3. MATERIALI E METODI
3.5 Analisi microbiologiche alimenti
Campionamento.
Per matrici che si presentano allo stato sfuso è importante che l’aliquota da prelevare sia rappresentativa del campione stesso:
- I campioni liquidi vanno mescolati prima del prelievo
- I campioni solidi di piccole dimensioni vanno prelevati in differenti punti dell’insieme - I campioni solidi di grosse dimensioni vanno prelevati utilizzando strumenti da taglio idonei che consentano di campionare in differenti punti dalla superficie alla profondità. Il prelievo va eseguito con attrezzature sterili e il campione va messo in un contenitore sterile.
I recipienti per la raccolta e conservazione del campione devono essere adeguati all’analisi da effettuare in maniera tale da non alterare le caratteristiche del campione stesso: in questo caso sono stati utilizzati sacchetti sterili in plastica.
La temperatura di trasporto del campione non deve superare quella di normale conservazione del prodotto.
Preparazione del campione
La preparazione dei campioni è effettuata in accordo con ISO 6887-1:2017. Per i campioni di latte e prodotti a base di latte si fa riferimento alla normativa ISO 6887- 5:2010.
Sospensione madre (prima diluizione): in un contenitore sterile o, in un sacchetto di plastica sterile, pesare una massa M espressa in grammi (minimo 10 gr) o misurare un volume V espresso in ml (minimo 10 ml) rappresentativo del campione di prova.
Aggiungere una quantità di diluente uguale a 9xM in grammi o 9xV in ml. In entrambi i casi l’incertezza di misura deve essere ±5%.
Ulteriore diluizione decimale: trasferire, con una pipetta sterile, 1ml di soluzione madre in una provetta contenente 9ml di diluente e mescolare accuratamente con il Vortex per almeno 10 secondi. E’ stata così ottenuta la diluizione 1:100.
Se necessario ripetere queste operazioni utilizzando la diluizione 10-2 e diluire
ulteriormente, utilizzando una nuova pipetta sterile per ogni diluizione, in modo da ottenere diluizioni di 10-3 ,10-4 ecc finché non viene raggiunto un numero di
microrganismi appropriato.
Ricerca di Salmonella
La Salmonella è l’agente batterico più comunemente isolato in caso di infezioni trasmesse da alimenti, sia sporadiche che epidemiche.
In questo caso è stata eseguita una ricerca qualitativa di Salmonella nei campioni: viene rilevata quindi la presenza o l’assenza del microrganismo in conformità alla normativa ISO 6579-1:2017.
Procedimento
La diluizione 1:10 viene posta in incubazione a 37°C per 24 ore, in presenza di Buffered Peptone Water come brodo di prearricchimento non selettivo.
Dopo 24 ore, si trasferisce 0,1ml della coltura ottenuta in una provetta contenente 10 ml di brodo di arricchimento selettivo RVS e 1ml in 10 ml di brodo MKTTn.
Incubare RVS a 41,5°C per 24 ±3 ore e MKTTn a 37°C a 24±3 ore.
Terminata l’incubazione si esegue la semina su XLD e BGA agar, prelevando il terreno con un’ansa sterile da 10 µl e procedendo con lo striscio al fine di ottenere colonie ben isolate per entrambi i tipi di terreni di arricchimento. Una volta che le piastre sono asciutte, invertirle e porle in incubatore a 37°C per 24 ±3 ore.
Analisi delle piastre e test di conferma
Le colonie tipiche cresciute su XLD hanno centro nero e una zona leggermente trasparente di colore rossiccio, a causa del viraggio di colore dell’indicatore.
Le colonie negative della Salmonella H2S, per esempio Salmonella S. Paratyphi cresciute su XLD sono rosa con centro più scuro. La salmonella lattosio positiva cresciuta su XLD agar è gialla con o senza annerimento.
Le colonie tipiche di Salmonella cresciute su BGA sono rosse, circondate da un alone rosso brillante. I ceppi di Salmonella Typhi e Salmonella S. Paratyphi non possono crescere su questo terreno.
