Effetto dell’ Agitazione sulla crescita delle colture, modulazione di O

In S9 la variazione della luce non produce effetti drastici e la comparsa della batterioruberina nei nostri esperimenti, come già detto, non può essere imputata alla sola variazione delle condizioni di illuminazione. D’altra parte la presenza di questo carotenoide si evidenzia solo nelle fasi tardive della crescita, quindi potrebbe esserci un fattore induttivo. A questo punto ci siamo posti varie domande: se non è la luce, quale è il parametro nelle nostre condizioni sperimentali che comporta l’induzione di Rub? La batterioruberina si evidenzia solo nelle fasi avanzate della crescita perché c’è un induzione lenta che ne stimola la produzione solo in queste fasi o si riesce a misurarla in queste fasi perché è più alto il numero dei batteri e quindi è più “visibile”? Dopo che è stata indotta la produzione di Rub se il fattore di induzione si spegne la coltura torna durante la crescita alla situazione normale in cui la batterioruberina è limitata?

Fra i parametri che condizionano la crescita e la produzione dei pigmenti c’è la disponibilità di O2, come spiegato nell’introduzione. Quindi, per iniziare a rispondere alla

prima domanda l’altro parametro scelto è stato l’Agitazione, che contribuisce allo scambio gassoso della coltura.

Il grado di agitazione da noi usato è moderato, in linea con la consuetudine del laboratorio; sufficiente a mantenere un buon grado di omogeneità dei nutrienti e un buono scambio gassoso della coltura con l’esterno. Quest’ultimo è favorito anche dal rapporto superficie/volume usato per la coltura, come descritto in materiali e metodi. Nell’intento di ottenere un effetto cospicuo e, quindi, facilmente evidenziabile in una prima serie di esperimenti abbiamo scelto di bloccare l’agitazione. Abbiamo agitato la coltura nelle prime 48 ore dall’inoculo, in modo da consentire l’avvio della coltura, e poi abbiamo spento gli agitatori. Contemporaneamente, cercando di rispondere alla seconda domanda posta sopra,

70 abbiamo deciso di non effettuare un inoculo normale, bensì di fare un inoculo massivo. Abbiamo concentrato 100ml di una coltura in fase stazionaria e poi abbiamo diluito i batteri così trattati in terreno fresco fino a un volume standard di 200ml. Alla terza domanda in questi esperimenti si poteva dare una risposta solo se il fattore induttivo era legato allo scambio gassoso o all’omogeneità dei nutrienti. Però, se lo era, partendo da un inoculo massivo di batteri S9 che presentavano un alto livello di batterioruberina era possibile verificare l’eventuale riduzione nella capacità induttiva interrompendo lo stimolo e continuando a monitorare la crescita.

Siccome le colture di S9 che avevamo usato per indagare l’effetto del ciclo luce-buio presentavano un alto grado di produzione di Rub abbiamo deciso di utilizzarle, come inizio, nella nostra serie di esperimenti di variazione dell’agitazione. In sintesi abbiamo preso i batteri, controllo e ciclico, dell’esperimento effettuato con il ciclo luce-buio, li abbiamo separatamente concentrati e abbiamo ottenuto due nuove colture con inoculo massivo di batteri probabilmente in un diverso stato metabolico iniziale. Dopo 48h di agitazione normale abbiamo spento entrambi gli agitatori e abbiamo seguito l’evolversi della crescita nel solito modo. I risultati delle misure effettuate sono riportati in Figura 10. Lo spegnimento dell’agitazione riduce fortemente la velocità di crescita in entrambe le colture. Quindi, sebbene nel nostro sistema il rapporto superficie/volume dovrebbe assicurare uno scambio e un’omogeneità gassosa sufficiente, l’agitazione è comunque un fattore importante. Come si può notare, i picchi della batterioruberina si vedono sin dall’inizio. Questo, essendo partiti da inoculi massivi, suggerirebbe che, nelle nostre condizioni sperimentali, il numero di batteri contenenti il carotenoide è un fattore limitante per la loro misura. Quindi dovremmo misurarli in ogni coltura di S9 purché il numero sia sufficientemente alto, cosa che in condizioni standard si ottiene in fase stazionaria. Però, in molte colture a parità di crescita e quindi di numero di batteri non si evidenziano i picchi

71 caratteristici del carotenoide. Quindi, il numero di batteri non è il fattore strettamente limitante.

