3. Materiali e metodi
3.4 Vettori plasmidici
In questo studio sono stati utilizzati i seguenti vettori plasmidici:
Plasmide Marcatori in
S. cerevisiae
Tipo e numero di copie Origine Figura
pUC19 - Vettore di E. coli Yanisch-Perron et al., 1985 3.1 pFL38 URA3 Vettore shuttle,
centromerico
Bonneaud et al., 1991 3.2 A
pFL39 TRP1 Vettore shuttle, centromerico
Bonneaud et al., 1991 3.2 B
pRS425 LEU2 Vettore shuttle, multicopia
Christianson et al., 1992 3.3 A
pWJ841 LEU2 pRS425 contenente il gene RNR1
Zhao et al., 2001 3.3 B
YEplac195 URA3 Vettore shuttle, multicopia
Gietz and Sugino, 1988 3.4
pLGALZ3 leu2D, URA3 Vettore multicopia d’espressione di S.
cerevisiae
Foury and Vanderstraeten, 1992 3.5 A
pLGALMIP1 leu2D, URA3 pLGALZ3 contenente il gene MIP1 (ceppo Σ1278b)
Foury and Vanderstraeten, 1992 3.5 B
Figura 3. 1: Plasmide pUC19.
Figura 3. 2: (A) Plasmide pFL38; (B) Plasmide pFL39.
Figura 3. 3: (A) Plasmide pRS425; (B) Plasmide pWJ841, derivante dall’inserzione in pRS425 del frammento digerito con SacI contenente il gene RNR1.
Figura 3. 4: Plasmide YEplac195.
Figura 3. 5: (A) Vettore d’espressione pLGALZ3. Il plasmide contiene il promotore del gene GAL1 inducibile da galattosio, sotto il cui controllo si trova il gene LacZ. (B) Vettore d’espressione pLGALMIP1.
Il vettore deriva dal plasmide pLGALZ3, in cui il gene LacZ è stato sostituito dal gene MIP1 del ceppo Σ1278b. La regione codificante del gene MIP1 è situato 45 bp a valle del sito SalI, sotto il controllo del promotore GAL1.
3.5 PCR
Tutte le reazioni di PCR sono state condotte utilizzando un termociclatore “Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400”.
3.5.1 Amplificazione di MIP1
Per l’amplificazione di MIP1 è stata utilizzata la “Platinum®Pfx DNA polymerase”
(Invitrogen) e i primer MIPC e MIPE (vedere allegato 1). La PCR è stata condotta seguendo il protocollo fornito dalla casa produttrice, utilizzando 500 ng di DNA genomico estratto dal ceppo W303-1B e 1 unità di Pfx in un volume totale di 50 µl. Per l’amplificazione sono state usate le seguenti condizioni:
- 94°C per 2’
- 30 cicli:
- 94°C per 15’’
- 55°C per 30’’
- 68°C per 10’
3.5.2 PCR per la distruzione di MIP1
Per la distruzione del gene MIP1 nel ceppo W303-1B con la cassetta KANR, è stata utilizzata la “Platinum®Pfx DNA polymerase” (Invitrogen) e i primer S1MIP e S2MIP (vedere allegato 1). Sono stati utilizzati 300 ng di DNA templato (plasmide con cassetta KanMX4) e 1 unità di Pfx in un volume totale di 100 µl. Per l’amplificazione sono state usate le seguenti condizioni:
- 94°C per 2’
- 30 cicli:
- 94°C per 30’’
- 54°C per 30’’
- 72°C per 3’20’’
- 72°C per 7’
Per la distruzione del gene MIP1 nel ceppo D273-10B/A1 con la cassetta KANR, è stata utilizzata la “Biotools Taq” (Biotools) e i primer MIPF e NgoRv (vedere allegato 1 e 2). Sono stati utilizzati circa 10 ng di DNA templato (DNA genomico del ceppo DWM-5A) e 2,5 unità di Taq in un volume totale di 100 µl. Per l’amplificazione sono state usate le seguenti condizioni:
- 94°C per 2’
- 30 cicli:
- 94°C per 30’’
- 52°C per 40’’
- 72°C per 3’
- 72°C per 7’
3.5.3 Mutagenesi sito-specifica
Le mutazioni G224A e Y757C sono state introdotte in MIP1 utilizzando il kit “QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit” (Stratagene), utilizzando come templato 12 ng del plasmide pUC19-MIP1. Rispetto al protocollo fornito dalla casa produttrice, sono state apportate delle modifiche:
