravvivenza dei pazienti con anomalie citogenetiche (sopratutto a carico del cromosoma 7) sia inferiore ai pazienti con cariotipo normale[108]_.

Le MDS dunque non sono associate con qualsiasi anormalità cromosomica, ma seguono cambiamenti cariotipici e genetici ben precisi legati a filo diretto con questo tipo di neoplasie. Le principali anomalie citogenetiche delle MDS sono la delezione 5q, la monosomia del 7, la delezione del 7q, la trisomia del 8, la delezione 11q, la delezione 12p e la delezione del 20q[109]_.

Lo studio della citogenetica ha fatto emergere il suo importante ruolo prognostico ed è incorporato nei modelli statistici con lo scopo di migliorare la prognosi individuale del paziente come l’Intenational Prognostic Score System (IPSS). A causa della profonda eterogeneità citogenetica però, l’impatto di molte anomalie rare è ancora sconosciuto e solo con studi multicentrici internazionali se ne potranno delineare le caratteristiche.

In generale le MDS mostrano un profilo genetico caratteristico con sostanzialmente anomalie sbilanciate. Molto frequentemente si osservano una perdita di materiale genetico sotto forma di delezione e monosomia. Il guadagno di materiale genetico come trisomie parziali o totali sono meno ricorrenti. La perdita o il guadagno di materiale genetico può anche essere il risultato di una traslocazione sbilanciata che sono spesso osservate nelle mielodisplasie con numerose anomalie. E’ ovvio assumere quindi che un

oncosoppressori; mentre l’attivazione di oncogeni sembra essere meno rilevante, o comunque aggiungersi come meccanismo molecolare in una fase mielodisplasitica più avanzata. Al contrario delle leucemie mieloidi acute anomalie strutturali bilanciate come traslocazioni e inversioni sono rare nelle sindromi mielodisplastiche. A causa della profonda eterogeneità genetica le conoscenze sulle alterazioni citogenetiche sono fortemente ristrette alle anormalità sopra descritte. (-5/-5q, -7/-7q,+8, 20q- e -Y). La situazione è ulteriormente complicata dal fatto che le alterazioni cromosomiche possono comparire in tre differenti condizioni: come anomalia isolata (esempio sindrome 5q-) oppure insieme a una cambiamento aggiuntivo, o ancora come parte di un complesso di altre alterazioni (tabella 3)con almeno due anomalie citogenetiche[110]_.

Alterazione Totale n(%di tutti i

casi

Isolati n (%) Con una anomalia

n(%) Come parte di un complesso n (%) 5q- 312 (15.1) 146 (47) 52 (17) 114 (36) -7/-7q- 230 (11.1) 86 (37.5) 31 (13.5) 113 (49) +8 173 (8.4) 81 (46.8) 37 (21.4) 55 (31.8) -18/18q- 78 (3.8) 3 (3.8) 2 (2.6) 73 (93.6) 20q- 74 (3.6) 36 (48.6) 10 (13.5) 28 (37.8) -5 69 (3.3) 1 (1.4) 4 (5.8) 64 (92.8) -Y 58 (2.8) 41 (70.7) 5 (8.6) 12 (20.7) +21 45 (2.2) 5 (11.1) 18 (40) 22 (48.9) -17/17p- 42 (2.0) 1 (2.4) 1 (2.4) 40 (95.2) inv/t(3q) 41 (2.0) 16 (39) 8 (19.5) 17 (41.5) -13/13q- 40 (1.9) 5 (12.5) 6 (15) 29 (72.5) +1/+1q 37 (1.8) 3 (8.1) 6 (16.2) 28 (75.7) -21 33 (1.6) 3 (9.1) 4 (12.1) 26 (78.8) +11 28 (1.4) 6 (21.4) 4 (14.3) 18 (64.3) -12 26 (1.3) 0 2 (7.7) 24 (92.3) 12p- 25 (1.2) 7 (28) 6 (24) 12 (48) t(5q) 24 (1.2) 6 (25) 3 (12.5) 15 (62.5)

Questi dati citogenetici sono ottenibili grazie a varie metodiche utilizzabili sia da sole che in combinazione. Le tecniche sono principalmente la florescienza con ibridazione in situ (FISH), la razione a catena della polimerasi (PCR) e la microarray, che si affiancano alle metodiche immunoistochimiche dei patologi.

I dati citogenetici ci forniscono anche informazioni chiave sul riconoscimento e identificazione di geni coinvolti nel cancro e la loro conseguente applicazione nello sviluppo terapeutico. Il progressivo approfondimento della citogenetica e delle basi molecolari nella trasformazione neoplastica ha rinforzato il concetto di cancro come patologia genetica. Le scoperte di apparenti cariotipi normali in cellule anormali (come ad esempio nelle leucemie e in vari tumori solidi) presenta un enigma. Si può ragionevolmente pensare che ci siano cambiamenti genetici criptici coinvolti in tali casi. Questi cambiamenti criptici non sono discernibili con metodi citogenetici di routine, ma tramite tecniche specialistiche come la FISH.

Le informazioni citogenetiche sono diventatie così cruciali per i clinici che le analisi cromosomiche sono richieste nella maggior parte dei casi di leucemia e linfomi. Purtroppo gli studi citogenetici non hanno un immediatezza del risultato, poiché sono richiesti tempi lunghi per le colture, la pre-formazione delle piattaforme e l’interpretazione dei risultati. Non di meno la citogenetica gioca un ruolo cruciale in uno spettro diagnostico comprensivo[111]_.

11q- 23 (1.1) 8 (34.8) 4 (17.4) 11 (47.8)

9q- 23 (1.1) 8 (34.8) 3 (13) 12 (52.2)

t(7q) 22 (1.1) 6 (27.3) 6 (27.3) 10 (45.5)

-20 22 (1.1) 0 0 22 (100)