Crioconservazione dello sperma

La criopreservazione dello sperma o degli spermatozoi è il metodo principalmente utilizzato per la preservazione della fertilità nei maschi adulti. Le indicazioni per la crioconservazione dello sperma sono:216

• Pazienti affetti da patologie che necessitano di terapie gonadotossiche (patologie neoplastiche, autoimmuni, ecc.);

• Pazienti che devono sottoporsi a interventi chirurgici dell’apparato uro-genitale; • Soggetti costantemente esposti a sostanze potenzialmente genotossiche;

• Pazienti che mostrano un rapido e progressivo peggioramento della qualità del seme; • Pazienti criptozoospermici;

• Pazienti che hanno difficoltà a raccogliere il liquido seminale il giorno della fecondazione assistita;

• Soggetti che si sottopongono a vasectomia

Questa opzione dovrebbe però essere offerta anche a tutti gli adolescenti, sia nel periodo peri-puberale che post–puberale, con un alto rischio di infertilità.

48

E’ stato riporatato che nel 20% dei ragazzi allo Stadio II di Tanner la spermatogenesi è già iniziata, e questo permette la criopreservazione di sperma anche durante il periodo della pubertà. 273 Pertanto, tutti i ragazzi in fase puberale con testicoli di volume di 10- 12 ml274 (alcuni autori parlano di 6 ml) possono essere incoraggiati a donare campioni di sperma prima della terapia gonadotossica. Lo stadio dello sviluppo puberale è considerato il migliore indicatore per eseguire la crioconservazione dello sperma Stadio II o III di Tanner, con un volume testicolare di almeno 6 ml.275-277La crioconservazione dello sperma permette di conservare i gameti maschili per moltissimo tempo, e di utilizzarli successivamente, facendo ricorso alle tecniche di fecondazione in vitro. Secondo uno studio il paziente più giovane in cui è stato possibile crioconservare liquido seminale ottenuto per masturbazione aveva 12 anni ed è stato possibile crioconservare il seme dell’81% di ragazzi tra gli 11 e i 14 anni.278 _{Prima della raccolta dello sperma la}

conoscenza della situazione sierologica (HBs Ag, anti-HBc e anti-HBs, HIV1 e 2, CMV, VDRL-TPHA, HCV) dei pazienti è indispensabile. Il paziente dovrà quindi raccogliere il campione seminale per masturbazione in un contenitore sterile per urine.279 Nei pazienti più giovani la raccolta del seme può presentare delle difficoltà e sono state proposte tecniche quali stimolazione del pene con vibratori o elettroeiaculazione con percentuali di successo oltre il 60%.280 In alcuni casi, in cui non è possibile eseguire il prelievo dello sperma, si possono applicare particolari tecniche chirurgiche di recupero/estrazione dello sperma/spermatozoi dall’epididimo e dal testicolo281_.Queste

tecniche chirurgiche sono:

• PESA (Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration)

La PESA permette il recupero degli spermatozoi dall’epididimo. Si effettua in anestesia locale tramite infiltrazione del funicolo spermatico e della cute scrotale. Solitamente, per l’aspirazione, si utilizza un ago tipo Butterfly 21 o 22 G collegato ad una siringa da 20 ml. Si immobilizza la testa dell’epididimo tenendola ferma tra pollice e indice e si inserisce l’ago all’interno di essa. Si aspira con la siringa e si retrae o si avanza con l’ago in modo da ottenere la maggior quantità di sperma possibile. Lo sperma ottenuto viene quindi esaminato per la ricerca degli spermatozoi. 282

• TESA (Testicular Sperm Aspiration)

Questa tecnica consiste nell’aspirazione di spermatozoi dal testicolo. Può essere sia diagnostica che terapeutica dal momento che viene utilizzata spesso in casi di azoospermia per valutare la presenza o meno di spermatogenesi.281 _{Solitamente si}

utilizza per questa tecnica una siringa con ago 18 G collegato a una siringa da 10 ml montata su un apposito supporto o su un’impugnatura tipo Cameco. Una volta bloccato il testicolo tra il pollice e l’indice si punge lo scroto. Viene a questo punto effettuata l’aspirazione, nel corso della quale l’ago viene avanzato e retratto all’interno del parenchima testicolare per una decina di volte in modo da ottenere una maggiore quantità di aspirato.283 Questa è una tecnica molto efficace e le percentuali di recupero degli spermatozoi riportate sono molto alte. Uno studio di Jensen et

al. riporta una percentuale di recupero di spermatozoi nel 100% dei casi in 82 uomini

con azoospermia ostruttiva con solo il 3% di casi di complicanze.284 • TESE (Testicular Sperm Extraction)

