Costruzione di un ceppo ∆ mip1 e clonaggio del gene MIP1

Al fine di poter introdurre e studiare l’effetto di mutazioni equivalenti a mutazioni patologiche umane nel gene MIP1 di Saccharomyces cerevisiae, è stato necessario costruire un ceppo di lievito recante l’allele mip1 nullo. D’altra parte, come sottolineato nell’introduzione, un ceppo deleto in MIP1 è rho⁰, dunque privo di DNA mitocondriale. Un ceppo rho⁰ sarebbe inutile ai fini del lavoro, in quanto la DNA polimerasi mitocondriale, mutata o meno, non avrebbe substrato su cui agire. Come conseguenza, non sarebbe possibile studiare l’effetto delle varie mutazioni sul processo di replicazione dell’mtDNA. La costruzione di un ceppo deleto in MIP1, ma rho⁺, ha reso necessario la costruzione di un diploide eterozigote al locus MIP1 (MIP1/∆mip1) così da preservare il mantenimento del DNA mitocondriale.

Come sottolineato nell’introduzione, uno dei vari vantaggi offerti da S. cerevisiae consiste nell’aver a disposizione una collezione di deletanti, una collezione di ceppi in cui tutti i geni non vitali di S. cerevisiae sono stati deleti singolarmente (collezione EUROSCARF). La collezione EUROSCARF è stata costruita utilizzando i ceppi aploidi BY4741 e BY4742 e il ceppo diploide BY4743, che presentano lo svantaggio di avere un traspostone Ty1 nel gene HAP1 (Gaisne et al., 1999). Il gene HAP1 codifica per un fattore di trascrizione eme-dipendente che attiva la trascrizione di numerosi geni coinvolti nel metabolismo di tipo ossidativo, fra cui il citocromo c (Zitomer and Lowry, 1992). I mutanti hap1 presentano pertanto alterazioni del metabolismo ossidativo, fra cui una riduzione di circa due volte del citocromo c, che rappresentano una situazione assolutamente svantaggiosa per lo studio di fenotipi/genotipi legati alla funzionalità mitocondriale (Gaisne et al., 1999). Sulla base di questi dati, è stato deciso di non utilizzare il background BY47 per lo studio degli effetti di mutazioni in MIP1, ma il background W303 (Thomas and Rothstein, 1989). Il ceppo diploide W303 e la progenie aploide W303-1B e W303-1A, fra loro isogenici, presentano un’efficiente competenza respiratoria.

4.1.1 Costruzione del ceppo W303-1B

∆

Il gene MIP1 è stato distrutto nel ceppo aploide W303-1B, mediante la tecnica “gene disruption”, che consiste nell’interruzione della ORF del gene mediante l’inserzione del marcatore di selezione Kan^R che conferisce resistenza alla geneticina (vedi Materiali e metodi).

La selezione dei potenziali distrutti è avvenuta su terreno addizionato di geneticina 200 µg/ml.

I 16 cloni crescenti sono stati replicati su terreno addizionato di glicerolo 2% come unica fonte di carbonio. Sei dei 16 cloni sono risultati incapaci di crescere su glicerolo, ed erano dunque probabili deleti in MIP1. Come conferma sono state eseguite due reazioni di PCR da colonia, ciascuna delle quali è stata condotta utilizzando un primer interno al costrutto usato per l’integrazione e un primer esterno al costrutto. Solo se il costrutto si era integrato al locus MIP1 si sarebbe ottenuto un amplificato (figura 4.1). Tutti e sei i cloni analizzati presentavano il corretto pattern di bande.

Figura 4. 1: (A) Schema dell’amplificazione mediante i primer MIPF e K2 (amplificato 1), o MIPE e K3 (amplificato 2); (B) Amplificati di due cloni deleti in MIP1: amplificato 1 (lane 1 e 3) e amplificato 2 (lane 2 e 4).

Come ulteriore conferma sul clone 1 è stato condotta un’analisi Southern, digerendo il DNA genomico estratto da questo ceppo e da W303-1B con l’enzima di restrizione HindIII. La digestione con questo enzima produce una banda di circa 14400 bp sul DNA non distrutto, mentre se la distruzione è avvenuta correttamente al locus la banda attesa è di circa 1200 bp (figura 4.2 A). Come sonda è stato utilizzato un frammento di circa 800 bp a monte della ORF MIP1, in grado di ibridare il DNA indipendentemente dall’avvenuta distruzione. Il clone 1 mostrava la banda attesa di 1200 bp (figura 4.2 B) ed è stato rinominato OF1.

