Ottimizzazione del processo di stampa

Il processo di stampa delle strutture in gelMA ottenute tramite tecnica di microfabbricazione PAM2 _{è stato ottimizzato valutando la dimensione della linea}

stampata in funzione della pressione e della velocità, attraverso misurazioni pre- e post esposizione agli UV.

In particolare, due diverse geometrie “square” e “serpentina” sono state analizzate (Fig. 11-12)

Figura 11: Valutazione della dimensione della linea in funzione della velocità di stampa e della pressione per la geometria "square" per linee reticolate e non reticolate

Da una prima valutazione dei grafici riportati in Fig.11, è possibile osservare, che la dimensione della linea sia reticolata che non reticolata risulta indipendente dalla velocità e presenta una dimensione di linea appartenente al range di 210÷250 𝜇𝑚.

Questo comportamento può essere legato alla ridotta viscosità della soluzione, che limita la capacità del materiale di mantenere la forma una volta estruso (“shape retention”).

Dalla valutazione dell’influenza della pressione sull’andamento dimensionale della linea è possibile è possibile osservare che all’aumento della pressione si verifica un aumento della dimensione della linea sia reticolata che non reticolata. E’ stato inoltre osservata l’influenza del processo di reticolazione sulla dimensione della linea estrusa, che risulta in generale inferiore, e con una dispersione minore attorno al valore medio, rispetto a linee non esposte alla luce UV.

Dai risultati ottenuti, risulta evidente la necessità di un’esposizione idealmente istantanea delle strutture in gelMA alla luce UV. Tale considerazione verrà maggiormente discussa nel paragrafo 3.2.3.

Stessa tipologia d’analisi è stata svolta per valutare la variazione della dimensione della linea reticolata e non, nel caso di geometria a serpentina, Fig.12.

Figura 12 Valutazione della dimensione della linea in funzione della velocità di stampa e pressione per la geometria a serpentina per linee reticolate e non reticolate

All’aumentare della velocità si osserva una diminuzione graduale della dimensione della linea estrusa.

Risultato simile è stato ottenuto per la valutazione della dimensione della linea in funzione della pressione. Anche in questo caso, come per la geometria “square”, si osserva che all’aumentare della pressione la dimensione della linea aumenta soprattutto nel caso di linee non reticolate, dimostrando ulteriormente l’effetto dell’esposizione alla luce UV sulla variazione dimensionale della linea estrusa. Un risultato rilevante, che ci consente di fare un confronto tra le due geometrie è il valore della deviazione standard. Come è possibile osservare in Fig.12, per entrambi i parametri di valutazione la deviazione standard è apprezzabilmente minore rispetto a quella valutata nel caso della geometria “square”, dimostrando come la geometria e quindi il percorso di stampa (“toolpath”), possa influire sulla qualità finale della struttura. Nel caso della geometria a serpentina l’estrusore della PAM2 _{compie un percorso continuo senza mai ripassare su di uno stesso}

punto. Per ottenere un pattern a geometria “square” l’estrusore invece è costretto a ripassare (durante la stessa stampa) su più punti precedentemente stampati. Ne

consegue dunque una maggiore deposizione del materiale e di conseguenza una variazione maggiore (dunque una deviazione standard maggiore) della dimensione della linea.

Attraverso la ripetizione successiva della geometria a serpentina (Fig. 13) sono state ottenute strutture 3D a canale, in grado di influenzare in fase di coltura cellulare la distribuzione, l’allineamento e il differenziamento cellulare.

Figura 13 Unità ripetitiva della geometria a serpentina

Diversi studi [7, 8] hanno infatti dimostrato che la geometria dello scaffold è in grado di influenzare il differenziamento cellulare come ad esempio nel caso di cellule muscolari, consentendone l’allineamento.

