Caratterizzazione delle strutture in gelMA elettrofilate

Una prima analisi di caratterizzazione morfologica delle fibre è stata ottenuta dalla valutazione della dimensione media delle fibre elettrofilate in funzione del tipo di processo di sintesi impiegato. Dalle immagini acquisite tramite microscopio ottico è stato possibile valutare la dimensione media delle fibre (Fig. 1B e Fig2). Le fibre di gelMA (sintetizzato con metodo One-Pot) mostrano un diametro medio pari a 0.84 ± 0.26 𝜇𝑚, mentre le fibre di gelMA (sintetizzato con metodo Convenzionale) mostrano un diametro medio pari a 1.90 ± 0.52 μm. La possibilità di ottenere fibre con diametro pari a meno della metà rispetto al metodo Convenzionale attribuisce al metodo One-Pot un ulteriore vantaggio di scelta. Fibre con diametro dell’ordine del nanometro mimano maggiormente infatti la struttura della ECM consentendo una migliore interazione scaffold-cellula [4]. Sebbene i promettenti risultati, non è stato possibile effettuare ulteriori valutazioni su strutture ottenute con metodo di sintesi One-Pot a causa di una mancata riproducibilità del processo di sintesi del materiale. Piccole variazioni del pH e condizioni ambientali non controllabili all’interno del laboratorio sono solo una parte delle probabili cause che hanno limitato la riproducibilità di tale metodo. Il metodo One-Pot infatti per quanto sotto certi aspetti risulti vantaggioso, presenta una sintesi dipendente da un numero elevato di parametri. Per tale ragione le successive valutazioni sono state eseguite sulle strutture elettrofilate in gelMA ottenuto solo con metodo Convenzionale, metodo di sintesi più affidabile e ripetibile.

Ulteriori analisi sono state condotte per valutare eventuali variazioni morfologiche della fibra elettroflilata prodotte sia dall’incubazione delle strutture elettrofilate nella soluzione di incubazione contenente il Phl sia dal processo di esposizione di agli UV.

Da immagini acquisite tramite SEM (Fig.5) è stato possibile osservare l’effetto del processo di reticolazione sulla dimensione del diametro delle fibre all’interno della struttura elettrofilata.

In tutte e tre le immagini è possibile osservare delle fibre continue e distribuite uniformemente sulla superfice, e con un buon grado di porosità, necessaria a garantire una buona distribuzione delle cellule all’interno dello scaffold. Tuttavia, è possibile però anche osservare che il processo d’incubazione nei diversi solventi combinata all’esposizione agli UV ha causato la fusione delle fibre. Tale risultato è apprezzabile soprattutto nella struttura incubata in CE, che può essere attribuita anche alla temperatura a cui sono sottoposte le strutture durante il processo di reticolazione.

Dati presenti in letteratura di strutture elettrofilate a base di gelMA e incubate in un solvente composto da etanolo e acqua ultrapura (in rapporto 9:1) e Irgacure 2959 hanno mostrato, un comportamento simile alle strutture prodotte durante questo lavoro di tesi (Fig.6).

CE

ISO40_ETA_60

ISO20_ETA80

Figura 5 Immagine SEM di strutture in gelMA elettrofilate e reticolate in CE, ISO_ETA_20_80 e ISO_ETA_40_60

Figura 6 Immagine ottenuta tramite SEM di una struttura gelMA incubata in solvente di etanolo e acqua ultrapura (in rapporto 9:1) contenente Irgacure 2959 [5]

Il grado di fusione delle fibre nelle strutture sottoposte a reticolazione in solvente d’etanolo e acqua appare anzi maggiore rispetto a quelle reticolate in CE ed ISO40_ETA60 e ISO20_ETA80. Questo risultato dimostra come le soluzioni proposte siano dei validi candidati sostitutivi agli attuali solventi utilizzati.

Ulteriori analisi sono state svolte per valutare la possibile variazione dimensionale della fibra elettrofilata prima e dopo il processo di reticolazione in funzione del tipo di solvente impiegato.

