CALCOLATO (ml) VALORI NORMALI VOLUMI (ml) GRUPPO A 1 0.4 0.45±0.1 2 0.58 0.5±0.13 3 0.48 0.52±0.18 4 0.5 0.59±0.15 5 0.67 0.66±0.18 6 0.57 0.67±0.24 7 0.62 0.67±0.24 8 0.7 0.8±0.48 9 1.11 1.35±1.14 10 0.6 1.35±1.14 GRUPPO B 11 0.29 0.45±0.1 12 0.3 0.47±0.09 13 0.33 0.45±0.1 14 0.4 0.52±0.18 15 0.14 0.52±0.18 16 0.17 0.59±0.15 17 0.35 0.58±0.15 18 0.44 0.59±0.15 19 0.28 0.66±0.18 20 0.35 0.66±0.18 21 0.46 0.64±0.18 22 0.5 0.64±0.2 23 0.32 0.78±0.46 24 0.5 0.78±0.46 25 1.35 1.35±1.14 ABBREVIAZIONI:
VT (ml) : Volume del testicolo criptorchide
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Tabella 11. Caratteristiche delle popolazioni nei pazienti affetti da criptorchidismo. Riduzione VT p=0.03 Pz FIBROSI p=0.87 T MB p=0.57 ANISO p=0.31 n. TWS p=0.33 n. SP p=0.33 C S/T p=0.49 FI p=0.33 GRUPPO A 1 1 0 1 8 23 20.62 0.46 2 2 0 1 10 15 24.0 0.30 3 1 1 0 13 56 28.84 1.12 4 2 1 1 13 46 29.84 0.92 5 0 0 0 35 92 23.74 1.84 6 1 1 1 41 123 25.02 2.46 7 2 1 1 35 62 24.6 1.24 8 1 1 1 26 38 23.19 0.76 9 2 1 2 32 48 24.16 0.96 10 2 1 2 20 43 23.76 0.86 GRUPPO B 11 2 0 1 10 37 25.3 0.74 12 2 1 1 12 44 22.75 0.88 13 2 1 1 10 63 26.2 1.26 14 2 1 1 11 29 23.27 0.58 15 0 0 0 12 37 21.91 0.74 16 2 1 2 7 15 26.57 0.30 17 1 1 1 21 27 24.5 0.54 18 1 1 1 42 87 22.75 1.74 19 2 1 1 41 106 23.41 2.12 20 1 1 1 26 60 24.2 1.20 21 1 1 1 29 63 25.68 1.26 22 1 1 1 22 45 24.28 0.90 23 1 0 1 26 31 23.84 0.62 24 2 1 1 32 70 27.18 1.40 25 2 1 1 17 27 29.6 0.54 ABBREVIAZIONI: Pz : paziente
T MB: spessore della membrana basale ANISO: anisometria
n.TWS: Numero di tubuli con spermatogoni n. SP: Numero di spermatogoni
C S/T: Cellule del Sertoli per tubulo FI: Fertility Index
NOTA: per calcolare il p value dei parametri: n.TWS, n. SP, C S/T, FI, è stato utilizzato T test sulla media;
per calcolare il p value dei parametri: fibrosi, T MB, anisometria, è stato utilizzato il chi quadro.
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Tabella 12. Confronto tra il Fertility Index riscontrato nei due gruppi e i valori normali del Fertility Index. PAZIENTE FERTILITY INDEX V.N. INDEX(ml) GRUPPO A 1 0.46 1.4 ± 0.13 2 0.30 1.95±0,61 3 1.12 1.95±0,61 4 0.92 1.95±0,61 5 1.84 4.58±3.37 6 2.46 4.58±3.37 7 1.24 4.58±3.37 8 0.76 4.58±3.37 9 0.96 4.58±3.37 10 0.86 4.58±3.37 GRUPPO B 11 0.74 1.4 ± 0.13 12 0.88 1.4 ± 0.13 13 1.26 1.4 ± 0.13 14 0.58 1.95±0,61 15 0.74 1.95±0,61 16 0.30 1.95±0,61 17 0.54 1.95±0,61 18 1.74 1.95±0,61 19 2.12 4.58±3.37 20 1.20 4.58±3.37 21 1.26 4.58±3.37 22 0.90 4.58±3.37 23 0.62 4.58±3.37 24 1.40 4.58±3.37 25 0.54 4.58±3.37 Abbreviazioni: FI: Fertility Index
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Figura 9. Fibrosi interstiziale e ispessimento della membrana basale (microscopio ottico
400x)
75
Figura 11. Tubuli seminiferi con ipospermatogenesi (microscopio ottico 400x)
5.4 DISCUSSIONE
In questo studio si prendono in esame due patologie che sono frequenti in età pediatrica e sono causa di infertilità: il criptorchidismo e il varicocele. Il termine criptorchidismo deriva dal greco “kryptos” (nascosto) e “orchis” (testicolo) e rappresenta la più comune alterazione congenita del tratto urogenitale. Nel criptorchidismo pertanto si verifica un difetto nel processo di discesa dei testicoli le cui cause sono sconosciute. Questa patologia può essere isolata o essere associata ad altre anomalie congenite.52,55,78 Si ritrova nell’1-4,5% dei bambini nati a termine e nel 30-45% dei nati pretermine.54 Nella maggior parte dei casi si