- la denaturazione iniziale è stata condotta per 1 minuto;
- sono stati condotti 16 cicli di amplificazione con le seguenti condizioni:
- 95°C per 50’’
- 55°C per 1’
- 68°C per 14’
Per la mutazione G224A sono stati utilizzati i primer mutagenici G249A1 e G249A1, mentre per la mutazione Y757C sono stati utilizzati i primer mutagenici Y783C1 e Y783C2 (vedere allegato 1)
Le mutazioni G651A, A661T, A692T, H734Y G807R e E900G sono state ottenute mediante la tecnica “overlap extension PCR” (Ho et al., 1989; Aiyar et al., 1996). Nella prima PCR è stato usato il primer AVRFw come primer forward e i primer mutagenici G651ARv, A661TRv, A692TRv, H734YRv G807Rv o E900GRv come primer reverse (vedere allegato 2), nella seconda i primer mutagenici G651AFw, A661TFw, A692TFw, H734YFw, G807Fw o E900GFw e il primer BsrRv come primer reverse, eccetto per la mutazione H734Y per il quale è stato utilizzato il primer NgoRv (vedere allegato 2). Le PCR sono state condotte utilizzando la “PfuUltra™ High-Fidelity DNA Polymerase” (Stratagene), utilizzando 5 ng di templato (pUC19-MIP1 linearizzato con SalI) e 2,5 unità di PfuUltra™, in un volume di 50 µl. Sono state utilizzate le seguenti condizioni:
- 95°C per 2’
- 30 cicli:
- 95°C per 30’’
- 52°C per 30’’
- 72°C per 1’30’’
- 72°C per 10 minuti
La terza reazione di PCR è stata condotta utilizzando la precedente coppia di amplificati sia come primer che come templato. La PCR è stata condotta utilizzando la “PfuUltra™ High-Fidelity DNA Polymerase” (Stratagene), utilizzando circa 100 ng di ciascun amplificato (dopo purificazione mediante escissione da gel) e 5 unità di PfuUltra™, in un volume di 100 µl.
Sono state utilizzate le seguenti condizioni:
- 95°C per 2’
- 10 cicli:
- 95°C per 30’’
- 62°C per 1’
- 72°C per 2’
- pausa, durante i quali ad ogni reazione sono stati aggiunti i primer esterni AvrFw e BsrRv (o NgoRv)
- 25 cicli:
- 95°C per 30’’
- 52°C per 30’’
- 72°C per 2’20’’
- 72°C per 10’
3.5.4 Amplificazione di REV7, REV3, CCE1, MHR1, MSH1 e CDC9
Il gene REV7 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer REV7-Fw e REV7-Rv, situati rispettivamente a –609 a +994 rispetto al codone di inizio, così da ottenere un amplificato di circa 1600 bp. Il gene REV3 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer REV3-Fw e REV3-Rv, situati rispettivamente a –304 a +4734 rispetto al codone di inizio, così da ottenere un amplificato di circa 5000 bp. Il gene CCE1 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer CCE1-Fw e CCE1-Rv, situati rispettivamente a –372 a +1223 rispetto al codone di inizio, così da ottenere un amplificato di circa 1600 bp. Il gene MHR1 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer MHR1-Fw e MHR1-Rv, situati rispettivamente a –628 a +1365 rispetto al codone di inizio, così da ottenere un amplificato di circa 2000 bp. Il gene MSH1 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer MSH1-Fw e MSH1-Rv, situati rispettivamente a –323 a +3189 rispetto al codone di inizio, così da ottenere un amplificato di circa 3500 bp. Il gene CDC9 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer CDC9-Fw e CDC9-Rv, situati rispettivamente a –504 a +2393 rispetto al codone di inizio, così da ottenere un amplificato di circa 2900 bp.
