Scaffold in gelMA con Soft Lithography

Gli scaffold in gelMA ottenuti attraverso la tecnica di Soft-Lithography sono stati prodotti depositando una soluzione di gelMA su uno stampo in polidimetilsilossano (PDMS).

La membrana in PDMS è stata realizzata durante il lavoro di tesi di dottorato della Dott.ssa Gattazzo,

In Fig.15, è stato riportato schematicamente il procedimento di produzione della membrana in PDMS.

Il photoresist è stato deposto su un wafer di silicio producendo uno strato di spessore pari a 40 μm (a). Per definire il modello desiderato sul wafer di silicio è stata impiegata una maschera composta da tre ripetizioni di strisce parallele di larghezza rispettivamente di 50, 100 e 200 μm con un interspazio di 100 μm, tramite la quale dopo un’esposizione agli UV è stato ottenuto lo stampo master (b).

A questo punto la soluzione in PDMS è stata colata sul wafer e riscaldata per consentire la polimerizzazione(c).

Figura 15 Schema del processo di fabbricazione di substrati in gelMA con tecnica di Soft Lithography

La geometria impressa sullo stampo in PDMS rappresenta il negativo della struttura finale ed è dunque composta da tre ripetizioni di linee parallele della larghezza di 50-100-200 µm con interspazio di 100 µm e una profondità di 40 µm, Fig.16.

Figura 16 Immagine acquisita tramite microscopio ottico con ingrandimento 4 X. L’immagine rappresenta la membrana in PDMS impiegata come stampo per le strutture in gelMA ottenute con tecnica di Soft Lithography

Il materiale utilizzato quindi è stato ottenuto dissolvendo gelMA (sintetizzata attraverso il metodo Convenzionale) al 10% p/v e Irgacure 2959 all’1% p/v in PBS a circa 50 °C fino al completo scioglimento del gelMA e del Phl. La soluzione ottenuta è stata distribuita uniformemente sullo stampo in PDMS posto all’interno di una piastra di Petri e successivamente raffreddata a 4°C per 10 min per consentire la gelificazione del gelMA prima dell’esposizione alla luce UV.

Infine, la piastra di Petri, contenente la membrana in PDMS con sopra la soluzione in gelMA, è stata posizionata all’interno del fornetto ad UV (365 nm, UVP-CL-100- Ultraviolet Crosslinker), a minima distanza dalle lampade ed ivi esposta per 40 minuti.

Dopo l’esposizione, per consentire l’eliminazione di Phl in eccesso, il gelMA reticolato è stato posizionato su una piastra a 40 °C ed è stata aggiunta acqua

3 linee da 200 µm

3 linee da 100 µm

ultrapura per circa 15 minuti al termine dei quali si è provveduto a staccare il gelMA dallo stampo in PDMS.

Dalla membrana in gelMA sono state carotate strutture quadrate delle dimensioni di 10mm x 10mm.

Sugli scaffold idratati con acqua ultrapura a 37 °C per 15 minuti è stata effettuata una valutazione della larghezza media delle linee tramite acquisizioni con microscopio ottico con ingrandimento a 10X (1 immagine per tipo di linea) e successiva elaborazione dei dati (30 valutazioni per immagine) mediante software ImageJ.

Le proprietà meccaniche delle strutture ottenute per Soft Lithography sono state determinate attraverso test di trazione uniassiale come precedentemente descritto per gli scaffold elettrofilati. Nello specifico sono stati testati 3 campioni di dimensione 4 mm x 6 mm, Fig.17.

Figura 17 Esempio di campione di gelMA ottenuto per Soft Lithography impiegato per i test a trazione uniassiale

Ulteriori analisi sono state effettuate per valutare il grado di swelling delle strutture in gelMa carotate in dischetti da 5 mm a differenti intervalli di tempo (15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 300, 420 minuti), Fig.18.

Figura 18 Struttura in gelMA di 5 mm x 5 mm impiegata per la valutazione del grado di swelling

Per la valutazione del grado di swelling è stata impiegata la formula (3):

𝐷% = W1 _W− W2

2 × 100% (3)

Con D% grado di swelling e W0 peso iniziale a secco del gelMA e Wt peso a secco

dopo un tempo t.

Sia nel caso dei test meccanici che nei test di swelling campioni privi di pattern superficiale sono stati utilizzati come controllo.

Inoltre, per entrambi i test sono state effettuate delle analisi statistiche con software “Prism” per valutare la presenza di differenze significative tra le strutture analizzate con e senza pattern.

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