49

La TESE è la tecnica più utilizzata e consiste nell’estrazione di spermatozoi da frammenti di parenchima testicolare ottenuti tramite biopsia. Si effettua la tecnica in anestesia locale tramite infiltrazione del funicolo spermatico e della cute scrotale. L’incisione cutanea può essere mediana sul rafe o trasversale. Dopo l’incisione si apre la fascia di Dartos e successivamente la tunica vaginale. Non è necessario esteriorizzare il testicolo. Una volta esposta la tunica albuginea, questa viene incisa per 5-10 mm e si effettua una biopsia del tessuto testicolare. La tunica vaginale, la fascia di Dartos e la cute vengono poi suturate. Il parenchima testicolare viene posto in una piastra Petri e ridotto in piccoli frammenti per essere esaminato al microscopio. Si cercano quindi gli spermatozoi che poi verranno criopreservati. 281 Le percentuali di recupero di spermatozoi idonei alla crioconservazione con questa tecnica sono molto elevate. Diversi studi dimostrano un’efficacia in oltre il 90% dei casi.285-287

• MESA (Microsurgical epididymal sperm aspiration)

E’ una tecnica microchirurgica che consente il recupero degli spermatozoi nel 93% dei casi con possibilità di criopreservazione degli spermatozoi nel 90-100% dei casi.288 _{Sono state descritte varie tecniche di esecuzione.}289,290 _{La tecnica tradizionale}

prevede, dopo l’esecuzione dell’anestesia locale, l’apertura della tunica vaginale e l’esteriorizzazione del testicolo e dell’epididimo. Successivamente si procede con la valutazione dell’epididimo, mediante il microscopio chirurgico, sotto ingrandimento 20-30x. Successivamente con un agocannula si aspira lo sperma dai tubuli finchè non se ne ha a sufficienza per la crioconservazione.291 La tecnica, descritta da autori quali Schlegel e Bernie, prevede una epididimotomia e l’aspirazione del liquido mediante delle micropipette in vetro. Successivamente sia per la tecnica tradizionale sia per quella alternativa si procede con l’analisi della motilità degli spermatozoi.289,290

Infine la tunica vaginale viene chiusa, il testicolo è riposizionato nello scroto e la fascia di Dartos e la cute suturate.281

• MicroTESE (Microdissection Testicular Sperm Extraction)

E’ tecnica microchirurgica che si effettua mediante l’utilizzo di un microscopio chirurgico, con il quale si ricercano gli spermatozoi da prelevare direttamente dal tessuto testicolare. Si effettua sotto anestesia generale. Si procede incidendo la linea mediana dello scroto e si esteriorizza il testicolo. Dopo aver inciso la tunica vaginale, si incide in maniera trasversale la tunica albuginea. Vengono esposti quindi i tubuli seminiferi che vengono sistematicamente analizzati mediante il microscopio chirurgico. Una volta individuati i tubuli che contengono gli spermatozoi, si procede all’asportazione dei tubuli stessi e a porli in una piastra Petri. Se dall’analisi del tessuto si riscontrano spermatozoi idonei alla criopreservazione, si sutura la tunica albuginea e si riposiziona il testicolo nello scroto. Si sutura successivamente la tunica vaginale e la fascia di Dartos e infine si sutura la cute dello scroto. Se invece dall’analisi del tessuto prelevato non si trovano spermatozoi idonei, si deve procedere con la dissezione del testicolo controlaterale.292 Le percentuali di recupero degli spermatozoi sono del 58-60%.293,294

50

Per eseguire questa tecnica è necessaria l’anestesia locale. Si procede all’aspirazione di sperma direttamente utilizzando un ago 18G collegato a una siringa da 60 ml. Si aspira in diverse zone del testicolo (superiore, media e inferiore), inserendo l’ago fino a 2 cm di profondità nel parenchima testicolare. A questo punto si estrae l’ago e nei punti in cui si è inserito l’ago si possono prelevare dei tubuli seminiferi. I tubuli poi vengono posti su una piastra Petri e si procede alla ricerca degli spermatozoi. Il liquido invece è centrifugato e si ricercano gli spermatozoi. 295 Con questa metodica si riesce a recuperare spermatozoi nel 67-100% casi.285,296

Successivamente alla raccolta dello sperma si procede con la crioconservazione. La crioconservazione dello sperma consiste nel congelamento dello sperma per mantenere intatte le caratteristiche strutturali e funzionali degli spermatozoi che, una volta scongelati, potranno essere impiegati nelle tecniche di fecondazione in vitro. Tra queste ritroviamo:

• IVF (In Vitro Fertilization): questa tecnica comporta la stimolazione ovarica mediante terapia ormonale; il prelievo di ovociti per via transvaginale; il recupero degli spermatozoi o lo scongelamento di spermatozoi precedentemente crioconservati; l’incubazione di spermatozoi con gli ovociti in modo da dare luogo alla formazione di embrioni; trasferimento degli embrioni in cavità uterina. • ICSI (Intra Cytoplasmatic Sperm Injection): questa tecnica si basa sull’iniezione

di un unico spermatozoo all’interno di un ovocita utilizzando un apposito ago.297 La crioconservazione riduce la qualità del liquido seminale e per valutare l’effetto della crioconservazione sui campioni solitamente si esegue un test di scongelamento con una paillette (apposito supporto per il congelamento) poco dopo lo stoccaggio.279 _{Per ridurre}

i danni del processo di congelamento sugli spermatozoi ci si avvale dei crioprotettori, sostanze con elevata solubilità in acqua ma che hanno anche un effetto tossico sulle cellule dal momento che provocano un cambiamento del volume della cellula stessa e inducono uno shock osmotico. I crioprotettori spingono l’acqua ad uscire dalla cellula per osmosi e in questo modo la disidratano. Si distinguono:

• Crioprotettori penetranti (glicerolo, etilenglicole EG, dimetilsolfossido DMSO e 1,2-propanediolo PrOH): attraversano la membrana cellulare e mediante il gradiente osmotico portano alla fuoriuscita di acqua dalla cellula. Questi crioprotettori inoltre abbassano il punto di congelamento della soluzione e diminuiscono la formazione di cristalli di ghiaccio.

• Crioprotettori non penetranti (zuccheri, amidi, lipoproteine e polivinilpirrolidone PVP): queste sostanze, dall’elevato peso molecolare, non penetrano all’interno della cellula creando un gradiente osmotico che permette la fuoriuscita da acqua dalle cellule.298,299

Non è mai stato definito un limite per la durata della crioconservazione: sono riportate gravidanze ottenute con seme scongelato dopo 21 e 28 anni.300 Per la criopreservazione degli spermatozoi sono stati messi a punto vari protocolli. Alcuni non prevedono l’uso di crioprotettori,301 _{mentre altri prevedono l’utilizzo di crioprotettori quali, sucrosio,}

51

albumina sierica umana (HSA). Sono stati proposti anche diversi tipi di supporti quali: paillettes302, sfere303, chips304 o cryoloops305. Dal momento che comunque non sono stati portati avanti molti studi utilizzando questi protocolli, la crioconservazione mediante il congelamento lento rimane il metodo maggiormente utilizzato. 306

4.2.2.1 Congelamento lento

Attualmente è la metodica più utilizzata per la criopreservazione dello sperma.307 Tecnica proposta da Behrman and Sawada, consiste nel congelare mediante un congelatore apposito, lo sperma in un periodo di 2-4 ore. Il metodo manuale si realizza riducendo progressivamente la temperatura fino a -80 °C e nello stesso momento aggiungendo il crioprotettore. Successivamente si immerge il campione in azoto liquido a -196 °C. Per problemi legati alla riproducibilità della tecnica manuale, il congelamento lento si può anche eseguire mediante l’uso di congelatori programmabili. Infatti i programmi dei congelatori sono semplici da usare e non richiedono continui interventi dell’operatore. Alcuni autori però pensano che il congelamento lento tradizionale, sia manuale che programmato, porti a danni chimico-fisici dello sperma dovuto ai cristalli di ghiaccio.

4.2.2.2 Congelamento rapido

E’ stato proposto per la prima volta da Sherman. Ai campioni di sperma viene aggiunto del crioprotettore, goccia a goccia, e posto nelle paillettes. Successivamente queste vengono poste a diretto contatto con i vapori di azoto liquido per 8-10 minuti. I campioni mantenuti a una distanza di 15-20 cm sopra il livello di azoto liquido per 15 minuti sono quindi direttamente immersi in azoto liquido a -196 °C. Lo scongelamento si esegue mantenendo le paillettes a temperatura ambiente per una decina di minuti per poi eliminare il crioprotettore lavando e centrifugando più volte il campione. Il crioprotettore più usato per congelare il liquido seminale è il glicerolo perché preserva lo spermatozoo dalla disidratazione, dallo shock termico e infine consente di mantenere sia la struttura delle membrane sia il metabolismo cellulare.308 Diversi studi hanno comparato il congelamento lento e quello rapido riportando che il congelamento rapido in generale porta ad alterazioni della cromatina in un numero maggiore dei casi rispetto al congelamento lento.309

4.2.2.3 Vitrificazione

Questa tecnica prevede il congelamento dei campioni aumentando e diminuendo la temperatura, impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio. E’ stato dimostrato che la vitrificazione su ovociti e embrioni è un’alternativa valida al congelamento lento, mentre sugli spermatozoi non vi sono molti studi.310 _{La vitrificazione si basa sull’uso}

di concentrazioni molto alte di crioprotettori (6M) e un immediato passaggio dalla temperatura ambiente a -196 °C, in quanto il campione viene immerso direttamente nell’azoto liquido. Durante il processo di vitrificazione si forma uno strato vitreo per cui l’acqua non ha il tempo di formare cristalli di ghiaccio.311 _{L’uso di concentrazioni}

così elevate di crioprotettori però potrebbe causare tossicità acuta sulle cellule e per ovviare a questo problema si potrebbero miscelare vari crioprotettori tra loro.312 Inoltre c’è la possibilità di trasmissione di agenti infettivi presenti nell’azoto liquido

52

al campione. Questo problema è stato risolto utilizzando i raggi UV per sterilizzare l’azoto e usando sistemi chiusi, nei quali viene posto il campione, che in questo modo non si ritrova a contatto diretto con l’azoto liquido.313,314