Replicazione del DNA mitocondriale

La DNA polimerasi γ svolge un ruolo fondamentale nella replicazione del DNA mitocondriale. D’altra parte la replicazione del DNA mitocondriale, così come la replicazione di qualsiasi tipo di DNA, richiede la partecipazione di diversi enzimi o proteine strutturali.

Inoltre l’inizio della replicazione necessita sia di specifici elementi di sequenza presenti sull’mtDNA sia di opportune proteine che permettano alla DNA polimerasi γ di accedere al templato. Di seguito verrà descritto brevemente il processo di replicazione dell’mtDNA nell’uomo e nel lievito.

Replicazione dell’mtDNA nell’uomo. La caratteristica peculiare della replicazione dell’mtDNA di mammiferi consiste nel fatto che essa è continua e asimmetrica, sia nello spazio che nel tempo. Questo significa in primo luogo che ogni singolo filamento è sintetizzato in maniera continua, senza la presenza di frammenti di Okazaki, al contrario della replicazione del DNA nucleare, che è semidiscontinua, in cui, in ogni forca replicativa, un filamento è sintetizzato in maniera continua (leading strand) mentre l’altro è sintetizzato in maniera discontinua (lagging strand). In secondo luogo, la sintesi dei due filamenti inizia a partire da origini diverse (asimmetria spaziale) e in tempi diversi (asimmetria temporale).

I meccanismi della replicazione del DNA mitocondriale di mammifero sono conosciuti, sebbene recenti osservazioni di cui verrà detto successivamente suggeriscono che la replicazione possa procedere anche in modo diverso. Il DNA mitocondriale di mammiferi contiene due regioni che fungono da siti di inizio di trascrizione chiamati HSP (heavy strand promoter) e LSP (light strand promoter), tra i quali è situata una regione non codificante. Da ciascun promotore viene sintetizzato un filamento di RNA che funge da primer per la sintesi del filamento L e H, rispettivamente.

Le caratteristiche della replicazione sono riportate in figura 1.13.

Figura 1. 13: Rappresentazione schematica della replicazione dell’mtDNA umano. La linee circolari sottili rappresentano il filamento L, la linee circolari spesse il filamento pesante. Le linee tratteggiate indicano il primer di RNA processato. Le frecce bianche indicano la direzione della replicazione. Le frecce nere rappresentano la direzione della trascrizione a partire da HSP e LSP; (A) Inizio della sintesi del filamento H; (B) Inizio della replicazione del filamento L e continuazione della sintesi del filamento H. (da Lecrenier and Foury, 2000).

Dapprima viene sintetizzato un nuovo filamento H. Dall’LSP, usando come templato il filamento L, viene sintetizzato un primer di RNA che, in corrispondenza di OH, l’origine di replicazione del filamento H, viene opportunamente processato. L’RNA processato funge da primer per la polimerasi γ che sintetizza un nuovo filamento H usando come templato il filamento L parentale. Man mano che la sintesi procede, il filamento H parentale emerge come regione a singolo filamento, nella regione chiamata D-loop o ansa di dislocazione.

Quando la sintesi del nuovo filamento H, e dunque la dislocazione del filamento H parentale, giunge in corrispondenza di OL, inizia la sintesi del nuovo filamento L. OL consiste di un’origine di replicazione di circa 30 bp situata in una regione contenente numerosi geni per tRNA. Come per la sintesi del filamento H da OH, la sintesi del filamento L richiede la presenza di un primer di RNA. La sintesi del filamento H finisce quando la polimerasi giunge in corrispondenza di OH, mentre la sintesi del filamento L finisce successivamente quando la polimerasi giunge in corrispondenza di O_L (reviewed in Lecrenier and Foury, 2000).

Nel processo di replicazione, oltre alla polimerasi γ, sono coinvolte numerose proteine:

- la RNA polimerasi mitocondriale, codificata dal gene h-mtRPOL (Tiranti et al., 1997), sintetizza l’RNA che fungerà da primer in corrispondenza di LSP.

- il fattore di trascrizione mtTFA, codificato dal gene h-mtTFA, è fondamentale affinché la RNA polimerasi mitocondriale inizi la trascrizione ad alta efficienza.

Infatti mtTFA promuove l’inizio della trascrizione legandosi, piegando e svolgendo il DNA e reclutando altri fattori di replicazione in corrispondenza del D-loop (Fisher et al., 1992; Ghivizzani et al., 1994). L’importanza del fattore mtTFA nel mantenimento dell’mtDNA è dimostrata dal fatto che topi knock out eterozigoti mostrano una riduzione del numero di copie di mtDNA (Larsson et al., 1998).

- i fattori di specificità TFB1M e TFB2M sono coinvolti anch’essi nella replicazione e interagiscono con mtTFA e la RNA polimerasi (Falkenberg et al., 2002; McCulloch et al., 2002).

