Analisi fenotipica dei ceppi DWM-5A

L’analisi della funzionalità mitocondriale è stata condotta mediante un’analisi fenotipica al fine di determinare la capacità dei mitocondri di respirare, la capacità della polimerasi mutata di mantenere lo stato rho⁺ delle cellule e di replicare correttamente il DNA mitocondriale.

4.4.1 Spettri dei citocromi e attività respiratoria

Sono stati dapprima determinati gli spettri dei citocromi respiratori dei ceppi DWM-5A trasformati con i vari alleli mip1 dopo crescita in terreno SC addizionato di glucosio 0,5% ad esaurimento (allegato 1, figura 1). Come mostrato, il ceppo DWM-5A/pFL39mip1^G224A mostrava uno spettro indistinguibile rispetto a quello del ceppo DWM-5A/pFL39MIP1. Al contrario il ceppo DWM-5A/pFL39mip1^Y757C presentava uno spettro privo dei citocromi aa3 e b, codificati parzialmente (aa3) o totalmente (b) dal DNA mitocondriale, mentre il picco del citocromo c, codificato dal DNA nucleare, era normale.

E’ inoltre stata misurata l’attività respiratoria dei diversi ceppi DWM-5A (tabella 4.2) Ceppo DWM-5A/ Attività respiratoria (µl/h/mg) % rispetto a pFL39MIP1

PFL39MIP1 26,4 100

pFL39mip1^G224A 26,1 98,9

pFL39mip1^Y757C 0,61 2,3

PFL39 0,68 2,6

Tabella 4. 2: Attività respiratoria dei ceppi DWM-5A/pFL39MIP1, DWM-5A/pFL39mip1^G224A, DWM-5A/pFL39mip1^Y757C e DWM-5A/pFL39. L’attività è espressa per microlitro di ossigeno consumato per ora per milligrammo di peso secco di cellule. I valori sono le medie di due esperimenti indipendenti su due cloni indipendenti.

Come mostrato in tabella, il ceppo DWM-5A/pFL39mip1^G224A possiede un’attività respiratoria non significativamente differente rispetto al ceppo DWM-5A/pFL39MIP1. Al contrario il ceppo DWM-5A/pFL39mip1^Y757C presenta un’attività respiratoria quasi nulla. Il

consumo di ossigeno residuo è dovuto ad altre attività, ad esempio ossigenasiche, come dimostrato dal fatto che il consumo residuo si osservava anche nel ceppo DWM-5A/pFL39 sicuramente rho⁰ e dunque privo di attività respiratoria.

4.4.2 Determinazione della frequenza dei petite

In lievito, è facile valutare se mutazioni patologiche inserite in MIP1 causano la delezione dell’mtDNA, misurando la frequenza dei petite. In particolare abbiamo determinato la frequenza dei petite dei ceppi DWM-5A/pFL39MIP1 e DWM-5A/pFL39mip1^G224A a 28°C (tabella 4.3) e a 36°C (tabella 4.3 e allegato 1, figura 2 A). La determinazione a 36°C è stata condotta per amplificare le differenze, poiché è noto che ad alte temperature i ceppi producono una maggiore percentuale di cloni petite.

Frequenza dei petite a 28°C Frequenza dei petite a 36°C Ceppo DWM-5A/

% Incremento % Incremento

PFL39MIP1 1,9 1,0 9 1,0

pFL39mip1^G224A 4,2 2,2 21 2,3

Tabella 4. 3: Frequenza e incremento dei petite nei ceppi 5A/pFL39MIP1 a DWM-5A/pFL39mip1^G224A a 28°C e a 36°C. La deviazione standard è inferiore in tutti i casi al 15%.

A entrambe le temperature la presenza della mutazione G224A ha causato un incremento della frequenza dei petite di circa 2,2 volte rispetto al wt. Le frequenze risultavano, come atteso, più alte a 36°C (tabella 4.3).

4.4.3 Determinazione della natura dei petite

I petite ottenuti possono essere rho^- oppure rho⁰. Fra le varie tecniche a disposizione per determinare la natura dei petite è stata utilizzata la tecnica dell’incrocio con mutanti tester mit -di sesso opposto, come descritto nell’introduzione. Incrociando un ceppo petite e un ceppo mit^- si ottiene un diploide che può essere respiratorio sufficiente o deficiente, come riportato in figura 4.9. In particolare se il ceppo petite da testare è rho^-, in seguito a fusione dei mitocondri derivanti dai due ceppi e ricombinazione, molto frequente nel DNA mitocondriale di lievito, si otterrà un diploide respiratorio sufficiente, purché la regione di mtDNA presente nel rho^- comprenda la regione che, nel mit^-, è mutata. Al contrario, se il ceppo petite da testare, è rho⁰, non avverrà alcuna ricombinazione e il ceppo diploide sarà respiratorio deficiente. Per avere un’elevata confidenza che un ceppo sia effettivamente rho^- è necessario incrociarlo con diversi mit^-, così da avere un elevata garanzia che venga coperto gran parte del DNA mitocondriale.

