Discussione

Nel presente studio sono state introdotte in MIP1 cinque mutazioni equivalenti a mutazioni patologiche presenti in POLG. Tutte le mutazioni studiate riducono la crescita, almeno a 36°C, su fonti ossidabili, e incrementano la frequenza dei petite, la frequenza dei rho⁰ e la frequenza dei mutanti Ery^R, sebbene a diversi livelli.

La mutazione G651S corrisponde alla mutazione umana G848S. Questa mutazione è stata osservata in casi molto gravi di Alpers, in trans con le mutazioni A467T o con la doppia mutazione W748S-E1143G. Dal nostro studio emerge chiaramente che la polimerasi Mip1^G651S non è in grado di replicare correttamente il DNA mitocondriale, in quanto tutte le colonie sono petite, e tutte rho⁰. L’incapacità di replicare l’mtDNA non sorprende, in quanto la presenza della mutazione G651S riduce notevolmente sia i livelli proteici solubili mitocondriali sia l’attività polimerasica. Il fenotipo osservato correla dunque col fenotipo patologico osservato nei pazienti. In particolare è noto che le mutazioni A467T e W748S riducono notevolmente l’attività catalitica (Chan et al., 2005; Chan et al., 2006). Il fenotipo così grave osservato nei pazienti sembra pertanto dovuto alla presenza di due polimerasi mutate con attività fortemente ridotta. La mutazione G651S risulta inoltre recessiva, e in particolare l’allele mip1^G651S si comporta come allele nullo. Questi risultati sono in accordo con l’osservazione che la mutazione G848S è recessiva nell’uomo.

La mutazione A692T corrisponde alla mutazione umana A889T. La mutazione A889T è stata osservata in casi di PEO, in trans con la mutazione R579W o in cis con lo SNP E1143G. Nel primo caso, la mutazione sembra essere recessiva, poiché un genitore del paziente, portatore obbligato della mutazione, era sano. Nel secondo caso, la mutazione sembra essere dominante, perché l’altro allele non presenta mutazioni. In questo caso sono possibili due spiegazioni. E’ possibile che la mutazione A889T sia dominante in sé, oppure che lo SNP E1143G la renda dominante. La mutazione A692T in MIP1 riduce fortemente la stabilità dell’mtDNA, in quanto si osserva un incremento della frequenza dei petite (circa 80% a 28°C) e dei rho⁰ (circa 86% a 28°C). La riduzione della capacità di replicare l’mtDNA non è dovuta ad una riduzione dei livelli proteici solubili, del tutto simili a quelli della proteina wt, ma piuttosto alla riduzione di circa il 70% dell’attività polimerasica. All’aumento della mutabilità

estesa è associato anche un aumento della mutabilità puntiforme, di circa 4 volte. Per quanto concerne la dominanza, la mutazione risulta debolmente, ma significativamente in termini di incremento di petite, dominante. Questa osservazione suggerisce che la mutazione umana A889T sia anch’essa dominante, ma a causa dello scarso effetto dominante il fenotipo può essere variabile, da non patologico a patologico con tremori fino a patologico con PEO, come nei soggetti eterozigoti osservati.

La mutazione H734Y corrisponde alla mutazione umana H932Y, osservata in un’unica famiglia i cui soggetti affetti da PEO con atassia-neuropatia erano eterozigoti per le mutazioni H932Y e G1051R. I parenti dei due soggetti, omozigoti per l’una o per l’altra mutazione, avevano fenotipi complessi, da non patologici ad oligosintomatici con problemi psichiatrici o emicranie. In particolare tre soggetti su cinque portatori dell’allele recante la mutazione H932Y presentavano una patologia caratterizzata da emicranie frequenti. Al contrario, alcuni soggetti portatori dell’allele G1051R, non presentavano per lo più sintomi. Alcuni mostravano problemi psichiatrici, che tuttavia erano presenti anche in soggetti omozigoti wt, suggerendo che i problemi psichiatrici fossero dovuti, nella famiglia, ad altri fattori. La mutazione H734Y in MIP1 riduce fortemente la capacità della polimerasi di replicare l’mtDNA, poiché a 28°C quasi il 100% dei cloni sono petite e rho⁰. La ridotta capacità di mantenere l’mtDNA è dovuta sia ad una ridotta quantità dei livelli proteici, pari a circa il 10-20%, sia un una ridotta attività catalitica, pari al 30-40% rispetto alla polimerasi wt. La mutazione risulta inoltre parzialmente dominante e questa dominanza potrebbe spiegare le ragioni per cui tre soggetti eterozigoti per la mutazione H932Y non sono completamente sani, ma oligosintomatici. Il fenotipo osservato in lievito correla perfettamente con ciò che è stato osservato nell’uomo, e suggerisce fortemente che la mutazione H932Y sia dominante.

La mutazione G807R corrisponde alla mutazione umana G1051R, descritta precedentemente.

La mutazione G807R riduce la capacità della polimerasi di mantenere l’mtDNA in vivo, sebbene moderatamente, poiché a 28°C la frequenza di petite è pari a circa il 27%. I mutanti risultano inoltre termosensibili, poiché la frequenza dei petite e dei rho⁰ sale quasi al 100% a 36°C, suggerendo che la proteina presenti dei problemi di folding. I risultati sono confermati dalle analisi in vitro, che dimostrano come la ridotta capacità della polimerasi di replicare l’mtDNA sia dovuta alla forte riduzione dei livelli proteici solubili, pari a circa il 10% del wt.

