Effetto della luce sulla crescita delle colture.

Uno dei primi parametri che abbiamo utilizzato per lo scopo descritto è stata la luce, facilmente modificabile e quantificabile. Nell’intento di ottenere effetti cospicui e facilmente misurabili nei primi esperimenti abbiamo usato stimolazioni piuttosto consistenti, come ad esempio il buio invece di una riduzione di Irradianza. Nella Figura 3.5 sono mostrati gli spettri di assorbimento e le curve di crescita di un esperimento con una coltura di NRC1 coltivata al buio e del relativo controllo mantenuto in condizione standard di illuminazione. Come si può vedere dalle curve di crescita e dall’analisi dei parametri del fit esse sono quasi uguali. La diversità dei valori riportati rientra nell’errore sperimentale per la preparazione dei campioni cellulari. Cioè l’errore che si può commettere nel prelevare il campione dalla beuta e nel preparare la cuvetta per la misura spettrofotometrica. Effettuando una valutazione grossolana delle differenze in lettura tra diverse preparazioni avevamo valutato che l’errore era all’incirca il 10%. La somiglianza tra le curve di crescita e la somiglianza degli spettri di assorbimento suggeriscono che l’assenza di luce durante la crescita non produce effetti particolarmente evidenti in NRC1. Non ci sono differenze rilevanti neanche nella fase di saturazione in cui la batteriorodopsina è indotta ed è particolarmente utile. La sua produzione, infatti, è funzione sia della luce che della carenza di O2. Probabilmente nelle nostre condizioni

standard il wild-type NRC1 è in grado di ovviare alla mancanza di energia proveniente dal fototrofismo, attivando le altre vie metaboliche.

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Figura 3.5: Effetto della luce sulla crescita delle colture di H. salinarum NRC1. In alto a sinistra gli spettri delle colture di controllo, cioè coltivate in condizioni di illuminazione standard. In alto a destra gli spettri di colture coltivate al buio. In basso le curve di crescita delle due colture messe a confronto, in blu le colture coltivate in condizioni standard, in rosso le colture sottoposte al ciclo luce-buio. I quadrati rappresentano l’assorbanza a 660nm, i cerchi quella a 567nm. A destra la tabella con i valori dei parametri del fit sigmoidale

Per S9, in cui alcune delle vie metaboliche alternative sono represse, l’effetto del buio sembrerebbe indurre solo una minore crescita della coltura, sebbene in questo particolare esperimento effettuato in parallelo con NRC1 la coltura sia stata seguita per un tempo limitato (Fig. 3.6). D’altra parte, un risultato simile, cioè una totale somiglianza tra le curve di crescita e tra gli spettri di assorbimento, si ottiene anche riducendo l’Irradianza del 50% (Fig. 3.7). Ciò rafforzerebbe l’idea che le condizioni generali di coltura siano comunque sufficienti al metabolismo dell’archeonte, sia esso mutante o wild-type.

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Figura 3.6: Effetto della luce sulla crescita delle colture di H. salinarum S9. In alto a sinistra gli spettri delle colture di controllo, cioè coltivate in condizioni di illuminazione standard. In alto a destra gli spettri di colture coltivate al buio. In basso le curve di crescita delle due colture messe a confronto, in blu le colture coltivate in condizioni standard, in rosso le colture sottoposte al ciclo luce-buio. I quadrati rappresentano l’assorbanza a 660nm, i cerchi quella a 567nm. A destra la tabella con i valori dei parametri del fit sigmoidale

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Figura 3.7: Effetto della riduzione della Luce sulla crescita delle colture di H. salinarum S9. In alto a sinistra gli spettri delle colture di controllo. In alto a destra gli spettri di colture coltivate con una Irradianza ridotta del 50%. In basso le curve di crescita delle due colture messe a confronto. In blu le colture coltivate in condizioni standard, indicate con (Ill.std); in rosso le colture sottoposte a I=50%Istd , indicate con (Luce 50%). I

quadrati rappresentano l’assorbanza a 660nm, i cerchi quella a 567nm. A destra la tabella con i valori dei parametri del fit sigmoidale

Se la riduzione o l’azzeramento dell’Irradianza sui campioni di H. salinarum hanno prodotto un effetto poco significativo, l’alternanza luce-buio, un’altra variazione del parametro luce testata, produce in entrambi i ceppi un effetto più marcato.

Abbiamo sottoposto sia una coltura di NRC1 che una di S9 a un Ciclo Luce-Buio di 14h e 10h rispettivamente e li abbiamo comparati ai controlli cresciuti in condizioni standard, tra cui c’è l’illuminazione continua. In Figura 3.8 sono riportati gli spettri e le curve di crescita di una coltura di NRC1. Come si vede già dall’andamento degli spettri, ma ancor meglio nelle curve di crescita e nei parametri dei fit ad esse associati, il ciclo luce-buio riduce la capacità di crescita del batterio. Il livello di saturazione viene raggiunto nelle colture