Figura 4. 9: Rappresentazione schematica dell’incrocio fra ceppi rho^- e ceppi tester mit^-.

In particolare, i cloni petite precedentemente ottenuti sono stati incrociati con quattro ceppi mit^- di sesso opposto, mutati rispettivamente in due esoni del gene COB (chiamate cob1 e cob2), nel gene COX2 e nel gene COX3 e scelti perché queste regioni sono maggiormente conservate mantenute nei rho^- originatesi spontaneamente (Fukuhara and Wesolowski, 1977;

Mathews et al., 1977). Per ogni ceppo sono stati saggiati almeno 200 cloni fra quelli cresciuti a 36°C. Sono stati anche testati 200 cloni del ceppo DWM-5A/pFL39mip1^Y757C ottenuti direttamente dopo perdita plasmidica su 5-FOA del gene MIP1 selvatico (tabella 4.4 e allegato 1, tabella 1).

Ceppo DWM-5A/ Frequenza dei rho⁰ tra i petite

PFL39MIP1 46%

pFL39mip1^G224A 44%

pFL39mip1^Y757C 100%

Tabella 4. 4: Frequenza dei rho⁰ tra i petite. L’esperimento è stato condotto incrociando almeno 200 cloni per ceppo.

Dalla tabella emergono due chiare evidenze:

- la polimerasi mutata Mip1^Y757C non è in grado di replicare il DNA mitocondriale, essendo tutti i cloni petite privi di mtDNA

- la presenza della mutazione G224A non incrementa la frequenza dei rho⁰ tra i petite, dimostrando che la mutazione G224A non è associata ad un aumento della deplezione di mtDNA.

Per confermare che i cloni valutabili come rho⁰ in base agli esperimenti di incrocio con in mutanti mit^- fossero effettivamente privi di mtDNA, i cloni petite precedentemente ottenuti sono stati analizzati mediante altre due tecniche che permettono la distinzione fra rho^- e rho⁰, il DAPI staining dell’mtDNA e il Southern blot sul DNA mitocondriale. Per quanto concerne il DAPI staining, 50 cloni petite, dei quali 10 risultati rho^- e 40 risultati rho⁰, sono stati incubati in presenza di DAPI, che si lega preferenzialmente, soprattutto a basse concentrazioni, al DNA mitocondriale. Mentre i cloni rho⁺ di controllo presentavano cellule per lo più contenenti DNA mitocondriale e i cloni rho⁰ mostravano un segnale solo proveniente dal nucleo, i cloni rho^- mostravano una percentuale variabile fra il 10% e il 50%

in cui il DNA mitocondriale era visibile (figura 4.10).

Figura 4. 10: DAPI staining di un clone rho⁺ (a sinistra), rho⁰ (al centro) e rho^- (a destra).

Dei 40 cloni presunti rho⁰, una percentuale del 92% non mostrava effettivamente la presenza di DNA mitocondriale, dimostrando che l’incrocio con i ceppi mit^- utilizzati era stato efficace per distinguere la natura dei petite.

Come ulteriore controllo, su 20 cloni rho⁰ è stato condotto un’analisi Southern sul DNA mitocondriale digerito con EcoRV. Come sonda è stato utilizzato un oligonucleotide situato all’interno delle origini di replicazione dell’mtDNA di S. cerevisiae. La maggior parte dei rho -possiede almeno un’origine di replicazione, su cui può ibridare la sonda. Una percentuale pari al 90% (18 cloni su 20) si è dimostrata effettivamente essere rho⁰, confermando ulteriormente la bontà del test precedentemente utilizzati. Il Southern blot su 10 dei 25 cloni e su opportuni controlli è riportato nell’allegato 1, figura 3.

4.4.4 Determinazione della mutabilità puntiforme del DNA mitocondriale Successivamente è stato determinato se le mutazione G224A incrementasse la mutabilità puntiforme del DNA mitocondriale. La mutabilità puntiforme è stata determinata mediante misurazione della frequenza di mutanti resistenti all’antibiotico eritromicina (mutanti Ery^R).

La resistenza all’eritromicina è dovuta a specifiche mutazioni in tre posizioni del gene mitocondriale codificante l’RNA ribosomale 21S (GAA, nucleotidi 59965-59967 sulla mappa dell’mtDNA dell’SGD database http://www.yeastgenome.org/) (Sor and Fukuhara, 1984). In particolare è stato osservato che la presenza della mutazione G224A incrementava la frequenza Ery^R di circa 10 volte (allegato 1, tabella 2).

4.5 Studio della dominanza/recessività delle mutazioni G224A e