2. Materiali e metodi
2.2 Nano fabbricazione del gelMA
2.2.2 Reticolazione del GelMA elettrofilato attraverso esposizione agli UV
Successivamente al processo di elettrofilatura, al fine di rendere le strutture elettrofilate resistenti in ambiente fisiologico è stato necessario sottoporle ad un processo di reticolazione attraverso esposizione a luce UV.
Il processo di reticolazione prevede un bagno iniziale delle strutture elettrofilate in una soluzione contenente fotoiniziatore (PI) per un certo intervallo di tempo, seguito dall’esposizione delle strutture elettrofilate a luce UV. Successivamente i campioni vengono immersi in acqua ultrapura per favorire sia l’eliminazione del Phl in eccesso e per valutare l’effettiva reticolazione del gelMA.
L’intero processo è rappresentato in Fig.2.
Figura 2 Descrizione schematica del processo di reticolazione del gelMA
Gli aspetti chiave di questo processo consistono nell’identificazione: - del tipo e della concentrazione ottimale del Phl;
- di una soluzione d’incubazione in cui il Phl è solubile e che non alteri le proprietà chimico-fisiche della struttura elettrofilata;
- del tempo d’incubazione ottimale della struttura elettrofilata nella soluzione contenente Phl;
d’incubazione;
- del tempo d’esposizione agli UV e il tipo di lampada ad UV impiegata.
Il Phl selezionato per il processo di reticolazione delle strutture in gelMA elettrofilate è il 2-idrossi-1-[4- (idrossietossi)fenil]-2-metil-1-propanone, (Irgacure 2959, Sigma Aldrich) come riportato da [3-6].
In letteratura diversi studi prevedono l’utilizzo di etanolo o di etanolo miscelato con acqua come solvente contenente Phl in diverse concentrazioni [4-7]. Mediante delle prove preliminari abbiamo, però, potuto osservare che l’utilizzo di etanolo provoca un rimpicciolimento importante (maggiore del 50%) della struttura elettrofilata. Pertanto, per poter ovviare a questo problema, altri diversi solventi sono stati analizzati. In particolare, nella selezione del solvente sono stati tenuti in considerazione i seguenti aspetti:
- assenza di variazioni dimensionali della struttura elettrofilata una volta in bagno nel solvente;
- elevata solubilità del Phl nel solvente
Nello specifico, in questo lavoro di tesi sono stati analizzati: il carbonato di etilene (CE, Sigma Aldrich) e soluzioni di isopropanolo-etanolo (Sigma Aldrich) in diversi rapporti volumetrici.
à Carbonato d’Etilene
Il CE (Fig.3) è un composto organico, classificato come estere carbonato di etilenglicole e acido carbonico, avente formula CWHQOW. Questo materiale è caratterizzato da una temperatura di transizione vetrosa di 37°C, al di sopra della quale il CE si trasforma da solido cristallino, inodore e incolore a liquido. L’elevata solubilità in acqua consente l’eliminazione dei suoi residui in eccesso dalle strutture in gelMA durante il bagno in acqua ultrapura a conclusione del processo di reticolazione delle strutture [8].
Figura 3 Struttura chimica del CE
L’Irgacure 2959 è stato disciolto in diversi volumi di CE (1, 3, 4, 5, 7, 10, 30 mL) e a diverse concentrazioni (0.05, 0.1, 1, 2, 4 p/v) e mantenuto in agitazione su un agitatore magnetico a 50 °C fino al suo completo scioglimento. Prima di immergere la struttura elettrofilata al suo interno, la temperatura della soluzione di CE contenente il Phl è stata portata a 37 °C per ridurre eventuali degradazioni termiche della struttura elettrofilata.
Un campione di gelMA elettrofilato (1cm x 1 cm) è stato quindi immerso nel CE contenente il Phl e tenuto in incubazione per 1h. Il campione di gelMA è stato successivamente prelevato tramite una spatola preriscaldata a 37°C (per prevenire la formazione di cristalli nel CE) posto su un vetrino copri oggetto ed esposto a luce UV (365 nm) in un bromografo (RS 555-279) preriscaldato lasciando le lampade in funzione per 3 minuti. In particolare, diversi tempi di esposizione sono stati testati (1, 2, 3, 4, 5 minuti per lato).
Dopo l’esposizione ad UV il campione è stato sciacquato in acqua ultrapura a temperatura ambiente in modo da eliminare il Phl ed il CE in eccesso e da valutare l’effettiva reticolazione del gelMA elettrofilato. I campioni ottenuti dopo il risciacquo sono stati lasciati essiccare a temperatura ambiente.
