3. Risultati e discussioni
3.3 Risultati con tecnica di micro fabbricazione Soft Lithography
3.3.2 Caratterizzazione delle strutture in gelMA
I risultati dei test di swelling effettuati sulle strutture in gelMA idratate con pattern (ottenute attraverso il processo di Soft lithography) e senza pattern (usate come controllo) sono mostrati in Fig.23.
Le strutture in gelMA senza pattern dopo una prima fase iniziale di swelling raggiungono un plateau dopo 7 ore con un grado di swelling pari a circa il 400%. Le strutture in gelMA con pattern hanno mostrato un comportamento simile alle precedenti con il raggiungimento del plateau dopo 7 ore e con un grado di swelling leggermente superiore pari a circa il 460%.
Figura 23 Grafico del grado di swelling per strutture in gelMA con pattern e senza pattern
Dai risultati ottenuti si osserva un aumento del grado di swelling nelle strutture in gelMA con pattern. Questo risultato può essere attribuito ad un aumento dell’area superficiale della struttura, causata dalla presenza dei canali all’interno della matrice in gelMA.
I risultati dei test meccanici a trazione uniassiale svolti sulle strutture in gelMA idratate sono descritti in Fig.24 e riassunti in tabella 4.
Tabella 4 Risultati dei parametri meccanici ottenuti dai test meccanici a trazione uniassiali applicati a strutture in gelMA con pattern (SI_patter) e senza pattern (NO_pattern).
E [kPa] 𝜎u [kPa] 𝜀u Tenacità vywxz{ NO_pattern 63,17 ± 29 16,8 ±1,6 0,48±0,15 5 ±1,7
SI_pattern 36,44 ± 4,9 29,9±13,2 0.83±0.2 11,6±0,6
Le strutture senza pattern risultano più rigide con un modulo elastico pari a circa il doppio rispetto alle strutture con pattern, anche se l’elevata deviazione standard non consente di ottenere differenze statisticamente significative (t-test, con p value di 0.19) (Fig.25).
Figura 25: Istogramma dei moduli elastici ottenuti da test meccanici a trazione uniassiale per strutture in gelMA senza pattern (NO_pattern) e con pattern (SI_pattern).
Ulteriori analisi statistiche sono state effettuate per valutare i parametri di stress e deformazione a rottura e di tenacità (Fig.26). Anche in questo caso non si osservano differenze significative tra gelMA con e senza pattern per ognuno dei parametri valutati. Questo risultato può essere causato dalla profondità ridotta (40 𝜇𝑚) dei canali rispetto allo spessore complessivo della struttura in gelMA (di circa 325 𝜇𝑚).
Eventuali differenze nella validazione biologica quindi potranno essere attribuite alla presenza dei canali e non a variazioni delle proprietà meccaniche locali o globali. SI_p atte rn NO_p atte rn 0 20 40 60 80 100 E, [kPa]
Figura 26: Istogrammi dei parametri di Stress, strain a rottura e tenacità delle strutture in gelMA con e senza pattern
SI_p atte rn NO_p atte rn 0 10000 20000 30000 40000 50000
Stress a rottura, [Pa]
Si_p atte rn NO_p atte rn 0.0 0.5 1.0 1.5 Strain a rottura SI_p atte rn NO_p atte rn 0 5000 10000 15000 20000 Te n ac it à, [ J/ m ^ 3]
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4. Colture cellulari
Le colture cellulari sugli scaffold ottenuti tramite tecnica PAM2 e Soft Lithography
sono stati eseguiti dal Dott. Cidonio del Bone & Joint Research Group dell’Università di Southampton.
4.1 Materiali e metodi
Cellule staminali mesenchimali estratte da midollo osseo umano (hBMSCs) sono state coltivate sugli scaffold di dimensione 10 mm x 10 mm.
Ogni scaffold è stato sterilizzato in etanolo al 75% per 20 minuti e successivamente è stato esposto a luce UV per 30 minuti per lato e sottoposto a lavaggio in PBS (3 volte). Infine, è stato tenuto in incubazione nel terreno di coltura overnight.
Due differenti terreni di coltura sono stati utilizzati:
- terreno di coltura basale: composto dal 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% Penicillina/ Streptomicina e alpha-MEM MEDIA (Lonza);
- terreno di coltura osteogenico: ottenuto aggiungendo al terreno di coltura basale 50 𝜇M di vitamine D3, 100 𝜇M di ascorbato 2-phosphato e 50 𝜇M di desametasone.
Dopo un trattamento con tripsina e collagenasi IV, le hBMSCs sono state coltivate con una densità pari a 0.2 x 106 cellule/scaffold e lasciate aderire per 3 ore al
termine delle quali il mezzo di coltura è stato sostituito.
Tutti gli esperimenti descritti di seguito sono stati eseguiti a 37°C, e in atmosfera controllata (5% CO2 e mantenendo un’umidità relativa del 90%).