risolve spontaneamente durante il primo mese di vita grazie alla secrezione di testosterone endogeno, per cui la prevalenza del criptorchidismo tra i 3 e i 12 mesi di vita è di circa dell’1- 2%.55 Il 10% dei maschi infertili riporta storia di criptorchidismo.54 Il 13,3% dei maschi
adulti con criptorchidismo monolaterale non trattato presenta azoospermia, mentre l’88,6% dei maschi adulti con criptorchidismo bilaterale non trattato presenta azoospermia.54 Al momento della nascita i testicoli dei bambini con criptorchidismo dal punto di vista istopatologico sono normali ma a partire dai 6-12 mesi si verificano alterazioni come un ritardo della maturazione delle cellule germinali, un diminuito numero di cellule germinali e una ialinizzazione dei tubuli seminiferi.54,102 E’ per questo motivo che si consiglia di effettuare l’orchidopessi entro i 18 mesi dalla nascita, anche se recenti pubblicazioni suggeriscono l’orchidopessi tra i 6 e i 12 mesi.96,113,121 Nonostante un’orchidopessi eseguita
in tempo e in maniera efficace, il 32% dei pazienti con criptorchidismo bilaterale e il 10% di quelli con criptorchidismo monolaterale sviluppa azoospermia.101
Il varicocele è una condizione in cui ritroviamo una dilatazione e un allungamento delle vene del plesso pampiniforme. La patologia è rara nei bambini, mentre si ritrova nel 15-20% dei maschi adolescenti. In uno studio in cui si valutava un gruppo di 4025 bambini e adolescenti turchi, la prevalenza del varicocele era dello 0,8% nei bambini tra i 2 e i 6 anni, dell’1% in quelli tra i 7 e i 10 anni, 7,8% nei bambini tra gli 11 e i 14 anni e del 14,1% nei ragazzi tra i
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15 e i 19 anni, indicando un aumento della prevalenza all’inizio della pubertà.133 Il varicocele
è considerato essere la prima causa di infertilità maschile e lo ritroviamo nel 35-44% degli uomini con infertilità primaria e nel 45-81% degli uomini con infertilità secondaria. 143,341 Questa patologia si associa a riduzione delle dimensioni dei testicoli, alterazioni istologiche del tessuto testicolare e alterazioni della spermatogenesi. Una meta-analisi su 357 pazienti con varicocele di età compresa tra i 15 e i 24 anni riporta una riduzione statisticamente significativa della concentrazione degli spermatozoi (< 24 milioni/ml), della motilità (-7,5%) e morfologia (-1,7%) a confronto con 427 soggetti sani della stessa età. Sempre la stessa meta-analisi dimostra come dopo il trattamento, c’è un aumento significativo della concentrazione degli spermatozoi e della motilità, dimostrando come il varicocele sia correlato con le alterazioni dei parametri per la valutazione dello sperma.144
Vediamo quindi come queste due patologie che si possono presentare entrambe in età prepubere, possano apportare danni al tessuto testicolare e compromettere la fertilità futura dei bambini affetti da varicocele o criptorchidismo. Dai risultati del nostro studio risulta evidente come queste patologie possano causare alterazioni istologiche obiettivamente rilevabili già in età pediatrica. Infatti un interessamento del testicolo è presente in tutti i pazienti presi in considerazione dal nostro studio, come dimostra la presenza di fibrosi interstiziale. Ritroviamo inoltre diversi gradi di interessamento dell’epitelio del tubulo seminifero. Sono stati identificati tubuli con le sole cellule di Sertoli, in assenza di cellule germinali. E’ stato ritrovato anche arresto maturativo delle cellule germinali. Più precocemente avviene l’arresto maturativo, maggiori saranno le ripercussioni sulla fertilità del soggetto. Infine è stata riscontrata anche la presenza in alcuni pazienti dell’ipospermatogenesi.
