Procedura di purificazione contemporanea delle PM e RM

Nei nostri esperimenti per la purificazione contemporanea delle RM e delle PM abbiamo modificato protocolli già utilizzati in istituto per la purificazione delle Purple Membrane.

Per estrarre e purificare insieme questi due patch di membrana abbiamo utilizzato 1L di coltura mantenuta nelle condizioni standard sopra descritte e ottenuta inoculando 100 ml di coltura batterica in fase stazionaria in 900 ml di terreno fresco.

Quando la coltura è in fase stazionaria i batteri vengono raccolti tramite centrifugazione con una centrifuga Beckman rotore JA-10 a 6000g, per circa 30-35 minuti a 8°C. Il sovranatante, ovvero il terreno, è scartato ed i batteri sono risospesi in una decina di ml di una soluzione avente la stessa composizione del terreno ma senza peptone, soluzione basale. Questo evita una lisi prematura dei batteri ed un inquinamento da agenti esterni.

Si aggiunge DNasi ai batteri risospesi e si mettono a dializzare contro H2O

deionizzata in un tubo da dialisi, con taglio a 12 kDa. La dialisi dura almeno 12h cambiando l’acqua una o due volte per un totale di circa 10 L.

Dopo la dialisi i batteri sono centrifugati a 4000g, 10°C per circa 20-30 minuti, rotore JA-20. Il pellet ottenuto con questo passaggio sono i cosiddetti debris (inquinanti particolarmente grandi come porzioni di flagelli ecc, ecc) e viene quindi scartato. Il sovranatante viene invece conservato, se ne misura lo spettro di assorbimento, ed è poi centrifugato a 39000g 4°C per 150 minuti, rotore JA-20. Questo passaggio serve per ottenere un campione di membrane il più concentrato possibile; il sovranatante contiene invece componenti come le proteine citosoliche ed è quindi scartato. Al termine della centrifugazione si fa lo spettro di assorbimento sia del sovranatante che del pellet. Il pellet ottenuto da questo passaggio, detto Pellet-0, contiene entrambi i patch di membrana e rappresenta il punto di partenza per tutte le successive procedure di separazione.

Il Pellet-0 viene quindi risospeso in 4 ml di H2O deionizzata e viene depositato su

gradienti di saccarosio in tubi da ultracentrifuga. I gradienti sono depositati nei tubi con una siringa partendo dalla concentrazione più alta sul fondo e proseguendo verso l’alto con le concentrazioni più basse. Il campione è sottoposto ad ultracentrifugazione in un ultracentrifuga Beckman, rotore 70-Ti, a 120000g 10°C

50 per 4 h. In un protocollo lievemente modificato il Pellet-0 viene sottoposto a due centrifugazioni consecutive a 17000g per 30min a 4°C, rotore JA-20. Questo serve per avere un campione con una ancora più ridotta presenza di proteine citosoliche rispetto al Pellet-0 e ottenere così una migliore ultracentrifugazione. Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato diverse combinazioni sia di concentrazioni sia di volumi di saccarosio. Nella tabella seguente sono rappresentate alcune di queste combinazioni:

Tabella 1: La tabella mostra alcuni gradienti di saccarosio che abbiamo utilizzato. La

concentrazione, indicata da % è espressa in peso su peso (% w/w) mentre i volumi sono in ml; il volume complessivo della provetta è sempre di 21 ml.

1 2 3 4 % ml % ml % ml % ml 16 7 16 10 16 4 16 4 36 7 25 4 25 10 36 7 38 7 38 7 38 7 38 7 40 3

Come procedura alternativa e di maggior semplicità rispetto all’ultracentrifugazione in gradiente di saccarosio abbiamo utilizzato il metodo delle centrifugazioni successive.