Per la conferma prelevare da ciascuna piastra di ciascun terreno selettivo almeno una colonia considerata tipica o sospetta e altre quattro colonie se la prima è negativa. Eseguire uno striscio su Nutrient Agar in modo da consentire lo sviluppo di colonie ben isolate. Incubare le piastre tra 37°C per 24±3 ore.
Se le colonie fossero già ben isolate si può procedere direttamente alla conferma biochimica.
-Prova della citocromo ossidasi: prelevare una colonia con un’ansa sterile e strisciare su una striscia reattiva all’ossidasi e osservare la reazione per 5 secondi. La reazione negativa all’ossidasi, in cui non si verifica cambiamento di colore, è tipica di
Salmonella spp, mentre i microrganismi ossidasi positivi producono una reazione che
fornisce una colorazione blu-violetto entro pochi secondi.
Conferma biochimica
Per l'esame biochimico della Salmonella usare il kit di identificazione biochimica RapID ONE System.
Prelevare con un’ansa sterile i microorganismi cresciuti sul agar nutritivo e sospendere in RapID Inoculation Fluid fino ad ottenere una torbidità equivalente allo standard McFarland n.2.
La sospensione deve essere agitata accuratamente, se necessario con il vortex. Utilizzare le sospensioni entro 15 minuti dalla preparazione.
Sollevare la copertura adesiva che ricopre la parte del pannello destinata a ricevere l’inoculo (angolo superiore destro), sollevando verso sinistra la linguetta contrassegnata da “Peel to Inoculate”.
Con una pipetta, trasferire delicatamente tutto il contenuto della provetta con la sospensione batterica (Inoculation Fluid) nell'angolo superiore destro del pannello. Sigillare nuovamente con l'apposito sigillo facendo nuovamente aderire la linguetta. Dopo aver aggiunto la sospensione da analizzare, mantenendo il pannello su una superficie piana, inclinarlo con un angolo di circa 45 gradi, sollevando dal piano d'appoggio il lato su cui si trovano i pozzetti di analisi.
Mantenendo il pannello inclinato, farlo oscillare da un lato all'altro (dal lato sinistro a quello destro e viceversa) per distribuire uniformemente l'inoculo nella serie di cavità
presenti nella parte posteriore del pannello stesso.
Rimettere il panello in posizione orizzontale. Tenendo aderente al piano d’appoggio il lato su cui si trovano pozzetti contenenti i reagenti, inclinare lentamente il pannello, sollevando questa volta il lato lungo il quale è distribuito l’inoculo. Questa operazione consente il passaggio di tutto l’inoculo dal canaletto d’inoculo (parte posteriore del pannello) ai pezzetti di reazione.
Se il pannello viene inclinato troppo velocemente, si possono formare delle bolle d'aria che impediscono all’inoculo di scorrere liberamente nei pozzetti.
Riportare il pannello in posizione orizzontale. Se necessario, battere delicatamente il pannello su piano di lavoro per eliminare eventuali bolle d’aria presenti nei pozzetti.
Incubare i pannelli inoculati a 35-37°C in un incubatore per 4 ore.
Per la lettura dei risultati sollevare la copertura adesiva posta sopra i pozzetti. Aggiungere due gocce di RapID ONE Reagent nei pozzetti dal n.15 al n.17.
Leggere i pozzetti dal n.1 al n.18 procedendo da sinistra a destra, facendo riferimento alla tabella allegata al Kit per i criteri di lettura.
Aggiungere due gocce di RapID Spot Indole Reagent nel pozzetto n.18.
Attendere per lo sviluppo del colore da un minimo di 10 secondi a un massimo di 2 minuti, poi leggere e registrare il pozzetto 18.
Per l’identificazione, confrontare il microcodice ottenuto nel foglio di lavoro con quello riportato nel database elettronico ERIC (Electronic RapID Compendium)
Conferma sierologica
• Dispensare due gocce distinte di soluzione salina allo 0,85% su un vetrino. Emulsionare con un'ansa aliquote della coltura in esame in ciascuna goccia di soluzione salina allo 0,85% fino a ottenere una sospensione omogenea piuttosto densa.