A tale scopo, è stato indispensabile identificare i valori dei parametri di stampa necessari all’ottenimento di una struttura a canali a partire da strutture a serpentina con una dimensione della linea estrusa pari a 200 𝜇𝑚:

- Pressione: 12 kPa;

- velocità d’estrusione: 35 mm/s;

- numero di ripetizioni del pattern elementare serpentine: 12; - lunghezza serpentina (=lunghezza canale) L: 10 mm; - spessore serpentina (=larghezza canali) s: 0.4 mm; - velocità di stampa: 35 mm/s

- tempo d’esposizione agli UV: 50 secondi.

Come è possibile osservare nella Fig.12, nella valutazione della dimensione della linea in funzione della pressione una pressione nel range da 9 a 12 kPa definisce una linea relativamente costante: si è scelto di lavorare nell’estremo superiore di questo intervallo (12 kPa) per superare il problema dell’ostruzione dell’ago durante la stampa causata da una parziale reticolazione del materiale estruso intorno alla punta dell’ago, con conseguente danneggiamento della stampa finale. Questo risultato è legato alla presenza all’interno del materiale estruso dell’LAP,

un Phl sensibile alla luce visibile. Una pressione di stampa pari a 12 kPa ha quindi consentito di estrudere più facilmente anche eventuali “clot” che avrebbero portato all’ostruzione dell’ago.

Per la scelta della velocità di stampa opportuna, sono state svolte delle valutazioni in termini di dimensione della linea estrusa e del tempo di stampa. Nello specifico, la velocità di stampa ottimale doveva:

- garantire un diametro della linea estrusa abbastanza ridotto in modo da consentire alle cellule coltivate sullo scaffold di risentire della geometria della struttura;

- ridurre il tempo di stampa dell’intera struttura, in modo da evitare l’evaporazione del solvente prima dell’esposizione alla luce UV.

La velocità da noi scelta pari a 35 mm/s ha permesso di ottenere linee di diametro pari a circa 200 𝜇𝑚 in un tempo totale di stampa di 20 secondi garantendo la completa reticolazione della struttura.

In Fig.14, è possibile osservare il risultato di un singolo strato di gelMA estruso ed esposto agli UV secondo i parametri ottimali di stampa, dal quale è stata valutata la dimensione media della linea pari a 213,3 ± 14,2 𝜇𝑚.

Figura 14: Immagine acquisita da microscopio ottico della struttura in gelMA fabbricata tramite PAM2 _{con parametri ottimali.}

Il tempo d’esposizione alla luce UV di 50 secondi è stato definito il migliore in quanto permette la completa reticolazione della struttura.

L’ultima analisi svolta per la realizzazione di strutture 3D si è focalizzata sul definire il metodo migliore di deposizione strato per strato del gelMA.

Nella realizzazione di uno strato e del successivo sono state valutate due opzioni: 1. stampare uno strato e il successivo sfasato;

2. stampare due strati uguali e sovrapposti e gli altri due successivi sfasati. La scelta definitiva è ricaduta sulla seconda possibilità in quanto abbiamo osservato che quest’ultima consente di ottenere una struttura più compatta e robusta.

In definitiva, gli scaffold che siamo stati in grado di ottenere tramite processo di biofabbricazione PAM5 _{sono strutture 3D da 20 strati in gelMA, ottenute} dall’estrusione ripetuta di due strati sovrapposti e uguali e altri due sfasati con sfasamento pari a s/2, della dimensione di 10 mm x 10 mm e spessore 60 𝜇𝑚 e reticolati con esposizione a luce UV strato per strato per 50 secondi (Fig.15).

Figura 15 Scaffold in gelMA da 20 strati ottenuto tramite tecnica di biofabbricazione PAM2

Come è possibile notare dalla Fig.15 le strutture ottenute risultano trasparenti: questo è un risultato vantaggioso nel caso in cui si vogliano inserire all’interno del materiale delle nanoparticelle fluorescenti in grado di fungere da sensori di parametri cellulari.