Il Pellet-0 viene sottoposto a varie centrifugazioni consecutive a 17000g, JA-20, 4°C, per 30 minuti. Ad ogni passaggio centrifugativo il pellet viene risospeso e centrifugato di nuovo, per un numero di passaggi di almeno 5 per NRC1 e almeno 3 per S9. Ad ogni step centrifugativo si rimuovono sempre più RM che rimangono nei sovranatanti ed il pellet finale consiste di sole PM. I sovranatanti che si ottengono da questi passaggi centrifugativi sono conservati e successivamente concentrati o per centrifugazione ad alto g oppure per ultrafiltrazione. Quest’ultima procedura è effettuata con cella e filtri Amicon usando un filtro da 300 kDa per eliminare la maggior parte dei componenti proteici. Anche in questo caso sia l’eluato dell’ultrafiltrazione che il concentrato sono sottoposti ad analisi spettroscopica, quest’ultimo dovrebbe contenere le sole RM. Tutti gli spettri sono stati misurati tra 750 e 250 nm usando provette di quarzo e lo stesso spettrofotometro Jasco usato per

51 le colture. Condizioni che consentono di valutare le proteine e l’eventuale presenza di DNA o RNA. Le procedure sopra descritte sono riassunte nel seguente diagramma di flusso

Colture batteriche volume 1 L

Concentrazione batteri per centrifugazione a 6000g,

30’, 8°C, rotore JA-10

Dialisi contro H2O 10L

Centrifugazione a 4000g, 20, 10°C, rotore JA-20 Centrifugazione a 39000g, 150’, 4°C, rotore JA-20 2 Centrifugazioni consecutive a 17000g, 30’, 10°C, rotore JA- 20 Gradiente di Saccarosio Ultracentrifugazione a 120000g, 240’, 10°C, rotore 70-Ti 6 Centrifugazioni consecutive a 17000g, 30’, 10°C, rotore JA-20 Pellet = Purple Membrane, PM Ultrafiltrazione sovranatanti con filtro da 300 KDa Bande = Red Membrane, RM Pellet = Purple Membrane, PM Scartare pellet (Debris) Scartare sovranatante Scartare sovranatanti Concentrato Ultrafiltrazione = Red Membrane

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3. Risultati

Per i nostri esperimenti, come descritto in Materiali e Metodi, abbiamo costruito un apparato sperimentale ad hoc diverso da quelli presenti e usati nell’Istituto di Biofisica per la crescita delle colture di H. salinarum, quindi, come prima cosa abbiamo verificato che la crescita delle colture fosse buona e coerente con quelle ottenute in precedenza. Successivamente, abbiamo cercato, oltre a condizioni di crescita il più possibile simili a quelle naturali, quelle condizioni di inoculo che ci consentissero di portare entrambe le colture, del wild-type NRC1 e del mutante S9, nella fase di saturazione in tempi ragionevolmente equivalenti, permettendoci di poter effettuare, volendo, tutti gli esperimenti in parallelo. Questo ci consentiva durante la crescita, per ogni specifica condizione sperimentale, il confronto non solo con la coltura di controllo, ma anche con quella dell’altro ceppo batterico. Nella Figura 1 sono riportati gli spettri di assorbimento di colture dei due ceppi batterici che soddisfano appunto questa condizione. In tutti i nostri esperimenti abbiamo sempre misurato spettri di assorbimento delle colture e non il solo assorbimento a 660nm, perché, come descritto nell’introduzione, questi archeobatteri producono molte molecole che assorbono la luce e che sono determinanti per la loro sopravvivenza. Quindi, dagli spettri si potevano ottenere delle indicazioni, quantomeno qualitative, sull’evoluzione di questi fotorecettori lungo la curva di crescita. In effetti, come si può notare nella Figura 3.1, nella porzione di spettro tra 630nm e 450nm gli andamenti sono molto diversi per i due ceppi. In NRC1 si notano subito lungo la curva di crescita i picchi caratteristici della batterioruberina, Rub, che con il passare dei giorni diventano sempre più evidenti, così come diventa più evidente la variazione, gobba, dell’andamento della curva tra 630 e 560nm, indice della presenza di batteriorodopsina, BR. In S9, che a causa della sua mutazione, produce molta BR si nota solo la variazione di andamento dovuta alla presenza di questo fotorecettore. Gli altri fotorecettori, alorodopsina

