Effetto delle Nanoparticelle di TiO

Come discusso nell’introduzione la batterioruberina riveste un importante ruolo nella protezione dell’organismo dallo stress ossidativo è quindi ragionevole pensare che in una condizione di stress ossidativo ci possa essere un induzione da parte di H. salinarum nella sintesi di questo carotenoide protettivo. Per valutare se tra i parametri che influenzano le nostre colture potesse esserci in effetto da stress ossidativo ed evidenziarlo in modo massivo abbiamo utilizzato della nanoparticelle di diossido di titanio, NPsTiO2, che,

sottoposte ad illuminazione, sono in grado di indurre la produzione di specie reattive dell’ossigeno, ROS, come il perossido d’idrogeno H2O2 (Geisler et al., 2012). Queste

stesse particelle sono già state usate in letteratura su un organismo affine, Haloferax

mediterranei, nel quale hanno portato proprio ad un aumento nella sintesi di Rub

(Manikandan et al., 2013).

Inizialmente, per valutare l’effetto delle nanoparticelle di TiO2 sui batteri abbiamo usato

inoculi più piccoli rispetto ai nostri standard, (2 ml di batteri in 18 ml di terreno) per poter raggiungere concentrazioni di TiO2 paragonabili a quelle usate in letteratura. Abbiamo

quindi aggiunto 600 µl di TiO2 alle colture e ne abbiamo seguito l’andamento in parallelo a

colture di controllo senza nanoparticelle. Le misure durante la crescita con campioni così piccoli ponevano, però, dei problemi. Quindi, siamo tornati alle colture di volume standard. I risultati sono mostrati in Figura 3.13.

La presenza delle NPs TiO2 non sembra avere un effetto marcato sulla crescita di S9. Le

due colture, trattato e controllo, saturano a valori di Abs660 più o meno simili 0,71 per il

trattato contro 0,78 per il controllo e anche gli altri parametri dei fit sono simili, anche se la curva dei campioni con NPs TiO2 ha un x0 più alto e un andamento più sigmoidale. In

questo caso anche il controllo aveva una crescita lievemente inferiore al normale. Non si riscontra inoltre l’induzione della sintesi di batterioruberina nelle colture trattate. È

77 possibile che in H. salinarum intervengano sistemi di induzione diversi rispetto ad

Haloferax mediterranei sebbene le vie biosintetiche che portano a Rub siano più o meno

simili in tutti gli aloarchea. Un’altra possibilità è che le nanoparticelle di TiO2

interagiscano in maniera differente con il terreno di coltura che è diverso da quello di H.

mediterranei.

Figura 3.13: Effetto della Nanoparticelle di TiO2 sulle colture di H. salinarum S9. In alto

a sinistra gli spettri delle colture di controllo. In alto a destra gli spettri di colture coltivate in presenza di NPsTiO2. In basso le curve di crescita delle due colture messe a

confronto; in blu le colture coltivate con le nanoparticelle, NPsTiO2, in rosso le colture di

controllo, NPsTiO2 Ctr. I quadrati rappresentano l’assorbanza a 660nm, i cerchi quella a

567nm. A destra la tabella con i valori dei parametri del fit sigmoidale.

Per verificare che tipo di effetto avesse la luce sul nostro terreno con le NPs abbiamo usato un elettrodo di Clark per valutare il consumo di O2 e l’eventuale formazione di qualche

ROS durante irraggiamento con radiazione UV-Visibile. La struttura ed il funzionamento dell’elettrodo sono descritti in Materiali e Metodi. I risultati delle nostre misure sono rappresentati in Figura 3.14.

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Figura 3.14: Effetto dell’Irraggiamento con UV-Visibile sul terreno di H. salinarum in presenza di NPs TiO2. La figura mostra come varia la concentrazione di ossigeno (asse Y) nella soluzione, misurata dall’elettrodo come differenza di potenziale in mV, in funzione del tempo (asse X) espresso in secondi. A destra abbiamo le misure per la soluzione basale. A sinistra quelle per il terreno. La freccia indica il momento in cui si accende la luce.

Quando si aggiungono le nanoparticelle alla soluzione basale, avente la stessa composizione del terreno ma senza peptone, e le si irraggia con luce visibile a diversa intensità non si osserva un effetto apprezzabile sui livelli di O2 disciolto (Fig. 14, destra).

Un effetto analogo si ha irraggiando la soluzione basale con UV, ma senza particelle. La combinazione di TiO2 più irraggiamento UV determina invece un calo evidente nei livelli

di ossigeno. Misure analoghe condotte sul terreno, quindi in presenza di peptone, danno risultati diversi. L’aggiunta di TiO2 in assenza di illuminazione determina un calo limitato

e graduale della concentrazione di O2; l’irraggiamento UV del terreno in assenza di TiO2

ha invece un effetto molto più marcato sui livelli di O2. La combinazione di TiO2 e

irraggiamento UV ha un effetto altrettanto evidente sulla concentrazione di O2 nel terreno.

Le pendenze delle due curve nella fase lineare, ottenute con una regressione lineare, sono di -0.33 per il campione con il terreno con peptone e di -0.35 per il campione contenente anche le NPs, con una differenza tra gli angoli formati dalle due rette di 10 gradi. Le pendenze così calcolate sono proporzionali alla velocità di consumo di O2, quindi anche se

79 riportata in figura. Queste misure indicano che la presenza del peptone è determinante per ottenere un effetto apprezzabile sul consumo di ossigeno disciolto e forse sulla produzione di ROS e che le Nps offrono un ulteriore contributo. Per ottenere questi effetti, però, è necessario un forte irraggiamento UV, la luce Visibile i cui grafici non sono presenti in figura non ha un effetto altrettanto marcato. Però, anche se con un andamento estremamente lento la luce Visibile un minimo effetto lo produce anche nei campioni con soluzione basale e NPs. Quindi, l’effetto di stress di una normale lampada da coltura sulle cellule batteriche descritto in letteratura e non evidente sulle nostre colture, potrebbe essere dovuto o alla diversità della specie batterica o a piccole differenze nel metodo di coltura che influenzano la capacità delle NPs di assorbire la luce e produrre ROS.

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