Geni REV3 e REV7

I geni REV3 e REV7 codificano rispettivamente per la subunità catalitica e la subunità accessoria della polimerasi zeta, una polimerasi ripartiva coinvolta nella sintesi translesione del DNA.

Come detto in precedenza, la sintesi translesione è fondamentale per la replicazione del DNA in presenza di una base danneggiata sul templato. Normalmente danni sul templato vengono riparati da opportuni meccanismi di replicazione quali la BER e la nucleotide excision repair.

Qualora il danno non venga riparato, è necessaria una sintesi translesione in corrispondenza del danno, per impedire che la polimerasi vanga rilasciata dalla forca replicativa e che la replicazione si arresti, cosa che porterebbe alla morte della cellula (Lawrence, 2004). In tal senso la sintesi translesione fa parte dei cosiddetti sistemi di tolleranza dell’errore, che si distinguono dai sistemi di riparazione in quanto non riparano il danno, ma permettono comunque che la replicazione possa procedere. In generale, alcuni danni sul templato, quali basi ossidate, basi alchilate, dimeri di timina e siti apurinici, bloccano la replicazione, in quanto le polimerasi replicative non sono in grado di incorporare un nucleotide opposto alla lesione e soprattutto di estendere il DNA a partire da un mismatch costituito da una lesione opposta ad un nucleotide (reviewed in Murakumo, 2002). La sintesi translesione è invece affidata ad opportune polimerasi riparative, che sono in grado di portare a termine la sintesi di DNA in presenza di un danno sul templato. Nel nucleo sono coinvolte diverse polimerasi nella sintesi translesione, fra cui Pol zeta, che è coinvolta nella sintesi translesione errore-prone, che è responsabile dell’incremento della mutabilità puntiforme spontanea e indotta.

Rev3 costituisce la subunità catalitica della polimerasi zeta, mentre Rev7 codifica per una subunità accessoria fondamentale per il mantenimento del complesso e che aumenta l’attività polimerasica di Rev3 di circa 200 volte (Morrison et al., 1989; Nelson et al., 1996a; Torpey et al., 1994; Nelson et al., 1996b). REV3 codifica per una DNA polimerasi che appartiene alla famiglia B delle polimerasi, a cui appartengono anche le polimerasi replicative eucariotiche.

Rispetto a queste ultime Rev3, come altre polimerasi riparative, manca di un dominio 3’-5’

esonucleasico. Inoltre essa è scarsamente processiva, in quanto il 50% della polimerasi zeta

(compresa Rev7) si stacca dal templato dopo l’incorporazione di 3 nucleotidi (Nelson et al., 1996a).

Nella sintesi translesione Pol zeta ha due ruoli. Un ruolo minore, l’attività di bypass, consiste nell’incorporazione di un nucleotide opposto ad una lesione, ruolo che è svolto principalmente da altre polimerasi riparative. In particolare Pol zeta può incorporare nucleotidi, sebbene a bassa efficienza, opposti ad un dimero TT cis-syn ciclobutano e ad un dimero di timina (6-4) derivante dal trattamento con UV (reviewed in Prakash et al., 2005; Johnson et al.,2000b;

Guo et al., 2001). Essa non è in grado invece di inserire nucleotidi in opposizione ad un sito apurinico e a 8-oxo-dG (Haracska et al., 2001). Come detto, la polimerasi zeta svolge soltanto un ruolo minore nell’attività di bypass, in cui giocano un ruolo più importanti altre polimerasi replicative, quali la DNA polimerasi eta e Rev1p (reviewed in Prakash et al., 2005; Gibbs et al., 2005). Ad esempio, la polimerasi eta gioca un ruolo fondamentale nel bypass del dimero TT cis-syn ciclobutano, Pol32, una subunità della polimerasi delta, nel bypass del fotoaddotto (6-4), e Pol32, o Rev1, sono coinvolti nel bypass di un sito apurinico (Gibbs et al., 2005).