65 sottoposte all’illuminazione ciclica intorno a Abs=0.6, mentre è Abs=1.1 nelle colture standard e questa differenza si nota anche nei diversi valori dell’asintoto dei fit. La crescita in condizioni standard è più veloce nella fase esponenziale come si vede, oltre che dalla curva, dalla differenza tra i valori dei parametri b dei fit, 23.95 e 38.3 per le condizioni standard e il ciclo luce-buio rispettivamente. Analizzando le curve relative all’assorbanza a 567nm si vede che la curva del controllo (condizioni standard) nella fase stazionaria è molto più alta rispetto allo stimolato e che la distanza tra la curva a 567nm e quella a 660nm nel controllo è maggiore di quella che c’è tra le rispettive curve nel campione trattato. Questo potrebbe significare una maggiore produzione di BR nel controllo rispetto al trattato. Se si fa il rapporto tra i valori di assorbanza a 567nm e quelli a 660nm per le due diverse condizioni sperimentali e prendendo, come abbiamo fatto fin qui, il valore a 660nm come indice della popolazione batterica si ottiene una stima di BR normalizzata al numero di batteri. Il confronto dei valori ottenuti lungo la curva di crescita dice che essi sono quasi uguali e le piccolissime differenze rientrano nei valori dell’errore sperimentale di cui si è detto sopra. Quindi, effettuando questa normalizzazione la differenza tra gli andamenti delle curve a 567nm e a 660nm non sembrerebbe un’indicazione reale di una maggiore produzione di BR nel controllo rispetto ai batteri mantenuti in ciclo luce-buio. Pertanto, il ciclo Luce-Buio ha effetti notevoli sulla crescita, ma non sembra sugli altri parametri da noi misurabili.

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Figura 3.8: Effetto del Ciclo Luce-Buio sulla crescita delle colture di H. salinarum NRC1. In alto a sinistra gli spettri delle colture di controllo, cioè coltivate in condizioni di illuminazione standard. In alto a destra gli spettri di colture coltivate in alternanza di Luce (14h) - e di Buio (10h). In basso le curve di crescita delle due colture messe a confronto. In blu le colture coltivate in condizioni standard, in rosso le colture sottoposte al ciclo Luce- Buio. I quadrati rappresentano l’assorbanza a 660nm, i cerchi quella a 567nm. A destra la tabella con i valori dei parametri del fit sigmoidale

Il confronto tra le colture di S9 (Fig. 3.9), complementari a NRC1 nell’esperimento, pone subito dei problemi. In questo caso, infatti, abbiamo la presenza di picchi di batterioruberina. Non indotta dal ciclo luce-buio, o almeno non solo, perché presente anche nel controllo costantemente illuminato e, come di solito, visibile dalla prima fase stazionaria in poi. Valutazioni qualitative suggerirebbero una produzione lievemente maggiore di batterioruberina nel controllo rispetto al ciclico. Però, il ciclo luce-buio in S9, sembrerebbe non ridurre la crescita, ma solo rallentarla come si può dedurre dall’analisi dei parametri del fit che sono tutti più alti nel campione trattato rispetto al controllo.

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Figura 3.9: Effetto del Ciclo Luce-Buio sulla crescita delle colture di H. salinarum S9. In alto a sinistra gli spettri delle colture di controllo, cioè coltivate in condizioni di illuminazione standard. In alto a destra gli spettri di colture coltivate in alternanza di Luce (14h) - e di Buio (10h). In basso le curve di crescita delle due colture messe a confronto. In blu le colture coltivate in condizioni standard, in rosso le colture sottoposte al ciclo luce- buio. I quadrati rappresentano l’assorbanza a 660nm, i cerchi quella a 567nm. A destra la tabella con i valori dei parametri del fit sigmoidale

Guardando complessivamente ai dati ottenuti variando l’irradianza a cui sono sottoposte le colture si vede che un effetto consistente si ottiene per entrambi i ceppi solo per il caso ciclo luce-buio. Va considerato che le nostre colture standard da cui provengono anche i batteri che vengono inoculati nelle beute che poi sono sottoposte a tutti i trattamenti descritti, sono continuamente illuminate. Si potrebbe ipotizzare, quindi, che i batteri che sono sottoposti al trattamento di riduzione totale o parziale di irradianza riescano, lungo la curva di crescita, a innescare quei meccanismi metabolici che compensano la carenza di luce e il relativo apporto fototrofico che è conseguenza della ridotta o mancante attività della batteriorodopsina. Nel caso del ciclo luce-buio questa compensazione potrebbe

68 innescarsi nelle ore di buio, che, però, potrebbero non essere sufficienti a renderla completamente efficiente. L’apporto fototrofico di BR, però, potrebbe essere sufficiente per S9 che è un super produttore di BR; mentre in NRC1, in cui la produzione di batteriorodopsina è indotta sia dalla carenza di O2 sia dalla luce, la quantità di BR prodotta

potrebbe non essere sufficiente a garantire un apporto energetico congruo. Quindi, se la compensazione non riesce ad essere completa, NRC1 già nella prima fase stazionaria potrebbe risentire anche degli effetti della mancata produzione di BR dovuta alle ore di buio e la sua crescita ne risulterebbe compromessa, come si è visto dalle misure. S9, risente meno della mancata produzione di BR e se anche nel suo caso la compensazione può essere ridotta, l’apporto al metabolismo energetico della super prodotta BR può essere sufficiente. La sua crescita è rallentata, ma non compromessa. Sembrerebbe abbastanza anomalo che il ciclo luce-buio sia quello “più dannoso”, visto che è quello a cui sono sottoposti i batteri nel loro ambiente naturale. Questa apparente incapacità a compensarne gli effetti forse si sarebbe persa se, in successione, con i batteri sottoposti a ciclo luce-buio avessimo preparato delle nuove colture da sottoporre allo stesso ciclo. Una condizione drastica come il buio, nei nostri esperimenti, sembra essere meno drastica di un ciclo luce- buio, rafforzando l’idea che i meccanismi compensativi sono lenti e necessitano di una condizione stabile, se pur negativa, per poter andare a regime.

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