DISCUSSIONE e CONCLUSION

Nel nostro studio dal confronto delle curve di crescita dei due ceppi si può osservare che, a parità di condizioni di crescita, il ceppo mutante S9 è in grado di crescere fino a concentrazioni batteriche più elevate rispetto ad NRC1 e ciò è in linea con quanto indicato dalla letteratura. È possibile che questo fenomeno sia dovuto alla natura della mutazione di S9 il quale sovraesprime la proteina batteriorodopsina, BR. Questa espressione costitutiva di BR potrebbe far si che, arrivati nelle fasi stazionarie della crescita, quando abbiamo una deplezione di nutrienti ed O2, l’S9 riesca a

sostenersi tramite fotofosforilazione per un periodo di tempo più lungo fino a raggiungere concentrazioni più alte rispetto ad NRC1.

Confrontando invece lo spettro di assorbimento dei due ceppi nel range di lunghezze d’onda tra 750-350 nm si notano delle chiare differenze. L’NRC1 mostra, sin da concentrazioni batteriche relativamente basse, i tre picchi di assorbimento che caratterizzano la batterioruberina, il principale carotenoide prodotto da

Halobacterium salinarum. Un cambiamento nell’andamento della curva dovuto

all’assorbimento della batteriorodopsina (BR) si osserva invece in modo apprezzabile solo nelle fasi più avanzate della crescita. Il mutante S9 invece sovraesprime BR ed è talvolta descritto in letteratura come car- cioè mancante di carotenoidi.

Dalle procedure di purificazione si nota però che anche il mutante è in grado di produrre batterioruberina, sebbene a livelli molto bassi tali da non essere rilevabili dallo spettrofotometro quando si fa lo spettro della coltura. Il motivo della ridotta produzione di Rub in S9 rispetto a NRC1 è probabilmente da attribuirsi all’effetto inibitorio che la batterio-opsina sovraespressa in S9, esercita sulla sintesi di Rub come abbiamo discusso nell’introduzione. Non sono note ad oggi in letteratura altre mutazioni in S9 a carico della via metabolica che porta alla sintesi di Rub e che

90 potrebbero giustificare un tale fenotipo. Va però detto che non esiste un completo sequenziamento del genoma di S9, a differenza di quello di NRC1, non sono quindi note tutte le differenze tra i due ceppi.

Dai nostri esperimenti emerge che una riduzione dell’irradianza al 50% e allo 0% (Buio) ha un effetto irrilevante su NRC1 mentre, anche se in modo minimale, riduce la crescita e la produzione di BR nel mutante S9. Questa differenza, come detto nei risultati, potrebbe essere dovuta al fatto che il wild-type può ricorrere a processi metabolici alternativi come la fermentazione dell’arginina per sostenere la sua crescita quando i livelli di O2 calano. In S9 invece l’attività costitutiva di Bat ha

anche l’effetto di inibire o comunque ridurre l’espressione dei geni coinvolti nella fermentazione dell’arginina, il mutante S9 risulterebbe quindi più strettamente legato alla luce rispetto ad NRC1. L’effetto del ciclo luce (14h)- buio (10h) sul rallentamento e inibizione della crescita di S9 e NRC1 rispettivamente è stato discusso nei risultati. Potrebbe spiegarsi solo con un meccanismo di induzione– repressione dei processi metabolici alternativi da parte dei due stimoli alternantesi, cioè la luce e il buio. In effetti una parziale repressione dei geni legati al metabolismo dell’arginina da parte della luce è stata descritta. Sotto illuminazione e in fase stazionaria il contributo di BR è prevalente sugli altri processi ed evidentemente, in colture da laboratorio mantenute costantemente illuminate, l’induzione degli altri processi è molto lenta, risultando complessivamente inefficiente quando l’illuminazione non è più continua, ma alternata a fasi di buio; mentre può fornire il suo contributo quando l’illuminazione rimane spenta per tutta la durata della crescita della coltura.

Anche il grado di agitazione influenza la crescita. La riduzione dell’agitazione in particolare rallenta la crescita quando questa avviene nella prima fase di crescita mentre la blocca quando questa avviene nella prima fase stazionaria. All’opposto

91 invece l’aumento dell’agitazione nella prima fase di crescita incrementa quest’ultima mentre sembra essere irrilevante quando l’aumento è effettuato nella prima fase stazionaria. L’interruzione dell’agitazione invece blocca la crescita. L’effetto dell’agitazione sembra quindi essere dipendente dallo stato della coltura e non ha effetto rilevante sull’aumento di produzione di Rub da parte di S9.