• Aggiungere come controllo una goccia di soluzione salina allo 0.85% ad una sospensione e miscelare. Aggiungere una goccia di antisiero intero (non diluito) all'altra sospensione e miscelare.
• Agitare delicatamente con movimento oscillatorio il vetrino per un minuto e osservare l'agglutinazione utilizzando una fonte di luce indiretta su fondo scuro. Eliminare il vetrino utilizzato secondo le norme di disinfezione e smaltimento in vigore.
L’agglutinazione deve essere forte e chiaramente visibile entro un minuto. Nel controllo con soluzione salina non deve verificarsi alcuna agglutinazione visibile; in caso contrario, la sospensione non è idonea all'analisi con questo metodo.
In alcuni ceppi l'agglutinazione O potrebbe venire nascosta dalla presenza dell'antigene Vi. Tale fenomeno può essere identificato mediante il test di agglutinazione utilizzando il Salmonella Agglutinating Serum (Vi). In presenza di antigene Vi, una sospensione salina dei microrganismo deve essere riscaldata a 100° C per un'ora in modo da distruggere l'antigene Vi e poi centrifugata; una sospensione salina fresca del deposito deve essere rianalizzata con gli antisieri O per l'identificazione degli antigeni O. Va ricordato che l'antigene Vi non è riconducibile esclusivamente a Salmonella.
Espressione dei risultati:
-Se nel campione sottoposto ad analisi non è stata trovata Salmonella spp. esprimere il risultato nel seguente modo: “assente in X g” oppure “assente in X ml”,
dove X rappresenta il valore della massa o del volume di campione effettivamente sottoposto a prova.
-Se nel campione sottoposto ad analisi è stata trovata Salmonella spp. esprimere il risultato nel seguente modo:
“presente in X g” oppure “presente in X ml”,
dove X rappresenta il valore della massa o del volume di campione effettivamente sottoposto a prova.
Ricerca di Enterobatteri
I membri delle Enterobacteriaceae sono ampiamente distribuiti e sebbene i ceppi di alcune specie siano commensali innocui, altri sono importanti patogeni umani e animali.
La loro distribuzione è ubiquitaria, ciò significa che è inevitabile che alcuni membri delle Enterobacteriaceae entrino nella catena alimentare, pertanto lungo i processi produttivi la contaminazione da Enterobacteriaceae, compresi gli agenti patogeni, deve essere prevenuta o controllata dall'applicazione di uno o più sistemi riconosciuti di assicurazione della qualità, compresi i sistemi di analisi dei rischi e di controllo critico (HACCP) e Good Manufacturing Practices (GMP).
Le Enterobacteriaceae svolgono un ruolo prezioso come organismi indicatori negli alimenti trasformati, in particolare quelli sottoposti a trattamento termico. A seconda del livello di contaminazione iniziale e del trattamento, possono fornire un'indicazione affidabile del fallimento del processo, della sotto-lavorazione o della contaminazione post-processo.
La ricerca degli enterobatteri è eseguita facendo riferimento alla norma UNI EN ISO 21528-2:2017
Procedimento
Trasferire 1ml della diluizione 1:10 o delle ulteriori diluizioni preparate, in una piastra Petri. Aggiungere circa 10ml del terreno VRBG preparato in precedenza e mantenuto alla temperatura di 47-45°C nel bagno termostatico entro 15 minuti dall’inoculo del campione su piastra. Mescolare l’inoculo con il terreno ruotando delicatamente la piastra con movimenti circolari, lasciare solidificare ed aggiungere altri 15 ml di VRBG come secondo strato per creare una condizione di semi-anaerobiosi.
Incubare le piastre a 37°C per 24 ore, invertite. Al termine dell’incubazione esaminare le piastre.
Analisi piastre e test di conferma.
Le colonie tipiche degli enterobatteri sono rosso porpora con alone rossastro. Se si presentano colonie tipiche contare le colonie e selezionarne almeno cinque ben isolate per piastra. Seminarle su Nutrient Agar per ottenere una subcultura.