Per questa valutazione e per le successive il confronto tra i differenti solventi è stato svolto solo per le soluzioni in CE e ISO40_ETA60. La soluzione in ISO20_ETA80 non è stata ulteriormente analizzata a causa dell’eccessiva variazione dimensionale della struttura a fine processo di reticolazione.

La valutazione della variazione dimensionale delle fibre in gelMA elettrofilate è stata svolta su immagini acquisite tramite SEM, valutando il valore della dimensione media nel caso di fibre non reticolate, per fibre in gelMA incubate in ISO_ETA_40_60 e in CE (Fig. 7).

gelMA NON reticolato ISO40_ETA60 CE

Figura 7 Immagini strutture gelMA acquisite tramite SEM

Tabella 2 Dimensione media delle fibre elettrofilate in gelMA

GelMA non reticolato GelMA in

ETA40_ISO60 GelMA in CE

237 ± 61 𝑛𝑚 330 ± 81,9 𝑛𝑚 394 ± 94,2 𝑛𝑚

I dati di Tabella 2 indicano un aumento della dimensione media della fibra causato dal processo di reticolazione. Tale risultato può essere attribuito ad un “processo di swelling” verificatosi durante la fase d’incubazione della struttura in gelMA nel solvente contenente Phl e al successivo bagno delle strutture in acqua ultrapura per l’eliminazione del Phl in eccesso. L’aumento dimensionale della fibra presente nelle strutture ha trovato un riscontro in altri studi presenti in letteratura in cui il solvente utilizzato risulta l’etanolo. Da tali studi è emerso infatti un aumento del diametro della fibra pari a circa il 60% dopo il bagno delle strutture in acqua [3].

La Fig.8 mostra la distribuzione del diametro delle fibre all’interno delle strutture elettrofilate.

Figura 8 Distribuzione del diametro della fibra all'interno di strutture in gelMA elettrofilata non reticolata (A) e reticolata a seguito dell’incubazione in ISO40_ETA60

(B) ed in CE (C).

Nel grafico in Fig.8.A, ottenuto da una struttura in gelMA non reticolata, è possibile osservare un diametro delle fibre uniforme all’interno della matrice. Tale caratteristica risulta fondamentale nella realizzazione di scaffold per colture cellulari, garantendo a tutte le cellule presenti i medesimi stimoli, e quindi ottenere risultati più affidabili. Tale condizione non sembra del tutto essere garantita dalle strutture elettrofilate e sottoposte al processo di reticolazione (Fig 8B-C), soprattutto per le strutture mantenute in CE, nelle quali la distribuzione della dimensione della linea appare più ampia rispetto a quella della fibra non reticolata mostrando un diametro delle fibre non uniforme e una dimensione della fibra maggiore.

C

B

Questo risultato può essere interpretato come un’ulteriore conferma delle osservazioni rilevate dalle immagini SEM (Fig.5), che hanno mostrato una maggiore fusione delle fibre elettrofilate.

Abbiamo inoltre svolto un’analisi statistica per valutare se è presente una differenza significativa del diametro medio delle fibre tra le strutture in gelMA non reticolate e reticolate, Fig.9.

Figura 9 Analisi statistica strutture in gelMA elettrofilate

I risultati ottenuti tramite un test ANOVA sulle tre tipologie di strutture in gelMA elettrofilate hanno confermato una differenza statistica significativa tra i campioni con un p_value<0.0001.