Il maggior ruolo di Pol zeta consiste invece nell’estensione di mispair. Dopo l’incorporazione opposta ad una base danneggiata di un nucleotide ad opera delle polimerasi sopra riportate, è necessario che una polimerasi replicativa estenda il mispair costituito da un nucleotide opposto alla lesione. Le polimerasi replicative non sono grado di svolgere questo compito, a causa della struttura distorta del templato. Fra le polimerasi riparative, soltanto Pol zeta è in grado di catalizzare questa reazione. Grazie a Pol zeta, ciascuna copia nucleotide-lesione di cui detto prima, viene estesa efficacemente da Pol zeta (Nelson et al., 1996a; Johnson et al., 2000b; Haracska et al., 2001; Guo et al., 2001). Da questo emerge che la translesione, necessita, in generale, di due polimerasi riparative, uno per il bypass della lesione e una per l’estensione del mispair. In secondo luogo, la replicazione di Pol zeta è error prone. Essa infatti, qualora incorpori un nucleotide opposto alla lesione, incorpora spesso un nucleotide sbagliato. Allo stesso modo, a causa della distorsione del templato, spesso inserisce basi non corrette a partire da un’estremità mispair. L’effetto determina un aumento della frequenza di sostituzioni puntiformi o di frameshift (reviewed in Lawrence and Maher, 2001). A questo va aggiunta l’osservazione che la polimerasi zeta è in grado di estendere anche mispair costituiti da due nucleotidi non complementari, con una frequenza da 2 alle 1000 volte superiore, a seconda del tipo di mismatch, rispetto all’estensione portata avanti dalla polimerasi alfa (Lawrence et al., 2000). La capacità di estendere mismatch, dovuta anche al fatto Pol zeta non possiede un dominio esonucleasico, incrementa ulteriormente la frequenza di errori associati all’attività di Pol zeta stessa.

L’attività di Pol zeta necessita dell’attività di Rev1, identificata inizialmente come un deossicitidil trasferasi. La proteina è in grado di incorporare sul DNA in crescita uno o pochi residui di citidina. Esso tende ad incorporare preferenzialmente in vitro un residuo dC opposto ad un sito apurinico (circa 60%) rispetto ad un dG (20%), a un dA o un dU (10%) e a un dT o un dC (1%) (Nelson et al., 1996b). In tal senso Rev1 gioca direttamente un ruolo fondamentale nella sintesi translesione di un sito apurinico, ovviamente in maniera error prone, in quanto incorpora sempre in opposizione al sito apurinico un residuo dC. Studi più

recenti hanno dimostrato che Rev1 svolge una seconda funzione, indipendente dalla prima, e che consiste nell’interazione con la subunità Rev7 di Pol zeta responsabile del mantenimento del complesso Rev3-Rev7 (Nelson et al., 2000; Acharya et al., 2005; D’Souza and Walker, 2006; Acharya et al., 2006). Questa seconda funzione è indipendente dalla prima, in quanto mutazioni che inibiscono l’attività trasferasica permettono a Rev1 di partecipare comunque alla sintesi translesione (Haracska et al., 2001). L’interazione coinvolge il dominio PAD (dominio associato alla polimerasi di Rev1) e, probabilmente, anche la regione C-terminale di Rev1 (Acharya et al., 2005; D’Souza and Walker, 2006). L’interazione non è fondamentale solo per il mantenimento, ma la presenza di Rev1 rende Pol zeta più efficiente, sia nel processo di bypass di lesioni sia nel processo di estensione di mispair (Acharya et al., 2006).

