La batterio rodopsina, BR, come detto è un complesso formato dall’apoproteina batterio- opsina, BO, e il cromoforo retinale che fa da cofattore, perciò per ottenere un livello adeguato di complessi di BR funzionali la regolazione della produzione dell’ apoproteina BO, deve essere accoppiata alla regolazione della produzione del suo cofattore, il retinale. Questo tipo di controllo va ad influenzare anche la batterioruberina, Rub, carotenoide a 50 atomi di carbonio, il principale carotenoide prodotto in H. salinarum.
I primi passaggi della via metabolica che porta alla sintesi di retinale e di Rub sono infatti condivisi (Fig 1.22):
A partire da due molecole di acetil-CoA e un’unità a due atomi di carbonio (C2) derivante dalla degradazione degli amminoacidi, vengono sintetizzate le unità isopreniche attivate (C5) isopentenil pirofosfato, ISPP, e il suo isomero dimetilallil pirofosfato, DMAPP. Il pathway è quello del mevalonato (Rodrigo-Banos et al., 2015).
L’ISPP e il DMAPP tramite una condensazione testa-coda formano il composto C10 geranil pirofosfato, GPP. Altre due reazioni di condensazione testa-coda con altrettante molecole di IPP portano alla formazione di farnesil pirofosfato, FPP, a 15 atomi di carbonio e poi del composto a 20 atomi di carbonio geranilgeranil pirofosfato, GGPP (Rodrigo-Banos et al., 2015).
Due molecole di GGPP (C20) sono condensate a formare il carotenoide a 40 atomi di carbonio fitoene, la reazione è catalizzata dall’enzima fitoene sintasi, codificata dal gene crtB1 che è parte dell’operone bop. Il GGPP è usato anche per la sintesi dei lipidi di membrana (Dummer et al., 2011; Yang et al., 2015)
Il fitoene subisce una serie di reazioni di desaturazione catalizzate dagli enzimi crtI1,2,3, a formare il carotenoide rosso licopene (Dummer et al., 2011; Yang et al., 2015)
A questo punto la via metabolicha diverge e si divide in due vie che portano a retinale e batterioruberina rispettivamente (Fig 1.22) (Dummer et al., 2011).
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Figura 1.22: La via metabolica completa che porta alla sintesi di retinale e batterioruberina negli aloarchea (da Rodrigo-Banos et al., 2018 modificata)
In una via il licopene può essere ciclizzato a ß-carotene dall’enzima licopene ß ciclasi, crtY (forme simili sono presenti anche in funghi e batteri), la cui delezione porta infatti ad un accumulo di licopene e alla scomparsa di ß-carotene e retinale (Peck et al., 2002). Il ß- carotene, che è un C40, è tagliato in due molecole di retinale C20 ad opera dell’enzima ß- carotene 15,15’-diossigenasi (Yang et al., 2015). Si ritiene che quest’ultima reazione sia catalizzata dalla proteina Brp, prodotto del gene brp contenuto nell’operone bop. La struttura predetta di Brp consiste di 6-7 α-eliche transmembrana e due α-anfipatiche nel citoplasma (Shand et al., 1991). Delezioni o mutazioni che alterano questa attività portano ad una notevole riduzione di retinale e ad un accumulo di ß-carotene. Il retinale tuttavia non scompare in quanto nell’operone bop è presente un altro gene, blh, che ha funzione ridondante rispetto a brp. La mutazione di brp e blh porta praticamente alla scomparsa di retinale e quindi della forma funzionale della batteriorodopsina, BR (Peck et al., 2001).
39 Nell’altra via invece l’enzima licopene elongasi, Lye, catalizza l’aggiunta al licopene di 2 unità a 5 atomi di carbonio di dimetilallil pirofosfato, DMAPP, o, in alternativa di isopentenil pirofosfato, ISPP. Il prodotto di questa reazione è la tetra-idro-bis- anidrobatterioruberina a 50 atomi di carbonio che rappresenta il primo intermedio della batterioruberina (Dummer et al., 2011). Questo composto sarà poi trasformato in batterioruberina attraverso una serie di reazioni di desaturazione e idratazione. Queste ultime reazioni sono state meglio caratterizzate in un altro organismo alofilo Ha. Japonica, ma si ritiene che avvengano in modo relativamente simile anche in H. salinarum (Yang et al., 2015).