- endo G è una RNasi che localizza nel mitocondrio dei mammiferi ed è in grado di degradare l’RNA in un duplex RNA:DNA. L’enzima è necessario per il rimaneggiamento dell’RNA in corrispondenza delle origini di replicazione(Prats et al., 1997).

- l’RNasi MRP taglia anch’esso l’RNA in un duplex RNA:DNA. Nonostante l’RNasi MRP localizzi principalmente nel nucleo, essa è presente anche nel mitocondrio (Li et al., 1994).

- mentre l’RNA che funge da innesco per la sintesi del filamento H viene sintetizzato a partire da LSP dalla RNA polimerasi, l’RNA necessario per la sintesi del filamento L necessita di una primasi, necessaria per la sintesi di RNA in corrispondenza di O_L. Il gene codificante la primasi non è ancora stato identificato, ma nel 1985 è stata identificata una primasi putativa mitocondriale con un componente di RNA (Wong and Clayton, 1985a; Wong and Clayton, 1985b).

- la proteina legante il DNA a singolo filamento mitocondriale (mtSSB) è una proteina che, legando il DNA a singolo filamento ad alta affinità, promuove la destabilizzazione dell’elica necessaria per il successivo svolgimento ad opera delle elicasi. In vivo, la mtSSB agisce come tetrametro, ciascuno dei quali è in grado di legare una regione di 8-17 nucleotidi (Yang et al., 1997; Thömmes et al., 1995).

- la 5’-3’ elicasi Twinkle, codificata dal gene C10ORF2 o TWINKLE, è responsabile dello svolgimento nella direzione 5’-3’ del DNA, necessario per la sintesi dell’mtDNA. Twinkle condivide un’elevata similarità di sequenza con la regione C-teminale dell’elicasi-primasi del fago T7. Come l’elicasi-primasi del fago T7, Twinkle possiede cinque motivi di sequenza delle elicasi, ma è assente un dominio primasico.

Twinkle è fondamentale non solo per il mantenimento dell’mtDNA, ma anche per la regolazione del numero di copie di mtDNA, in quanto topi overesprimenti Twinkle mostrano un aumento del numero di copie di circa tre volte, mentre cellule in cui l’espressione di Twinkle viene ridotta mostrano una forte riduzione del numero di copie di mtDNA (Tyynismaa et al., 2004).

- le topoisomerasi I e IIIα sono coinvolte nel rilassamento del DNA durante la replicazione. In particolare la topoisomerasi mitocondriale I rilassa i supercoil negativi e rimuove i supercoil positivi generati dall’attività elicasica (Zhang et al., 2001).

- la ligasi III, codificata dal gene LIGIII, è fondamentale nel processo di replicazione, in quanto ha il compito di legare l’estremità 3’ del filamento neosintetizzato con l’estremità 5’.Cellule umane in coltura con una ridotta espressione di ligasi mostrano una riduzione del contenuto di mtDNA (Lakshmipathy and Campbell, 2001).

Come detto in precedenza, recenti osservazioni hanno portato ad ipotizzare altri meccanismi di replicazione (Holt et al., 2002; Yang et al., 2002; Bowmaker et al., 2003). In questi esperimenti venivano identificati due tipi di intermedi di replicazione. Il primo tipo era

resistente al taglio con nucleasi che tagliano DNA a singolo filamento e aveva mobilità su gel tipico di intermedi contenenti un leading e un lagging strand. Questi intermedi sono incompatibili con la teoria “discontinua e asimmetrica” e prevedono un modello simile a quello della replicazione nucleare, cioè semidiscontinuo e simmetrico. Secondo questo modello, esistono diverse origini di replicazione situate in una regione di circa 4 Kb situata a valle del D-loop (Yasukawa et al., 2005).

Replicazione dell’mtDNA in S. cerevisiae. La replicazione dell’mtDNA di S. cerevisiae, non ancora del tutto compresa, è semidiscontinua e simmetrica, con la contemporanea sintesi, in corrispondenza della forca replicativa, di un leading strand e di un lagging strand. La piena comprensione dei meccanismi di replicazione è resa difficile dal fatto che diversi ceppi di S.

cerevisiae presentano mtDNA di diversa lunghezza, con un numero di origini di replicazione variabili. Inoltre sono state identificate in cellule in divisione sia molecole circolari di mtDNA sia molecole lineari, che spesso formano concatenameri (Bendich, 1996; Nosek and Tomaska, 2003).

Sulla base del tipo di ceppo, il genoma mitocondriale di S. cerevisiae contiene sette-otto origini di replicazione, di cui solo quattro sono funzionali in quanto contengono un sito di inizio di trascrizione necessario per la sintesi dell’RNA che funge da innesco per la sintesi di DNA e sono chiamate ori1, ori2, ori3 e ori5 (Baldacci et al., 1984). Le origini di replicazione sono inoltre bidirezionali. Nello specifico le quattro origini di replicazione funzionali sono lunghe 300 bp e sono costituite da tre cluster GC ripetuti, chiamati C, B e A e separati da sequenze ricche in AT. Il cluster C è sempre preceduto nelle origini funzionali da un sito di inizio trascrizione chiamato r (Foury et al., 1998).