L’attività catalitica, sebbene parzialmente ridotta, risulta simile a quella della polimerasi non mutata, indicando dunque che l’aumento dei petite è dovuto soprattutto alla riduzione dei livelli proteici. Alla mutazione è associato anche un forte incremento, di circa 10 volte, della frequenza di mutazioni puntiformi sull’mtDNA. Infine la mutazione risulta recessiva, poiché la mutabilità estesa dell’mtDNA è simile in un ceppo contenente una copia wt e una copia mutata rispetto al ceppo contenente due copie selvatiche.

La mutazione E900G corrisponde allo SNP E1143G. Apparentemente lo SNP E1143G non è neutrale, ma è in grado di comportarsi come modificatore fenotipico di mutazioni patologiche.

Oltre alle osservazioni nei pazienti che portano lo SNP, è stato recentemente dimostrato da studi in vitro che lo SNP E1143G si comporta come modificatore fenotipico della mutazione W748S (Chan et al., 2006). Per quanto concerne il nostro studio, abbiamo osservato che la presenza della mutazione aumenta di circa 2 volte la frequenza di petite rispetto al wt a 28°C, indicando che la mutazione per se non ha un effetto neutrale. Inoltre la frequenza di petite sale a 90% a 36°C, indicando che i mutanti sono termosensibili e suggerendo che la proteina presenti una riduzione dei livelli funzionali. Questa osservazione è stata confermata dall’analisi dei livelli proteici funzionali, che sono ridotti a circa il 30-40% rispetto al wt.

L’attività catalitica è invece simile rispetto a quella della polimerasi wt, indicando come l’incremento dei petite sia dovuto alla riduzione dei livelli proteici. Alla mutazione E900G è associato anche un blando ma significativo incremento della frequenza di mutazioni puntiformi. Infine la mutazione risulta recessiva.

Le mutazioni A889T e E1143G sono state osservate in cis in due casi di adPEO, come sottolineato in precedenza. In lievito, è stato osservato che la presenza della mutazione E900G incrementa la frequenza dei petite, dall’80% al 97%, indicando che la mutazione E900G si comporta come modificatore fenotipico di una mutazione patologica in cis. L’aumento della frequenza di mutanti petite non è dovuto alla riduzione dell’attività catalitica, che risulta simile per la polimerasi Mip1^A692T e per la polimerasi Mip1A692T-E900G

, ma alla riduzione dei livelli proteici solubili che, mentre sono normali per la proteina Mip1^A692T, sono ridotti a circa il 5% per la proteina Mip1A692T-E900G

. Gli effetti che si osservano nel ceppo recante l’allele mip1A692T-E900G

sembrano essere dovuti in parte alla riduzione dell’attività catalitica dovuta alla mutazione A692T in parte alla riduzione dei livelli proteici solubili dovuti sia alla mutazione A692T sia alla mutazione E900G. La presenza della mutazione E900G non incrementa invece la frequenza di mutazioni puntiformi dovute alla mutazione A692T. Infine la presenza della mutazione E900G non altera la dominanza della mutazione A692T, che risulta dominante già per se.

Per quanto concerne l’effetto di due mutazioni in trans, è stato osservato in primo luogo che la presenza della mutazione G651S non influenza la replicazione ad opera della proteina Mip1^E900G, in accordo con l’osservazione che mip1^G651S si comporta come allele nullo. Al contrario, la presenza della mutazione H734Y, che è dominante, influenza la replicazione della polimerasi Mip1^G807R. Mentre il ceppo recante solo l’allele mip1^G807R presenta una frequenza di petite di circa il 27°C, il ceppo recante gli alleli mip1^G807R e mip1^H734Y mostra una frequenza di petite pari a circa l’80%. In tal senso si può ipotizzare che il grave fenotipo osservato nei soggetti eterozigoti per le mutazioni H932Y e G1051R e caratterizzato da atassia-neuropatia con PEO non sia dovuto alla presenza di due polimerasi con scarsa attività, bensì al fatto che una polimerasi recante una mutazione dominante interferisca con la replicazione di una polimerasi mutata che, di per sé, ha un’attività poco inferiore a quella del wt.

E’ stato inoltre osservato, come negli esperimenti condotti sulle mutazioni G224A e Y757C, che non vi è correlazione fra incremento di delezioni o deplezione di mtDNA e incremento della frequenza di mutazioni puntiformi. In particolare:

1) la frequenza di mutanti petite e rho⁰ non è proporzionale alla frequenza di mutanti Ery^R per le varie mutazioni. Ad esempio la mutazione G807R produce relativamente pochi petite, ma determina un forte incremento dei mutanti Ery^R.

2) la mutazione E900G incrementa la frequenza di petite in associazione con la mutazione A692T, ma non la frequenza di mutazioni puntiformi.

3) le mutazioni A692T e H734Y sono dominanti per quanto concerne la mutabilità estesa, ma sono recessive per quanto concerne la mutabilità puntiforme.

Queste osservazioni confermano che le delezioni dell’mtDNA sembrano essere dovute a meccanismi diversi da quelli che producono mutazioni puntiformi, quali stallo della replicazione, ridotta attività polimerasica o, come dimostrato in questo studio, ridotti livelli proteici funzionali dovuti a problemi di folding.