L’effetto della temperatura sulla crescita appare invece meno chiaro, una maggiore temperatura sembra velocizzare la crescita delle colture in fase esponenziale, ma riduce complessivamente la crescita (indice di saturazione più basso rispetto al controllo). Nei campioni sottoposti a più alta temperatura sembra esserci una minore produzione di BR e una lieve produzione di batterioruberina. Questo sarebbe in linea con il ruolo di stabilizzatore di membrana proposto per questo carotenoide, un aumento della temperatura aumenta la fluidità della membrana, un aumentata sintesi di Rub potrebbe aiutare quindi a ristabilirne la rigidità.

Complessivamente, in alcune condizioni, l’espressione di questi carotenoidi risulta fortemente indotta in S9 a livelli paragonabili a quelli del wild-type e rilevabili tramite analisi spettroscopica della coltura. Non è possibile escludere che determinate condizioni di coltura influenzino almeno in parte la produzione di batterioruberina nel mutante S9, sebbene dai nostri risultati non sia possibile attribuire un tale fenomeno ad un parametro specifico.

Anche la concentrazione batterica non sembra essere un fattore fondamentale nel senso che è necessaria una concentrazione abbastanza alta perché lo spettrofotometro possa visualizzare i carotenoidi ma, a parità di concentrazione alcune colture mostrano un assorbimento evidente mentre altre no. Questo ci indica che, nelle colture in cui questo aspetto si presenta, abbiamo una più alta concentrazione di batterioruberina per batterio e che quindi c’è stata una qualche forma di induzione della sintesi di Rub.

92 Studi di carattere genetico su questi due ceppi potrebbero aiutare a fare luce sull’effetto che questi parametri hanno sull’espressione dei geni dell’operone bop e della via metabolica che porta alla sinesi di batterioruberina.

Dagli esperimenti di purificazione contemporanea delle Purple Membrane e delle Red Membrane, abbiamo potuto ottenere PM dal ceppo over-produttore S9, una tale separazione non è però stata possibile, nelle nostre condizioni, per NRC1 nel quale i due patch di membrana si muovono in maniera estremamente simile. La co-presenza, per NRC1, di BR e Rub nei campioni ottenuti con i nostri metodi di separazione suggerirebbe che, nelle nostre condizioni di coltura, i patch di membrana dei due pigmenti siano contigui. Una possibile spiegazione potrebbe risiedere nel fatto che, nelle nostre condizioni di coltura, anche il wild-type NRC1 sia andato incontro ad una qualche forma di induzione nella sintesi di Rub, sebbene meno evidente rispetto ad S9 data l’elevata produzione costitutiva di questo carotenoide in NRC1. Una più elevata sintesi di Rub si tradurrebbe quindi in un maggior numero di RM in membrana e quindi, come detto, in una possibile contiguità con le PM.

Misure di microscopia elettronica o a scansione di superficie potrebbero aiutare a validare tale indicazione oltre a fornire importanti informazioni sull’organizzazione strutturale delle Red Membrane sulle quali si hanno poche informazioni dalla letteratura. È ragionevole pensare che anche le RM possano presentare un certo grado di organizzazione strutturale, sebbene magari non ai livelli di PM. In particolare, come abbiamo visto nell’introduzione, ci sono indicazioni in letteratura di una stretta associazione tra molecole di Rub e proteine di tipo rodopsinico in organismi affini ad H. salinarum. Tale associazione è stata esclusa per la BR, ma è possibile che si verifichi per le altre proteine rodopsiniche la cui organizzazione in membrana è meno chiara o anche per proteine non di tipo rodopsinico.

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5. RINGRAZIAMENTI

Desidero ringraziare innanzitutto la mia famiglia, i miei genitori e mia sorella Gaia, per aver sempre appoggiato le mie scelte e per il loro supporto senza il quale non avrei potuto raggiungere questo importante traguardo della mia vita.

Desidero ringraziare inoltre i miei due relatori che mi hanno seguito nella stesura di questa tesi e grazie ai quali è stato possibile realizzare questo lavoro.

Ringrazio infine tutto il personale dell’Istituto di Biofisica del CNR di Pisa per la grande disponibilità che hanno sempre dimostrato ed i preziosi consigli che mi hanno dato.

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