Un’ulteriore analisi per valutare l’influenza del processo di reticolazione sulle proprietà meccaniche delle strutture elettrofilate è stata ottenuta attraverso test di trazione uniassiale. In figura 10 sono stati riportati i grafici sforzo-deformazione del gelMA non reticolato, del gelMA reticolato e precedentemente incubato rispettivamente in iso40_ETA60 (gelMA_ISO40_ETA60) e in CE (gelMA_CE).

gelMA NON retic olata gelMA _ISO 40_ET A60 gelMA _EC 0 200 400 600

Diametro medio delle fibre [nm]

Figura 10 Grafici Stress-Strain delle strutture in gelMA non reticolate (blu) e reticolate e precedentemente incubate rispettivamente in ISO40_ETA_60 (giallo) ed in CE

(arancione)

In tabella 3 sono stati riportati i valori medi dei parametri: modulo elastico (E), stress a rottura (𝜎u), strain a rottura (𝜀u), e tenacità, valutati per i campioni gelMA NON reticolato, gelMA_ISO40_ETA60 e gelMA_CE.

Tabella 3 Parametri ottenuti dai test meccanici su strutture in gelMA non reticolate e reticolate precedentemente incubate rispettivamente in ISO40_ETA60 ed in CE

E [MPa] 𝜎u [kPa] 𝜀u

Tenacità v_ywx_z{ gelMA NON reticolato 1,82±0,61 132±31 0,1±0,02 5,83±1,81

gelMA_ISO40_ETA60 7,85±4,97 185±0,5 0.28±0.12 22,4±38,7

gelMA_CE 3,64±3,58 173±73 0,25±0,03 32,4±15,6

Una prima differenza tra le strutture in gelMA non reticolate e reticolate è evidente dal parametro del modulo elastico. Le strutture reticolate ed in particolar modo le strutture gelMA_ISO40_ETA60 presentano un modulo elastico maggiore, risultando più rigide in confronto alle non reticolate. I campioni incubati in

ISO40_ETA60 sono infatti anche più facili da maneggiare rispetto alle strutture in CE dopo il bagno in acqua. L’aumento del modulo elastico delle strutture gelMA_ISO40_ETA60 può essere collegato anche alla possibile interazione del gelMA con l’etanolo. Come era evidente dall’effetto di riduzione volumetrica causato dal bagno in etanolo delle strutture elettrofilate (Fig.3), l’etanolo ha un’influenza diretta sulla variazione topologica e morfologica delle fibre che compongono la matrice. Queste osservazioni trovano conferma in studi presenti in letteratura, i quali hanno mostrato aumenti del modulo elastico (pari a 4,89±0,03 MPa) per strutture sottoposte a processo di reticolazione in solvente di etanolo rispetto alle strutture non reticolate (modulo elastico pari a 0.717± 0,001 MPa) [6]. L’aumento del modulo elastico può essere inoltre un’ulteriore conseguenza della fusione delle fibre (già osservata dalle immagini SEM, Fig.5). La loro fusione e la conseguente formazione di agglomerati di fibre più spesse pensiamo possano rendere la matrice più rigida.

Dalla tabella 6 è possibile osservare valori di stress e strain a rottura maggiori per le strutture gelMA_ISO_ETA_40_60 e gelMA_CE: Ciò implica che le strutture in gelMA reticolate sono più rigide, e più resistenti alle sollecitazioni. Tale risultato è anche confermato dall’aumento della tenacità con valori di oltre 10 volte superiori rispetto alle strutture non reticolate.

I valori di resistenza agli sforzi e di rigidezza delle strutture reticolate (soprattutto quelle in CE) risultano caratteristiche importanti nella realizzazione di scaffold per esempio per la rigenerazione epidermica. In particolare, il modulo elastico e lo strain a rottura delle strutture gelMA_CE sono simili a quelli misurati da Zhao

al. [3], i quali hanno impiegato strutture in gelMA elettrofilate per la

rigenerazione tessutale (E≈ 300 𝑘𝑃𝐴 𝑒 𝜀_u ≈ 60%). Tale risultato lascia pensare ad

una possibile applicazione futura delle matrici in gelMA_CE per la realizzazione di modelli in vitro di tessuto epidermico.

Malgrado le differenze finora presentate, i risultati ottenuti dai test meccanici non presentano una differenza statistica in termini di modulo elastico tra i campioni analizzati registrando un valore di p_value pari a 0.1252.