Figura 3.10: Effetto della Agitazione sulla crescita delle colture di H. salinarum S9. In alto a sinistra gli spettri della coltura contenente i batteri provenienti dalla coltura di controllo dell’esperimento descritto in Figura 9, indicati come [S9_Ill.std]. In alto a destra gli spettri della coltura i cui batteri erano stati in precedenza sottoposti a ciclo luce-buio, indicati come [S9_luce-buio]. In basso le curve di crescita delle due colture messe a confronto; in blu la coltura con batteri precedentemente coltivati in condizioni standard, [S9_Std], in rosso la coltura con i batteri che erano stati sottoposti al ciclo luce-buio, [S9 luce-buio]. I quadrati rappresentano l’assorbanza a 660nm, i cerchi quella a 567nm. La freccia indica il momento di interruzione dell’agitazione per entrambe le colture.

Per capire meglio l’effetto dell’agitazione sulla crescita dei batteri e sui suoi pigmenti abbiamo fatto altri esperimenti riducendo o aumentando l’agitazione rispetto alle condizioni standard. In Figura 3.11 sono riportati i risultati di due esperimenti con il mutante S9 in cui l’agitazione è stata raddoppiata e ridotta a 1/3 rispettivamente. Dopo 120h gli agitatori sono stati scambiati e le due colture sono state seguite per altre 48h. Il raddoppio dell’agitazione porta a una crescita molto rapida e praticamente in 5 giorni la

72 coltura raggiunge la concentrazione batterica di saturazione, Abs = 1.2. In condizioni di coltura standard questi valori di assorbanza sono raggiunti in circa il doppio del tempo, 240h (Fig.3.3). A questo punto lo scambio degli agitatori, cioè la repentina riduzione di velocità di agitazione da circa 1200rpm a circa 200rpm, blocca un’eventuale crescita ulteriore, anzi si misura una lieve riduzione dell’assorbanza sia a 660nm sia a 567nm. Cioè i batteri, che arrestano la loro duplicazione, non inducono rapidamente un, seppur minimo essendo S9, incremento di BR che potrebbe aiutarli a sostenere l’equilibrio energetico in carenza di O2. Nell’esperimento con ridotta agitazione si ottiene semplicemente un

rallentamento complessivo della crescita, così come osservato in molte occasioni anche per le colture di NRC1 sottoposte ad agitazione ridotta. C’è da osservare, inoltre, che il brusco cambio di agitazione non induce un altrettanto immediato cambio di velocità nella crescita. In nessuno dei due campioni di Figura 3.11, provenienti da colture stock e qualche passaggio di ambientamento, si evidenzia la presenza della batterioruberina. Nemmeno nelle colture con livelli saturanti di batteri, rafforzando l’idea che la concentrazione batterica non sia una condizione necessaria per la sua misura.

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Figura 3.11: Effetto della variazione dell’Agitazione sulla crescita delle colture di H. salinarum S9. In alto a sinistra gli spettri di colture coltivate a Agitazione ridotta a 1/3 della normale velocità. In alto a destra gli spettri di colture coltivate ad una Agitazione raddoppiata rispetto al normale. In basso le curve di crescita delle due colture messe a confronto; in blu le colture coltivate in agitazione ridotta, indicati con Agit/3; in rosso le colture sottoposte agitazione raddoppiata, 2xAgit. I quadrati rappresentano l’assorbanza a 660nm, i cerchi quella a 567nm.

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