L’amplificazione dei geni inferiori a 3000 bp è stata effettuata mediante l’utilizzo della “Pwo DNA Polymerase” (Roche), utilizzando circa 40 ng di DNA genomico del ceppo W303-1B in 100 µl e utilizzando il seguente programma di PCR:
- 94°C per 2’
- 10 cicli:
- 94°C per 15’’
- 51°C per 30’’
- 72°C per 45’’/Kb - 20 cicli:
- 94°C per 15’’
- 51°C per 30’’
- 72°C per 45’’/Kb più 5’’/ciclo - 72°C per 7’
L’amplificazione dei geni superiori a 3000 bp è stata effettuata mediante l’utilizzo della
“PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase” (Stratagene), utilizzando circa 20 ng di DNA genomico del ceppo W303-1B in 50 µl e utilizzando il seguente programma di PCR:
- 95°C per 2’
- 30 cicli:
- 95°C per 20’’
- 51°C per 30’’
- 72°C per 20’’/Kb - 72°C per 3’
3.5.5 PCR da colonia di lievito
Le PCR da colonia di lievito su DNA plasmidico sono state condotte utilizzando la “Biotools Taq” (Biotools). Per l’amplificazione del frammento di MIP1 compreso fra i primer AvrFw e BsrRv, cellule cresciute overnight in terreno minimo selettivo SC sono state sospese in 25 µl di acqua milliQ e bollite a 95°C per 6 minuti. A freddo sono stati aggiunti i vari componenti (1,2 unità di Taq), fino ad arrivare ad un volume di 50 µl. Per l’amplificazione sono state utilizzate le seguenti condizioni:
- 94°C per 3’
- 30 cicli:
- 94°C per 30’’
- 50°C per 40’’
- 72°C per 2’’
- 72°C per 6’
Le PCR da colonia di lievito su DNA genomico sono state condotte utilizzando la “Platinum® Taq DNA polymerase” (Invitrogen), utilizzando 1 unità di polimerasi in 50 µl. Cellule di lievito da testare cresciuto in terreno SC o YPD sono state risospeso in 10 µl di acqua. 3 µl sono stati addizionati a 42 µl di mix di reazione contenente tutto tranne la polimerasi. La mix è stata bollita a 95°C per 15 minuti. Successivamente sono stati aggiunti 5 µl di acqua addizionati di polimerasi a freddo. La miscela è stata sottoposta al seguente programma di PCR:
- 95°C per 2’
- 35 cicli:
- 94°C per 30’’
- 50-52°C per 1’
- 72°C per 2’-5’
- 72°C per 7’
3.5.6 Primer
I primer utilizzati per la distruzione di MIP1, la mutagenesi sito-specifica di MIP1 e le PCR analitiche sono riportati negli allegati 1, 2 e 3. Per l’amplificazione dei geni REV7, REV3, CCE1, MHR1, MSH1 e CDC9 sono stati utilizzati gli oligonucleotidi riportati nella seguente tabella:
Gene Primer REV7 REV7-Fw gcgccgtcgacgatgaatgggaaaagaagtgc
REV7-Rv gcgcgggtacccatggaaccagacagaagacc REV3 REV3-Fw gcgcgggtaccggatccaagaatccctgtgg
REV3-Rv gcgccgaattccttagaggatacgaagattcc CCE1 CCE1-Fw cgccgggatccgtgttaaagcatgctgaagatgg
CCE1-Rv gcccggagctcctgcaaacttaacgttgacc MHR1 MHR1-Fw cgggcggatccgaaattgggttagcgttacagg
MHR1-Rv cgggggaattcgcagttgcattcgatgttacg MSH1 MSH1-Fw ggccggcatgcgtggagcacctaattgtaaagg
MSH1-Rv cccgcggatcccactcatggacgaaagatgc CDC9 CDC9-FW cgggcgtcgacccctttcaccaaattcttcg CDC9-RV cggcgggtaccgtaaggtagacagagaaacg