Lo schema della replicazione a partire da un’origine di replicazione e i dettagli della replicazione sono riportati in figura 1.14.

Figura 1. 14: Rappresentazione schematica della replicazione dell’mtDNA di S. cerevisiae. Le linee continue rappresentano filamenti di DNA, le linee tratteggiate filamenti di RNA. La regione compresa fra il sito r e il cluster A rappresenta l’origine di replicazione. Le frecce bianche rappresentano la direzione in cui la DNA polimerasi sintetizza nuovo DNA; (A) La RNA polimerasi Rpo41 sintetizza un filamento di RNA usando come templato lo strand r a partire dal sito di trascrizione r. Il DNA a singolo filamento viene legata dalla proteina legante il DNA a singolo filamento Rim1; (B) L’RNasi H processa l’RNA sintetizzato da Rpo41 in corrispondenza del cluster C. Una primasi sintetizza un RNA usando come templato lo strand non-r; (C) La DNA polimerasi usa gli inneschi di RNA per sintetizzare il DNA; la sintesi è bidirezionale.

(da Lecrenier and Foury, 2000).

Per quanto concerne le proteine coinvolte nel processo di replicazione, diverse proteine sono omologhe alle proteine umane riportate in precedenza. Come l’inizio della trascrizione a partire da OH nell’uomo richiede la presenza della RNA polimerasi e di fattori di trascrizione, così nel lievito l’inizio della trascrizione, necessaria per la sintesi dell’innesco di RNA, richiede la presenza della RNA polimerasi mitocondriale Rpo41, ortologo funzionale di h-mtRPOL, e del fattore ti trascrizione Abf2. Abf2 è una proteina che condivide il 21% di identità di sequenza con h-mtTFA ed è in grado di legare, piegare e introdurre superavvolgimenti negativi nel DNA (Fisher et al., 1992). Sebbene le due proteine siano omologhe, diversi studi hanno dimostrato che Abf2 ha un ruolo limitato nell’inizio della trascrizione, e che serva piuttosto per la stabilità dell’mtDNA, per il mantenimento del numero di copie, e per la trasmissione delle molecole alla progenie (MacAlpine et al., 1998;

Zelenaya-Troitskaya et al., 1998). Nell’inizio della trascrizione è inoltre coinvolto il fattore di specificità mtTFB, necessario per il legame della RNA polimerasi al promotore e dunque per

la specificità di inizio (Schinkel et al., 1987; Xu and Clayton, 1992). Inoltre, le molecole rho -non necessitano della presenza di Rpo41 per essere replicati, tanto che ceppi rho^-, anche ipersoppressivi, deleti in RPO41 mantengono l’mtDNA (Fangman et al., 1990; Lorimer et al., 1995). E’ probabile che i ceppi rho^- replichino il loro mtDNA in maniera RNA polimerasi indipendente, ad esempio mediante l’uso di una primasi, come per il filamento non-r, o mediante processi di ricombinazione.

Come la sintesi a partire dall’origine OL necessita di una primasi per la sintesi dell’innesco di RNA, la sintesi del filamento non-r in lievito richiede anch’essa la presenza di una primasi che non è stata ancora clonata (Baldacci et al., 1984). Inoltre, come nell’uomo, l’RNA sintetizzato dalla RNA polimerasi o dalla primasi deve essere processato. Nel lievito l’RNA viene processato dalla RNasi MRP, contenente una componente di RNA (Stohl and Clayton 1992; Lee and Clayton, 1998).

Il DNA a singolo filamento che si forma in corrispondenza della forca di replicazione viene legato, come nell’uomo, da una proteina SSB, codificata, in lievito, dal gene RIM1 (Van Dick et al., 1992). Come l’ortologo umano, Rim1p agisce come tetrametro.

Come nella replicazione dell’mtDNA umano sono coinvolte topoisomerasi, elicasi e una ligasi. Per quanto concerne le elicasi, l’elicasi Pif1 sembra essere coinvolta nei processi di ricombinazione, mentre l’elicasi Hmi1 è direttamente coinvolta nella replicazione (Sedman et al., 2000). La ligasi Cdc9, che verrà descritta nel dettaglio successivamente, svolge un ruolo fondamentale nel processo di replicazione, in quanto ha il compito di ligare i frammenti di Okazaki sul lagging strand.

In conclusione è chiaro che i sistemi di replicazione dell’mtDNA nell’uomo e in S. cerevisiae, pur presentando elementi di diversità, mostrano numerose similitudini, in particolare la richiesta di specifiche proteine, la maggior parte delle quali sono omologhe fra lievito e uomo.