4.2 Vitalità cellulare
La valutazione della vitalità cellulare è stata svolta su quattro scaffold (due per tecnica di fabbricazione) ed è stata valutata nei giorni 1 e 7 su un terreno di
soluzione contenente calceina acetoxymethylester (Sigma) ed ethidium homodimer-1 (EH-1, Sigma) ad una concentrazione rispettivamente di 0.6 𝜇l/ml and 2 𝜇l/ml. Successivamente gli scaffold sono stati lavati in PBS e analizzati al microscopio confocale (CLS, Leica, SP5) usando un obiettivo da 10 e 20X.
La vitalità cellulare è stata quantificata usando la formula (1):
Cellule vive − cellule morte
Cellule vive ∗ 100 (1)
Le immagini acquisite sono state successivamente analizzate per quantificare l’orientamento della distribuzione cellulare sulla superficie degli scaffold impiegando il plugin “Directionality” del software Fiji.
4.3 Valutazione dell’osteogenesi
L’osteogenesi è stata valutata quantificando l’attività dell’enzima ALP (Fosfatasi Alcalina) al giorno 1 e 7 nel terreno di coltura basale e nel terreno di coltura osteogenico.
La valutazione dell’attività enzimatica del ALP è stata valutata secondo il seguente protocollo. Gli scaffold sono stati inizialmente lavati in PBS e fissati in etanolo (95%) per 10 minuti. Dopo essere stato rimosso, l’etanolo residuo è stato lasciato evaporare per 30 minuti. Successivamente il colorante Fast violet salt (Sigma, 0.0024g), la soluzione alcalina fosfato Naphtol AS-MX (Sigma, 400 µl) e acqua ultrapura (9.6 ml) sono stati miscelati e 1 ml di questa soluzione è stata aggiunta in ogni pozzetto. La reazione è stata condotta a 37°C per 1 ora. La soluzione è stata successivamente saturata con PBS per bloccare la reazione. I campioni sono stati visualizzati mediante microscopio Zeiss Axiovert 200 light con obiettivi di 5 e 10X.
4.4 Risultati e discussioni
4.4.1 Vitalità cellulare
Figura 1 (A) Immagini ottenute tramite microscopio confocale per la valutazione della vitalità cellulare delle hBMSCs su scaffold ottenuti tramite tecnica PAM2 (PAM) e
SoftLithography (SL) al giorno 1 (D1) e 7 (D7). Scalebar: 100𝜇𝑚 (B) Grafico che definisce la vitalità percentuale ottenuta dalla formula (1)
Come possiamo osservare in Figura 1(B), le cellule coltivate sugli scaffold ottenuti tramite fabbricazione PAM2 e Soft Lithography hanno dimostrato un’elevata
vitalità cellulare (pari a circa il 95%) con un ridotto numero di cellule non vitali (Figura 1 A). Il soma allungato delle cellule seminate e la presenza di filopodia, al giorno 1 e 7, hanno confermato che le cellule hanno aderito sugli scaffold sia ottenuti tramite tecnica PAM2 che con Soft Lithography.
Come è possibile osservare dalla Figura 1 un allineamento delle cellule all’interno dei canali è maggiormente apprezzabile negli scaffold ottenuti tramite tecnica di Soft Lithography, evidente soprattutto al giorno 7. Differente appare la risposta delle cellule ottenute tramite tecnica di fabbricazione PAM2, nella quale si osserva
un allineamento ridotto e non apprezzabile al giorno 7. Questo comportamento pensiamo possa essere attribuito ad una variazione strutturale degli scaffold durante gli esperimenti. È stato osservato infatti che gli scaffold PAM2 in terreno
di coltura tendono a ripiegarsi su se stessi limitando in tal modo l’allineamento delle cellule lungo i canali presenti sulla superficie degli scaffold. Un’ulteriore conferma è stata ottenuta dalla valutazione effettuata tramite software Fiji (Figura 2).
I grafici definiscono la percentuale di cellule che hanno risentito dell’allineamento provocato dalla presenza del pattern sulla superficie dello scaffold. Negli scaffold ottenuti per Soft Lithography osserviamo una percentuale di cellule allineate lungo i canali del 4,5% e del 5% rispettivamente per il giorno 1 e 7. Gli scaffold ottenuti tramite tecnica PAM2 mostrano invece un allineamento percentuale delle
cellule del 2.3% e 2% rispettivamente al giorno 1 e 7. I risultati confermano quanto già osservato nelle Fig. 2. Le cellule negli scaffold PAM2 al trascorrere del
tempo mostrano una riduzione dell’allineamento, al contrario negli scaffold ottenuti tramite Soft Lithography si osserva una maggiore distribuzione delle cellule lungo i canali dello scaffold al giorno 7 rispetto al giorno 1.
D1 D7
PAM
SL
Figura 2 I grafici definiscono la percentuale di cellule distribuite lungo le fibre degli scaffold ottenuti per tecnica PAM2 (PAM) e Soft Litography (SL) al giorno 1 (D1) e al giorno 7 (D7).