54 e rodopsine sensorie, non sembrano essere evidenziabili. I loro assorbimenti, tra 600 e 500nm, sono nella zona di spettro in cui assorbono sia Rub che BR e la loro concentrazione è molto minore di questi pigmenti. Quindi, in condizioni standard il loro assorbimento è coperto da quello dei pigmenti appena citati. Gli spettri sono prevalentemente dovuti alla diffusione dei batteri. Infatti, come si vede nei grafici, aumentano al diminuire della lunghezza d’onda e in effetti, gli andamenti degli spettri di assorbimento sono di tipo esponenziale. I fit riportati nei due grafici di Figura 1 per la prima e la quinta curva, corrispondenti a 24h e 168h, sono ottenuti con un programma automatico basato sui minimi quadrati e l’equazione di tipo esponenziale che meglio si adattava agli andamenti era: f = y0+a*exp(-b*x). Questo tipo di fit era in grado di dare indicazioni per l’andamento generale della curva, ma i nostri batteri hanno molti pigmenti. Quindi, mentre era piuttosto semplice ottenere un’indicazione sull’andamento delle curve nelle fasi iniziali della coltura, è stato più laborioso cercare di capire se anche nelle fasi più avanzate l’andamento era sempre esponenziale. Per i fit delle curve corrispondenti a 168h di crescita è stato necessario usare qualche artificio matematico che escludesse dal fit l’assorbimento dei pigmenti. I parametri dei fit che sono riportati nella didascalia della figura e anche gli altri indici che, per semplicità, sono omessi, indicano che i fit sono congrui e gli andamenti generali delle curve sono esponenziali. Nella Figura 2 sono riportate, per le stesse colture, le curve di crescita calcolate prendendo i valori dell’assorbimento a 660nm e le curve relative ai valori misurati a 567nm, corrispondente al picco di assorbimento della batteriorodopsina. Queste ultime sono sempre state prese in esame per le eventuali indicazioni che potevano venirne sulla produzione di BR, ma l’interpretazione dei dati non è semplice e univoca. A 567nm il valore di assorbanza è sempre più alto sia perché la nostra è una misura di diffusione e quest’ultima è inversamente proporzionale a 4 , sia perché l’assorbimento di BR a 567nm si sovrappone all’assorbimento di uno dei picchi della batterioruberina e quindi il valore misurato

55 dipende dalla concentrazione di entrambi i pigmenti. In S9 è più legato alla presenza di BR, anche se anche lui produce una piccola quantità di Rub; in NRC1 sono presenti entrambi e il contributo di BR non è ricavabile in modo semplice. Per questa ragione avevamo pensato di mettere a punto, per piccoli volumi, una procedura di estrazione e separazione dei due pigmenti di cui parleremo diffusamente più avanti. Dall’analisi delle curve di crescita e dei parametri ottenuti con fit sigmoidale e che sono riportati nella tabella in Figura 3.2 si ricava, come indicazione principale, che la coltura di S9 ha valori di saturazione più alti rispetto a NRC1. A parità di condizioni e di tempo S9 cresce di più e questo è in linea con le osservazioni già effettuate in Istituto e quelle riportate in letteratura. Anche i valori ottenuti per le assorbanze sono in linea con i dati di letteratura che sono di circa 1.2 per S9 e circa 1.0 per NRC1. Le nostre colture di controllo sono sempre mantenute nelle condizioni standard del laboratorio, che sono anche quelle suggerite in letteratura per poterne confrontare i dati.

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Figura 1.1: Spettri di assorbimento di colture batteriche di H. salinarum. In alto: Colture di NRC1, sono evidenti i picchi della Batterioruberina. In basso: Colture di S9, la diversa convessità delle curve nelle fasi più avanzate della coltura è indice della presenza di BR. Per entrambi i grafici i fit, curve tratteggiate, sono decadimenti esponenziali. I parametri ottenuti per NRC1 a t=24h sono: y0=0.14 std=0.002, a=114 std=3.83, b=0.013 std=9.16*10-5, R2=0.993; a t=168h y0=0.3 std=0.007, a=35.27 std=0.91, b=0.007 std=7.39*10-5_{, R}2_{=0.998. Per S9 a t=24h sono: y0=0.044 std=8.14*10}-4_{, a=429.6}

std=12.94, b=0.017 std=8.18*10-5, R2=0.996; a t=168h y0=0.42 std=0.003, a=49.17 std=0.97, b=0.009 std=5.52*10-5, R2=0.999.

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Figura 3.2: Curve di crescita colture batteriche di H. salinarum. Colture di NRC1 in rosso. Colture di S9 in viola. I circoli rappresentano l’assorbimento ottenuto a 660nm e danno l’andamento della crescita della coltura. I rombi rappresentano l’assorbimento ottenuto a 567 nm tipico della batteriorodopsina. In basso la tabella con i valori dei parametri del fit sigmoidale.