La crioconservazione dello sperma è l’unico modo che si può utilizzare per preservare la fertilità nei maschi adulti e negli adolescenti. Tale tecnica non può essere sfruttata nei bambini prepuberi in quanto non possono produrre spermatozoi maturi. L’unica potenziale opzione per preservare la fertilità nei bambini prepuberi sarebbe quindi la criopreservazione di tessuto testicolare contenente spermatogoni A dark o Spermatogonial Stems Cells (SSCs).321 Gli spermatogoni A dark sono gli elementi chiave per far partire la spermatogenesi come è stato dimostrato anche da uno studio di R.L. Brinster e J.W Zimmermann del 1994, pubblicato sul Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Gli autori hanno dimostrato che spermatogoni prelevati dai testicoli di topi maschi erano in grado di ripopolare testicoli sterili se impiantati direttamente nei tubuli seminiferi. Le cellule sono state prelevate da topi tra i 4 e 12 giorni di vita in quanto i loro tubuli seminiferi contenevano solo spermatogoni. Questi ultimi poi sono stati impiantati direttamente nei tubuli seminiferi di testicoli di topi adulti resi infertili mediante busulfan. E’ stato osservato che questi spermatogoni presentavano caratteristiche morfologiche normali e producevano spermatozoi maturi.322 Una delle possibili strategie per preservare la fertilità sarebbe il trapianto ti SSCs (spermatogonial stem cells) direttamente nei tubuli seminiferi per permettere una ripresa endogena della spermatogenesi. Per ottenere un sufficiente numero di spermatogoni al fine di garantire il trapianto, è necessaria la loro proliferazione in vitro. Sono stati fatti vari studi342-346 a proposito ma quello di L. Dong et
al. dimostra che gli spermatogoni di bambini prepuberi con criptorchidismo possono
sopravvivere alla crioconservazione e mantengono la loro capacità proliferativa in vitro. E’ stato prelevato tessuto testicolare da 5 bambini (età media 1 anno) sottoposti a orchidopessi per criptorchidismo mono e bilaterale. Successivamente sono stati fatti proliferare gli spermatogoni in vitro e criopreservati con il metodo della vitrificazione. Una volta scongelati gli spermatogoni, è stata dimostrata la loro proliferazione in vitro.336 Il trapianto di SSCs è stato eseguito con successo in varie specie animali, ma non nell’uomo.323 E’ stato condotto
77
crioconservate di scimmia Macacus Rhesus prepuberi e adulti. Le scimmie erano state rese infertili con busulfan. Sono state reintrodotte le SSCs a livello della rete testis per via iniettiva dopo 10-12 settimane dall’inizio del trattamento con busulfan. Dopo 40-50 settimane dall’inizio del trattamento con busulfan è stato evidente il recupero della spermatogenesi in tutte le scimmie. Dopo 20-30 settimane dal trapianto è stato possibile il recupero di spermatozoi maturi. Dal momento che però non sono stati in grado di recuperare una sufficiente quantità di sperma, perché i marcatori risultavano deboli, queste scimmie sono state utilizzate per un reimpianto allogenico da altri donatori di SSCs. Le SSCs di altri donatori sono state in grado di generare spermatozoi nelle scimmie in cui erano state trapiantate. 337 Le SSCs sono state utilizzate anche per generare spermatozoi in vitro ottenendo scarsi risultati e solo in modelli animali.324 In uno studio di Elhija et al (2012) sono state incubate SSCs isolate e cellule di Sertoli di topi murini di 6 giorni di vita (prepuberi). Con RT-PCR è stata valutata l’evoluzione della differenziazione. Prima della coltura le cellule erano positive solo per OCT-4, GFR-alfa-1, c-Kit (markers di pre-meiosi). Dopo 30 giorni sono risultate positive a markers di post-meiosi come Acrosin e Sp10. E’ stata inoltre ritrovata una piccola quantità di spermatozoi. Sebbene questa metodica sia in grado di far maturare gli spermatogoni in vitro per dare luogo a spermatozoi apparentemente normali, la loro capacità di fecondare gli ovociti maturi non è stata provata.338 Anche se i progressi in questo campo non sono così avanzi si pensa che la 3D (three-dimensional) culture system possa dare dei risultati promettenti.325 Yokonishi et al (2014) da colture tissutali di tessuto testicolare di topi prepuberi sono stati in grado di far ripartire la spermatogenesi e hanno dimostrato che gli spermatozoi sono in grado di fecondare ovociti maturi.339 Si è cercato comunque di capire su modelli animali se tessuto testicolare
crioconservato e poi impiantato è in grado di mantenere le sue caratteristiche morfologiche e funzionali. Sono stati condotti vari studi e tre sono stati condotti anche su pazienti prepuberi con criptorchidismo. Tra questi lo studio di C. Wyns et al.333 in cui è stato prelevato tessuto
testicolare da 11 bambini prepuberi criptorchidi tra i 2 e i 12 anni e è stato criopreservato. Successivamente il tessuto è stato impiantato nello scroto di topi nudi maschi e analizzato dopo 21 giorni. Il tessuto è stato analizzato dal punto di vista istologico e immunoistochimico ed è stato evidenziato che i tubuli erano intatti e non c’era fibrosi o sclerosi. Inoltre gli spermatogoni erano presenti e mostravano attività proliferativa come anche le cellule di Sertoli.
