Congelamento di un ridotto numero di spermatozo

I metodi convenzionali di crioconservazione non sono adatti per il congelamento di un numero ridotto di spermatozoi, dal momento che l’eccessiva quantità di crioprotettore ne renderebbe difficoltoso il recupero. Per questo sono stati messi a punto una serie di supporti, biologici e non, per evitare la perdita di spermatozoi durante il congelamento di aliquote di pochi spermatozoi.

• La zona pellucida

L’utilizzo della zona pellucida vuota per contenere spermatozoi da crioconservare è una tecnica messa a punto da Cohen et al. (1997) per la prima volta. E’ la tecnica più utilizzata per crioconservare un numero ridotto di spermatozoi. Per prima cosa si deve eliminare il citoplasma di ovociti umani o animali. Successivamente si selezionano degli spermatozoi dal campione e, mediante una pipetta per ICSI, vengono depositati nella zona pellucida di questi ovociti. Viene utilizzato il glicerolo come crioprotettore. Successivamente si pongono gli ovociti in azoto liquido o crioconservati con il metodo del congelamento lento.315 Sono stati utilizzati con successo anche ovociti umani316. I vantaggi di questa tecnica sono: può essere utilizzata nei casi gravi di oligo o azoospermia; le zone possono essere manipolate facilmente; i crioprotettori possono essere aggiunti e rimossi senza disperdere o diluire gli spermatozoi; è un’operazione semplice recuperare gli spermatozoi una volta scongelati gli ovociti. Tra i limiti che presenta questa tecnica c’è il danno degli spermatozoi dovuto all’utilizzo di ovociti umani come supporto.310

• Micro-paillettes

A volte il prelievo chirurgico di sperma dall’epididimo e dal testicolo permette un singolo tentativo di IVF così si è pensato all’utilizzo di “micro- paillettes” per criopreservare piccole aliquote di sperma. In queste paillettes viene posta una aliquota di 15–20-µl di sperma mista al crioprotettore. 5 o 6 paillettes vengono poste a contatto con i vapori di azoto liquido per 30 minuti e successivamente posti al suo interno (-196 °C).

• Microgocce

Dal momento che con l’utilizzo di micro-paillettes c’è la possibilità di creare aderenze tra lo sperma e il suo contenitore, è stata sperimentata la tecnica di criopreservazione di sperma in microgocce.317 _{Aliquote di 50 or 100 µl di sperma}

misto al crioprotettore vengono poste su piastre d’acciaio o su superfici di ghiaccio secco e immerse direttamente nell’azoto liquido. Questa tecnica si è dimostrata efficace nella tecnica ICSI allo stesso modo come quando si impiegano spermatozoi freschi. In uno studio del 2008 è stato possibile crioconservare con questa metodica spermatozoi ottenuti mediante TESA e fecondare 9 di 51 ovociti.318 Quintans et al. (2000) sono stati in grado di crioconservare 4-6 spermatozoi selezionati in

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microgocce e dopo lo scongelamento il tasso di recupero di spermatozoi è stato del 90-100%315.

• ICSI Pipettes

E’ stato proposto anche l’uso di pipette utilizzate nella tecnica di fecondazione in vitro ICSI per criopreservare aliquote di 5-50 spermatozoi. Questa tecnica però non è conveniente per la crioconservazione per lunghi periodi di tempo. Inoltre le pipette sono fragili e possono rompersi facilmente.

• Sfere di Volvox Globator

Si è pensato di utilizzare le sfere dell’alga Volvox Globator che consistono in strutture globulari di 1500-20000 cellule, come contenitori degli spermatozoi per poi criopreservarli. Secondo lo studio di Just et al., 2004, sono stati iniettati con aghi utilizzati per la procedura ICSI, 8 spermatozoi in ogni sfera che poi sono state poste nelle paillettes contenente crioprotettore. Successivamente sono state immerse in azoto liquido. Il 100% degli spermatozoi sono stati recuperati e > 50% avevano mantenuto la loro motilità dopo lo scongelamento319. La FDA e la

European Tissue Directive hanno però stabilito che non è possibile utilizzare le alghe nelle tecniche di crioconservazione.315

• Microcapsule di alginato

Si è pensato alla possibilità di immagazzinare gli spermatozoi in microcapsule di alginato, un polisaccaride non tossico composto di unità ripetute di acido mannuronico e guluronico. Spermatozoi misti al crioprotettore sono stati uniti all’acido alginico per poi formare le microcapsule. Queste, contenenti gli spermatozoi, sono state poi poste nel CPA e congelate. Una volta dissolte le sfere di alginato è stato possibile isolare gli spermatozoi.320 Si pensa però che l’alginato possa incidere negativamente sulla motilità degli spermatozoi. Questo potrebbe essere un problema nel momento in cui si vogliono congelare campioni di spermatozoi che già presentano alterazione della motilità.315

• Cryoloop

Si è pensato anche di crioconservare piccole quantità di spermatozoi utilizzando il cryoloop, un supporto di nylon, inerte e non biologico.305 _{Con questa tecnica è}

possibile vitrificare quantità di sperma dell’ordine di 10-1_-10-2 _{µl. Il vantaggio che}

ha questa tecnica è che non danneggia la motilità degli spermatozoi tanto che questa, negli spermatozoi crioconservati in cryoloop, è stata trovata simile a quella degli spermatozoi congelati con la tecnica del congelamento lento. Il cryoloop insieme agli spermatozoi viene immerso direttamente nell’azoto liquido e dal momento che gli spermatozoi non sono incapsulati, recuperarli è molto semplice. Il rischio maggiore della conservazione utilizzando come supporto il cryoloop è il fatto che si tratta di un sistema aperto e c’è il rischio di contaminazione dei campioni di spermatozoi da parte dell’azoto liquido. Si sta quindi cercando il modo di sviluppare supporti di cryoloop chiusi.

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Isaev et al. (2007) hanno utilizzato come supporto per la crioconservazione di una piccola quantità di spermatozoi microsfere di agarosio. Queste contenevano 1-10 spermatozoi e dopo essere state poste in una soluzione contenente un crioprotettore sono state immerse nell’azoto liquido, con una percentuale del 78% di spermatozoi recuperati con preservata motilità. L’agarosio, come i cryoloop, rappresenta un altro supporto non biologico inerte che potrebbe essere utilizzato in futuro nella pratica clinica.315