Per quanto concerne i fenotipi, mutazioni o delezione di REV3 e di REV7, nonché di REV1, rendono il ceppo maggiormente sensibile al trattamento con UV e con agenti chimici che danneggiano il DNA, riducendo il numero di cellule sopravvissute al trattamento, conferendo d’altra parte un fenotipo reversionless, cioè in cui non si osservava reversione di specifiche mutazioni (Lawrence et al., 1985; Lemontt, 1971). Infatti delezioni in questi geni, se da una parte aumentato la sensibilità a sostanze che danneggiano il DNA, dall’altra riducono notevolmente la frequenza di mutazioni del DNA, in quanto la sintesi translesione di Pol zeta e Rev1 è error prone. Diversi studi hanno dimostrato che l’attività di Pol zeta è responsabile del 98% delle mutazioni per sostituzione e del 95% delle mutazioni di frameshift indotte dal trattamento con UV, mentre l’attività di Rev1 è responsabile del 95% delle mutazioni per sostituzione sempre in seguito a trattamento con UV (reviewed in Lawrence and Maher, 2001). Pol zeta è anche responsabile del 50%-75% della mutabilità spontanea, non indotta da agenti esterni (Quah et al., 1980).

Recentemente è stato dimostrato che Pol zeta, e Rev1, sono presenti e funzionano nel mitocondrio di S. cerevisiae (Zhang et al., 2006; Kalifa and Sia, 2007). Zhang et al. hanno dimostrato, mediante fusione dell’estremità N-terminale di Rev3, Rev7 e Rev1 con la proteina GFP, che le proteine localizzano nei mitocondri. Hanno inoltre dimostrato che la delezione di REV3 e di REV7 riduce notevolmente la frequenza reversioni per frameshift di un nucleotide nell’mtDNA, di circa 30-40 volte in assenza di trattamenti mutageni e di 5-6 volte in seguito a trattamento con UV. Inoltre queste frequenze non sono alterate dall’introduzione di mutazioni in MIP1, indicando che Pol γ e Pol zeta appartengono allo stesso gruppo epistatico e suggerendo che fra le due proteine, e fra le proteine e Rev1, vi siano complesse interazioni.

Kalifa and Sia, 2007 hanno dimostrato per la prima volta che la polimerasi zeta e Rev1 contribuiscono alla comparsa di mutanti petite in seguito a trattamento con UV. Il ceppo

∆rev1 mostra una riduzione della frequenza di petite di 5 volte rispetto al wt in seguito a trattamento con UV, mentre i ceppi deleti in REV3 o in REV7 mostrano una riduzione di circa 60 volte rispetto al wt. In assenza di trattamento con raggi UV, però, le frequenze sono simili.

Inoltre è stato dimostrato che la delezione di uno dei tre geni incrementa la frequenza di mutazioni puntiformi per sostituzione dell’mtDNA, come dimostrato da un aumento della frequenza di mutanti Ery^R, sia in presenza che in assenza del trattamento con UV. Questi risultati sono opposti a quelli osservati nel nucleo, e suggeriscono che Pol zeta e Rev1 siano

coinvolti nella riparazione dei danni indotti da UV, ma in maniera error free. D’altra parte pone in evidenza che nei mitocondri deve esserci un sistema di riparazione error prone che, in assenza di Pol zeta e Rev1, incrementa la frequenza di mutazioni puntiformi in seguito a trattamento UV. Questo sistema di riparazione error prone potrebbe essere costituito da Mip1 stesso.

Pol zeta è presente e conservata nella maggior parte degli eucarioti, e in tutti i mammiferi. In particolare sono state identificate nell’uomo le proteine omologhe Rev3 e Rev7 (Morelli et al., 1998; Lin et al., 1999; Gibbs et al., 2000; Murakumo et al., 2000; Murakumo et al., 2001). Come nel lievito, la polimerasi zeta umana, insieme a Rev1, è coinvolta nella sintesi translesione error prone. Anche in questo caso Rev1 è fondamentale per il mantenimento del complesso Rev3-Rev7 e per la funzionalità della polimerasi. Al contrario della polimerasi zeta umana di lievito, Pol zeta umana sembra non localizzare nel nucleo, sebbene la dimostrazione non si possa considerare definitiva (Zhang et al., 2006).