Figura 4. 2: (A) Schema del Southern blot sul DNA di 1B e OF1; (B) Southern blot sui ceppi W303-1B e OF1.

4.1.2 Costruzione e analisi fenotipica del diploide MIP1/

∆

Il ceppo diploide MIP1/∆mip1 è stato ottenuto mediante incrocio del ceppo OF1 con il ceppo W303-1A. Il diploide ottenuto è stato chiamato DWM. In contemporanea è stato anche ottenuto il ceppo isogenico non deleto mediante incrocio di W303-1B e W303-1A, chiamato DWW.

Sui ceppi DWW (MIP1/MIP1) e DWM (MIP1/∆mip1) è stata condotta un’analisi fenotipica per valutare la funzionalità mitocondriale. In particolare, sono stati determinati gli spettri di assorbimento dei citocromi respiratori (figura 4.3) e l’attività respiratoria (tabella 4.1), una misura diretta della capacità delle cellule di respirare.

Figura 4. 3: Spettri dei citocromi respiratori dei ceppi DWW e DWM dopo crescita in terreno YP addizionato di glucosio 0,5% dopo esaurimento di quest’ultimo. Il picco a 602 nm rappresenta i citocromi aa3, facenti parte della citocromo c ossidasi, il picco 560 rappresenta il citocromo b e il picco a 550 nm rappresenta il citocromo c.

Ceppo Attività respiratoria (µl/h/mg)

DWW 28,8

DWM 29,0

Tabella 4. 1 Attività respiratoria dei ceppi DWW e DWM. L’attività è espressa per microlitro di ossigeno consumato per ora per milligrammo di peso secco di cellule. I valori sono le medie di due esperimenti indipendenti.

Come mostrato, i due ceppi non presentano differenze per quanto riguarda la struttura e la funzione respiratoria.

La polimerasi γ è presente in quantità limitante nel mitocondrio in quanto è stato osservato che la corretta replicazione del mtDNA dipende dal dosaggio genico di MIP1. E’ stato infatti rilevato un accumulo di circa il 45% di mutanti petite in un ceppo diploide MIP1/∆mip1 cresciuto a 37°C (Lecrenier and Foury, 1995). Per stabilire se anche a 28°C la corretta replicazione del mtDNA dipendesse dal gene dosage, è stata determinata la frequenza di petite dopo quindici generazioni in terreno YPD a questa temperatura. Mentre il ceppo DWW presenta una frequenza pari allo 0,5%, il ceppo DWM presenta una frequenza pari all’1.6%, indicativa di una maggiore instabilità del DNA mitocondriale e pertanto di una dipendenza dal dosaggio genico.

4.1.3 Clonaggio del gene MIP1

Per introdurre le mutazioni equivalenti alle mutazioni patologiche in MIP1, nonché per ottenere un ceppo aploide deleto in MIP1 ma rho⁺, è stato necessario clonare il gene MIP1. Il gene è stato clonato nel plasmide centromerico di S. cerevisiae pFL38, che ha come marcatore

il gene URA3. Il clonaggio è stato condotto amplificando una regione di 5110 bp comprendente la regione codificante di MIP1 più la regione a monte e inserendo il frammento entro i siti SacI-SalI di pFL38.

4.1.4 Isolamento del ceppo aploide

∆

Per ottenere un ceppo aploide deleto in MIP1 e rho⁺ è stato dapprima necessario trasformare il ceppo diploide DWM con pFL38MIP1, ottenendo così il ceppo DWM/pFL38MIP1. Dopo sporificazione e dissezione di 10 tetradi, la tetrade 5 era costituita da tre spore vitali, di cui una sicuramente con il genotipo desiderato. Sui tre aploidi sono state condotte due PCR da colonia utilizzando i primer MIPF e K2 oppure MIPE e K3 (figura 4.4).

Figura 4. 4: Profilo elettroforetica dei prodotti di amplificazione con i primer MIPE e K3 (lane 1, 3, 5, 7) e MIPF e K2 (lane 2, 4, 6, 8) delle spore DWM-5A (lane 1, 2), DWM-5B (lane 3, 4) e DWM-5C (lane 5, 6) e del diploide DWM (lane 7, 8). Tutti i ceppi contenevano il plasmide pFL38/MIP1.

Come mostrato, uno dei ceppi, DWM-5A/pFL38MIP1, mostrava il pattern di bande atteso, uguale a quello del diploide parentale DWM. Come ulteriore controllo, è stato osservato che, dopo perdita plasmidica, i singoli cloni del ceppo DWM-5A erano respiratorio deficienti, indicando che la presenza di MIP1 portato dal plasmide pFL38 è fondamentale per il mantenimento del DNA mitocondriale.