Incubare a 37°C per 24±2 ore e poi eseguire i test di conferma:
• Test Ossidasi: usando un’ansa monouso sterile prelevare la coltura microbica e strisciare su Oxidase Strips. Osservare la reazione per almeno 10 secondi: una reazione negativa, tipica delle Enterobacteriaceae, si manifesta senza variazioni di colore, una reazione positiva determina sviluppo di colorazione blu.
•Test fermentativo: Strisciare con un’ansa sterile monouso la coltura microbica e seminare in una provetta di Glucose OF medium e ricoprire la superficie con 1ml di olio minerale sterile.
Incubare a 37°C per 24±2 ore: la conferma sarà positiva per
Enterobacteriaceae se la provetta presenterà colorazione gialla, dovuta alla fermentazione del glucosio.
Ricerca Coliformi totali
La ricerca dei coliformi è eseguita facendo riferimento alla normativa ISO 4832:2006, applicabile all’analisi del gelato e del latte. Nel gruppo dei coliformi totali vengono compresi microrganismi che fanno parte della famiglia delle Enterobacteriaceae: sono bastoncelli Gram- aerobi e anaerobi facoltativi, non sporigeni.
Pur essendo presenti nel materiale fecale di origine umana con una densità media di 109
UFC/gr, sono ubiquitari, infatti i coliformi totali non sono correlati direttamente ad una contaminazione di tipo fecale in quanto molto diffusi in suolo, acque, matrici alimentari sia vegetali che di origine animale.
Coliformi a concentrazioni normalmente presenti negli alimenti vengono generalmente uccisi durante i processi di lavorazione col calore, ad esempio durante la pastorizzazione.
La loro presenza nell’alimento in una concentrazione oltre i limiti stabili, indica una scarsa igiene nel processo produttivo, un’inefficienza dei trattamenti termici o una contaminazione post-trattamento.(Cornell University Department of Food Science)
Procedimento
Trasferire 1ml della diluizione 1:10 o delle ulteriori diluizioni preparate, in una piastra Petri. Aggiungere circa 10ml di VRBL preparato in precedenza e mantenuto alla temperatura di 47-45°C nel bagno termostatico entro 15 minuti dall’inoculo del campione su piastra. Mescolare l’inoculo con il terreno ruotando delicatamente la piastra con movimenti circolari , lasciare solidificare ed aggiungere altri 15 ml di VRBL come secondo strato per creare una condizione di
semi-anaerobiosi.
Incubare le piastre a 37°C per 24 ore, invertite. Al termine dell’incubazione esaminare le piastre.
Analisi piastre e test di conferma
Le colonie tipiche dei coliformi sono rosso porpora, talvolta con alone rossastro. Le colonie atipiche devono essere sottoposte a conferma.
Selezionare almeno 5 colonie atipiche per piastra.
Inoculare ciascuna colonia atipica in una provetta con il terreno BGBB (Brilliant Green Bile Broth) contenente la campanella di Durham.
La presenza di coliformi è confermata se, dopo 24 ore di incubazione a 37 °C, si rileva torbidità data da crescita cellulare e produzione di gas nella campanella.
Ricerca di E.coli
Il microrganismo fa parte della famiglia delle Enterobacteriaceae ed è inserito nel gruppo dei coliformi. Secondo la tradizionale classificazione, la specie produce indolo in terreni al triptofano ed è lattosio fermentante distinguendosi dai coliformi non termo- tolleranti per la crescita alla temperatura di 44°C.
Nell’ambito del gruppo dei coliformi, Escherichia coli è ampiamente rappresentato ed è in esclusivo rapporto con il tratto gastrointestinale dell’uomo e degli animali a sangue caldo. (ISTISAN 07/5)
E’ dunque indice di contaminazione fecale ed è un criterio di igiene di processo, poiché la presenza di tale microrganismo indica delle falle nei processi di sanificazione dei locali e delle attrezzature di lavoro e/o nell’igiene del personale.
La ricerca di E.coli β-glucuronidasi positivo è eseguita in conformità alla normativa UNI EN ISO 21528-2:2001
Procedimento
Trasferire in una piastra Petri 1ml del campione di prova o delle sospensioni diluite, utilizzando una nuova pipetta per ogni diluizione seminata.