à Isopropanolo ed Etanolo a diversi rapporti volumetrici
Diversi rapporti volumetrici Isopropanolo-Etanolo sono stati testati (30%- 70%, 40%-60%, 50%-50%, 60%-40%, 70%-30%, 80%-20%, 90%-10%). A causa della ridotta solubilità in isopropanolo, l’Irgacure 2959 è stato inizialmente disciolto in etanolo in diverse concentrazioni (10, 12.5, 17 p/v) e mantenuto in agitazione su un agitatore magnetico a temperatura ambiente fino al suo completo scioglimento. Diversi volumi di isopropanolo sono stati quindi aggiunti alla soluzione di etanolo e Phl. Successivamente un campione
isopropanolo-etanolo contenente il Phl e tenuto in incubazione (in agitazione su uno shaker circolare) per 1h a temperatura ambiente. Il campione di gelMA, posto su un vetrino coprioggetto, è stato esposto a luce UV (365 nm) in un bromografo a diversi tempi (1, 2, 3 minuti per lato). Infine, il campione è stato sciacquato in acqua ultrapura a temperatura ambiente in modo da eliminare il Phl ed il solvente in eccesso e da valutare l’effettiva reticolazione del gelMA. I campioni ottenuti dopo il risciacquo sono stati lasciati essiccare a temperatura ambiente.
E’ bene notare, che per il processo di reticolazione, l’analisi è stata svolta solo su campioni ottenuti mediante metodo di sintesi Convenzionale, a causa della mancata riproducibilità della sintesi di gelMA con metodo One-Pot.
2.2.3 Caratterizzazione delle strutture elettrofilate con gelMA
ottenuta con metodo Convenzionale
La morfologia delle fibre pre- e post-reticolazione è stata analizzata su immagini acquisite attraverso la tecnica di Microscopia a Scansione Elettronica (SEM) (Philips XL20, 10kV). I campioni (n=3), prelevati da posizioni diverse dell’intera struttura elettrofilata, sono stati rivestiti con uno strato di oro. La dimensione delle fibre è stata determinata su 3 immagini per tipologia di reticolazione, considerando 30 punti selezionati in maniera casuale.
Le proprietà meccaniche degli scaffold di GelMA sono state determinate attraverso test di trazione uni-assiale su 2 campioni (4 mm x 5 mm) per processo di reticolazione in CE, e 3 campioni (4 mm x 5 mm) per processo di reticolazione in isopropanolo-etanolo (in rapporto 4:6), usando una cella di carico da 10 N e una velocità di deformazione del 10% s-1.
Dall’esecuzione dei test meccanici è possibile calcolare un grafico sforzo (stress) deformazione (strain) che consente di definire il comportamento meccanico di un materiale sottoposto all’azione di una forza esterna.
𝜎 = 𝐹
𝐴1 [𝑃𝑎] (1)
dove F, è la forza applicata sul provino (misurata in N) e 𝐴1 è l’area della sezione iniziale (misurata in m2) del provino ortogonale al carico (misurata in m2).
Lo strain (ε) del materiale è calcolato come (2):
𝜀 =𝐿 − 𝐿1
𝐿1 (2)
dove con L si intende la lunghezza del provino dopo la deformazione e 𝐿1 la lunghezza iniziale dello stesso.
In Fig.4 è riportata una curva Stress-Strain rappresentativa per il test di trazione uniassiale.
Figura 4 Grafico caratteristico Stress-Strain
Il primo tratto lineare (corrispondente a bassi valori di strain) definisce un comportamento elastico del materiale a cui, a sua volta, è associata una deformazione elastica. In questo tratto il materiale sottoposto ad una sollecitazione si deforma in maniera reversibile, ritornando alla forma iniziale quando la sollecitazione viene rimossa. Solitamente esiste un valore per ogni sollecitazione del materiale, detto limite elastico, oltre il quale la deformazione
deformazione residua viene chiamata deformazione plastica. Se sottoposto ancora a stress il provino può anche giungere a rottura [9].
In particolare, i parametri che vengono calcolati principalmente sono:
- Modulo di Young (o modulo elastico): misurato in Pascal, definisce il rapporto tra la sollecitazione e la deformazione nel primo tratto lineare della curva stress-strain.
- Punto di snervamento: è il valore di sollecitazione associato ad una deformazione plastica dello 0,2%.
- Stress massimo: valore massimo della sollecitazione nominale raggiunta nel diagramma sollecitazione-deformazione.
- Stress a rottura: valore dello sforzo al quale si verifica la rottura del campione.
- Strain a rottura: entità dell'allungamento subìto dal campione durante il test fino alla sua rottura; è un parametro che permette di determinare il tipo di materiale, se fragile o duttile.
- Tenacità: la capacità del materiale di assorbire energia e di deformarsi plasticamente prima della rottura; nel grafico rappresenta l’area sottesa dalla la curva sforzo-deformazione a rottura.
Inoltre, sia per i test meccanici che per la valutazione dimensionale delle fibre pre -post reticolazione è stata effettuata un’analisi statistica con software “Prism”.