Le colture di NRC1 nelle nostre condizioni standard si sono dimostrate stabili nel corso del lavoro di tesi come si può vedere nella Figura 3.3 in cui sono riportate le curve di crescita di colture effettuate in tempi diversi e che sono abbastanza simili tra loro. Le colture di S9, invece, sembrano un po’ meno uniformi. In realtà questa relativa differenza è dovuta al fatto che per le misure effettuate con S9 spesso siamo dovuti ripartire dalle colture stock per le ragioni che saranno subito chiare.

58 S9 Curve di crescita (2018-2019) Tempo (h) 0 48 96 144 192 240 288 336 As so rba nz a 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 S9-Abs660nm 1-17/10/18 S9-Abs660nm 17-28/01/19 S9-Abs660nm 29-01/8-02/19 S9-Abs660nm 26/3-08/04/19 S9-Abs660nm 13-20/05/19 Fit S9-Abs660nm 1-17/10/18 Fit S9-Abs660nm 17-28/01/19 Fit S9-Abs660nm 29-01/8-02/19 Fit S9-Abs660nm 13-20/05/19 Fit S9-Abs660nm 26/3-08/04/19

NRC1 & S9 Curve di crescita (2018-2019)

Tempo (h) 0 48 96 144 192 240 288 336 As so rba nz a 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 NRC1-Abs660nm 1-17/10/18 _{NRC1-Abs660nm 5-13/11/18} NRC1-Abs660nm 17-28/01/19 NRC1-Abs660nm 13-20/05/19 Fit NRC1-Abs660nm 1-17/10/18 Fit NRC1-Abs660nm 5-13/11/18 Fit NRC1-Abs660nm 17-28/01/19 Fit NRC1-Abs660nm 13-20/05/19

Figura 3.3: Comparazione delle curve di crescita di colture batteriche di H. salinarum mantenute in condizioni standard. In alto: Curve di crescita di NRC1. In basso: Curve di crescita di S9. Fit sigmoide a 3 parametri.

Infatti, durante il lavoro di tesi le colture di S9 hanno mostrato andamenti di assorbimento diversi da quelli appena descritti e riportati in Figura 3.1. In particolare, ad un certo punto gli assorbimenti delle colture di S9 hanno cominciato a mostrare i picchi caratteristici della batterioruberina come mostrato in Figura 3.4. Questo carotenoide è poco prodotto da S9 a causa della competizione, descritta in dettaglio nell’introduzione, tra la via metabolica del carotenoide e quella della batteriorodopsina, quindi Rub non dovrebbe essere evidenziabile

59 nelle nostre misure di assorbimento a meno che qualcosa non sia intervenuto a modificare le colture.

Figura 3.4: Spettri di assorbimento di colture batteriche di H. salinarum, ceppo mutante S9. Si possono notare, soprattutto sugli spettri corrispondenti alla coltura in fase stazionaria, i picchi corrispondenti all’assorbimento della Batterioruberina, normalmente mancanti negli spettri di S9.

Ovviamente il primo controllo effettuato è stato quello di ripartire dalle colture stock per escludere che lo strano andamento delle colture di S9 non derivasse da una involontaria contaminazione tra le colture di S9 e quelle di NRC1. Per essere certi siamo ripartiti usando colture stock conservate in diversi modi escludendo così anche la possibilità di un involontario inquinamento dello stock da cui eravamo partiti. Abbiamo seguito le diverse colture per un po’ di tempo e verificato che la presenza dei picchi della batterioruberina in S9 non erano dovuti a contaminazione.

Essendo la batterioruberina un carotenoide protettivo per la cellula abbiamo cercato di capire se c’era un parametro tra quelli che potevamo modificare che induceva la formazione del carotenoide stesso. Per cui abbiamo progettato e svolto i nostri esperimenti sia in funzione della comprensione degli effetti della variazione dei parametri fisico-

60 chimici sulla crescita delle colture, come ci eravamo riproposti; sia in funzione della possibile induzione della batterioruberina. Quest’ultima particolarmente in S9, perché è più immediatamente evidente, ma anche in NRC1 dove è più difficile notarla. Ovviamente, per rispondere a queste domande le colture di S9 da cui fare gli inoculi non dovevano presentare picchi da batterioruberina, quindi era necessario, nel caso si fossero presentati, ripartire da stock. Da qui la relativa variabilità delle curve di crescita di Figura 3.3.

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