Nel 2006 su Human Reproduction è stato pubblicato uno studio di K.Kvist et al.327 Sono
state ottenute 11 biopsie da 8 bambini di età compresa tra i 29 mesi e i 12 anni sottoposti ad orchidopessi per criptorchidismo mono o bilaterale. Ogni biopsia è stata suddivisa in 6 parti e due di queste sono state crioconservate utilizzando due protocolli diversi. Le analisi morfologiche dei campioni congelati e successivamente scongelati, rivela che le caratteristiche di questi tessuti confrontate con campioni di tessuto fresco, si sono mantenute. Dal punto di vista istochimico è stata dimostrata la sopravvivenza degli spermatogoni, delle cellule di Leydig e le cellule di Sertoli, che hanno inoltre mantenuto intatta la loro funzione. Sadri-Ardekani et al.323 hanno condotto uno studio sia su bambini criptorchidi, sia su pazienti oncologici prepuberi. A seconda del riscontro o meno della presenza di spermatozoi, sono state utilizzate differenti soluzioni per crioconservare i tessuti. La soluzione per congelare gli spermatozoi conteneva glicerolo, l’altra conteneva HBSS con DMSO 5% e HSA 5%. La tecnica utilizzata per il congelamento è il congelamento lento. I campioni di tessuto sono ancora congelati.
Gli studi precedenti dimostrano che il tessuto testicolare di bambini prepuberi con criptorchidismo mantiene intatte le sue caratteristiche morfologiche e funzionali ma solo per un breve periodo di tempo. Però in letteratura non si riportano casi di crioconservazione di tessuto testicolare di bambini prepuberi affetti da varicocele. Non sono stati riportati
78
nemmeno casi di recupero della spermatogenesi in vivo nell’uomo. E’ stato possibile farlo soltanto in modelli animali. Lo studio condotto da Fayomi et al., 331 prevedeva il trapianto autologo di tessuto testicolare criopreservato di Macacus Reshus prepuberi castrati. Sono stati emicastrati 5 macacus prepuberi e il tessuto testicolare è stato criopreservato. 7 mesi dopo l’emicastrazione, alle scimmie è stato prelevato anche il testicolo rimanente e sezionato in piccoli campioni. Subito dopo la castrazione sono stati trapiantati nei macacus i campioni di tessuto fresco e crioconservati a livello dello scroto e a livello del sottocute del dorso. Le analisi istologiche dei tessuti confermavano che si trattava di tessuto testicolare immaturo in quanto si osservavano solo spermatogoni di tipo A e di tipo B ma non spermatozoi. Anche l’analisi immunoistochimica confermava che i campioni di tessuto erano immaturi. Alcuni mesi dopo il trapianto autologo è stato osservato che i livelli di testosterone erano aumentati e i livelli di FSH erano normali come nel macaco adulto non castrato. 8-12 mesi dopo il trapianto autologo, sono stati recuperati i campioni e analizzati. E’ stata dimostrata una completa spermatogenesi in più del 70% dei tubuli seminiferi e nel 100% dei campioni di tessuto trapiantato. Sono stati successivamente prelevati gli spermatozoi e in parte crioconservati, mentre in parte sono stati utilizzati per la fecondazione in vitro mediante la tecnica ICSI. Con questa tecnica è stato possibile portare alla nascita di una femmina di Macacus Rhesus di nome “Grady”. Questa tecnica è quella più promettente in termini di recupero della fertilità nell’uomo, dal momento che le scimmie hanno una biologia testicolare e una regolazione endocrina simile a quella umana.347,348
5.5 CONCLUSIONI
Solo il progresso scientifico potrà determinare se un giorno sarà possibile applicare queste tecniche anche nell’uomo. Nel frattempo, proponiamo di effettuare la crioconservazione di tessuto testicolare nei bambini prepuberi affetti da criptorchidismo e varicocele a rischio di infertilità per capire se è possibile congelare per un lungo periodo di tempo questo tipo di tessuto e se quindi questi pazienti potranno beneficiare di tutte queste tecniche sperimentali che un giorno potrebbero entrare nella pratica clinica. Riassumendo le tecniche sono: la propagazione in vitro di SSCs e il loro reimpianto autologo, la progressione in vitro della spermatogenesi sia da SSCs isolate sia da colture tissutali, la ripresa in vivo della spermatogenesi mediante reimpianto autologo di tessuto testicolare. In conclusione, il potenziale ruolo del chirurgo pediatra può essere quello di incrementare l’attività della ricerca scientifica nell’ambito della preservazione della fertilità, partecipare ai protocolli di ricerca in ambito pediatrico, esplorare nuove opportunità per la conservazione della fertilità.
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