Versare circa 15 ml del terreno TBX nella piastra, entro 15 minuti e agitare delicatamente con movimenti circolari per consentire una distribuzione omogenea del campione nel terreno. Far solidificare il terreno e incubare a 44°C per 24 ore.
Analisi delle piastre e conta delle colonie
Le colonie tipiche di E.coli presentano colorazione blu.
Conta colonie a 30°C.
Indica la presenza di microrganismi aerobi mesofili. Per quanto di per sé non sia direttamente correlabile alla sicurezza microbiologica dell’alimento, è indicatore di contaminazione globale della matrice alimentare analizzata.
La conta dei mesofili è eseguita in riferimento alla UNI EN ISO 4833-1:2013.
Procedimento
Trasferire 1ml della diluizione 1:10 o delle ulteriori diluizioni preparate, in una piastra Petri. Se appropriate e se possibile selezionare solo le fasi di diluizione critiche (almeno due diluizioni decimali consecutive) per l’inoculazione nelle piastre, che forniscano conte tra 10 e 300 colonie per piastra.
Versare circa 15 ml di PCA mantenuto a 44-47°C per ogni piastra Petri, mescolando delicatamente il terreno con l’inculo con movimenti rotatori.
Lasciare solidificare, invertire ed incubare a 30±1°C per 72±3 ore.
Espressione del risultato
In riferimento alla norma UNI EN ISO 7218:2013.
Il conteggio viene effettuato quando almeno su una piastra sono contenute colonie nel campo di misura 10-300 (totali, tipiche, o conformi ai criteri d’identificazione).
I casi generali prevedono:
• l’inoculo di una piastra Petri dal diametro di 90 mm per ciascuna diluizione;
• numero massimo di conta per le colonie totali per piastra pari a 300; • numero massimo di colonie tipiche e atipiche presenti su una piastra pari
a 300;
• numero massimo di colonie presuntive o tipiche pari a 150 per piastra; • numero di colonie presuntive inoculate per l’identificazione o la
conferma in ciascuna piastra conservata: in generale 5.
Arrotondare il risultato finale (Cs) a due cifre significative. Se la terza cifra è minore di
5 non modificare la seconda cifra, se terza cifra è ≥ 5 incrementare di una unità la seconda cifra significativa. Esprimere il risultato come un numero compreso tra 1,0 e 9,9 moltiplicato per la potenza di 10.
Metodo di calcolo: Caso Generale (Conta delle colonie totali o colonie tipiche)
Affinché il risultato sia considerato valido, è generalmente necessario contare le colonie su almeno una piastra contenente almeno 10 colonie (totali, tipiche, o confermate con criteri d’identificazione).
La conta delle colonie nel caso generale, dopo aver effettuato 2 successive diluizioni avviene utilizzando la seguente relazione generale:
Σc
V x 1,1 x d
C
s=
Σc
V x 1,1 x d
C
s=
dove:Cs = numero di microrganismi presenti nel campione sottoposto a prova;
Σc = somma di colonie contate su due piastre di due diluizioni consecutive, in cui almeno una piastra contiene minimo 10 colonie;
V = volume (ml) di campione inoculato in ogni piastra;
d = fattore di diluizione corrispondente della prima diluizione considerata (d=1 quando viene utilizzato il campione tal quale)
Metodo di calcolo dopo identificazione
Il numero di microrganismi dopo identificazione viene determinato nel caso dei metodi che richiedano conferma delle colonie, mediante la seguente relazione:
a=
b×CA
dove:
a=colonie calcolate b=colonie confermate
A= colonie sottoposte a conferma C= colonie sospette contate sulla piastra
Utilizzare poi la seguente formula per calcolare la concentrazione nel campione, espressa come Ufc/gr
Σc
V x 1,1 x d
C
s=
Σc
V x 1,1 x d
C
s=
dove:Cs = numero di microrganismi presenti nel campione sottoposto a prova;
Σc = somma di colonie contate su due piastre di due diluizioni consecutive, in cui almeno una piastra contiene minimo 10 colonie;
V = volume (ml) di campione inoculato in ogni piastra;
d = fattore di diluizione corrispondente della prima diluizione considerata (d=1 quando viene utilizzato il campione tal quale)