Il licopene è importante perché rappresenta l’ultimo intermedio comune nelle vie che portano a retinale e batterioruberina ed è a questo livello che probabilmente si esercita la regolazione (Dummer et al., 2011).
È stata avanzata l’ipotesi che questa regolazione sia operata proprio dall’apoproteina batterio-opsina, BO, sull’enzima Lye responsabile dell’indirizzamento del licopene verso la sintesi di Rub (Fig 1.23); mutazioni in questo gene portano infatti alla scomparsa di batterioruberina (Dummer et al., 2011).
Figura 1.23: Schema che rappresenta le reazioni metaboliche a valle dell’ultimo
intermedio comune, il licopene, e l’effetto inibitorio proposto di BO sull’enzima licopene elongasi Lye (da Peck et al.,2017)
Altre possibili alternative sono state escluse: è improbabile che Bop sequestri il DMAPP o l’ISPP vista la loro importanza in altri processi quale la produzone di lipidi di membrana; il legame del licopene richiederebbe invece un eccessiva affinità per discriminarlo da molecole simili (Dummer et al., 2011). L’idea è che la regolazione non sia a livello
40 trascrizionale o traduzionale in quanto si osserva anche quando l’enzima Lye è fatto esprimere su un plasmide mancante delle sequenze di controllo a monte e a valle (Dummer et al., 2011).
Facendo esprimere l’enzima Lye e la batterio-opsina di H. salinarum in un altro alofilo estremo, Haloferax volcanii, hanno osservato che l’espressione di BO è sufficiente per inibire la sintesi di Rub operata da Lye e che questa inibizione è rimossa fornendo retinale esogeno (Peck et al., 2017). L’effetto è inoltre specifico per Lye di H. salinarum in quanto l’enzima di H. vulcanii, che produce Rub ma non ha BO/BR, non è inibito (Dummer et al., 2011).
Il meccanismo di funzionamento proposto è il seguente: quando BO non è legata al retinale possiede una struttura che le consente di legare Lye ed inibirne l’attività, quando viene prodotto retinale questo si lega a BO inducendo un cambiamento conformazionale che porta alla formazione di BR e al rilascio dell’inibizione su Lye (Peck et al., 2017). A dimostrazione di ciò la mutazione puntiforme K216A che impedisce il legame del retinale a BO, impedisce il rilascio dell’inibizione anche fornendo retinale dall’esterno (Peck et al., 2017). Un sistema di inibizione simile si è visto anche in H. valismortis, in cui la Cruxopsina-3, CO, inibisce Lye similmente a quanto accade in H. salinarum, potrebbe quindi trattarsi di un sistema diffuso ai numerosi organismi che producono rodopsine (Peck et al., 2017).
Anche il prodotto del gene CYP174A1 che codifica per una citocromo P450 monoossigenasi sembra avere un ruolo nel metabolismo della batterioruberina. Muller et al (2018) hanno osservato che la delezione di questo gene porta ad un aumento della produzione di batterioruberina e ad una riduzione nei livelli di espressione di bop e quindi di Purple Membrane. Il fenotipo è simile a quello che si osserva quando abbiamo una delezione o una mutazione nel fattore di trascrizione Bat che controlla l’espressione dei geni del regulone bop tra cui bop stesso. Una delle possibili funzioni proposte per CYP174A1 è quella di trasformare il ß-carotene in astaxantina un carotenoide che possiede una potente attività antiossidante nei confronti dell’ossigeno singoletto (Muller et al., 2018). Una delezione di CYP174A1 porta quindi ad una riduzione nella produzione di astaxantina e quindi un incremento dei livelli di ossigeno singoletto ed altri ROS. L’incremento di ROS potrebbe rappresentare un segnale che porta H. salinarum a ridurre l’espressione di BO, questo rilascia l’inibizione su Lye e di conseguenza abbiamo un aumento nell’espressione di batterioruberina anch’essa dotata di attività antiossidante (Muller et al., 2018).
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