Crioconservazione di tessuto testicolare

La crioconservazione dello sperma è l’unico modo che si può utilizzare per preservare la fertilità nei maschi adulti e negli adolescenti. Tale tecnica non può essere sfruttata nei bambini prepuberi in quanto non possono produrre spermatozoi maturi. L’unica potenziale opzione per preservare la fertilità nei bambini prepuberi sarebbe quindi la criopreservazione di tessuto testicolare contenente spermatogoni o Spermatogonial Stems Cells (SSCs).321

Gli spermatogoni A dark sono gli elementi chiave per far partire la spermatogenesi, come è stato dimostrato anche da uno studio di R.L. Brinster e J.W Zimmermann del 1994, pubblicato sul Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Gli autori hanno dimostrato che spermatogoni prelevati dai testicoli di topi maschi erano in grado di ripopolare testicoli sterili se impiantati direttamente nei tubuli seminiferi. Le cellule sono state prelevate da topi tra i 4 e 12 giorni di vita in quanto i loro tubuli seminiferi contenevano solo spermatogoni. Questi poi sono stati impiantati direttamente nei tubuli seminiferi di testicoli di topi adulti resi infertili mediante busulfan. E’ stato osservato che questi spermatogoni presentavano caratteristiche morfologiche normali e producevano spermatozoi maturi.322 E’ stato possibile eseguire il trapianto con successo di SSCs in varie specie animali, ma non nell’uomo.323 _{Le SSCs sono state utilizzate anche per generare spermatozoi in vitro ma}

per lo più in modelli animali.324 Anche se i progressi in questo campo non sono così avanzi si pensa che la 3D (three-dimensional) culture system possa dare dei risultati promettenti.325

Attualmente le metodiche che si sono utilizzate per la crioconservazione del tessuto testicolare sono il congelamento lento e la vitrificazione.

4.2.4.1 Congelamento lento

Il primo studio in cui si descrive il congelamento di tessuto testicolare risale al 2000 da parte di Bahadur et al. Questo studio però è incompleto dal momento che manca il confronto tra i tre tipi di crioprotettori utilizzati (glicerolo, mezzo per la fecondazione in vitro con aggiunta di glicerolo e siero, tampone fosfato salino o PBS contenente 1,2-propanediolo PrOH e sucrosio) e la valutazione post-scongelamento dei tessuti.321

Nel 2005 sono stati messi a confronto tre protocolli per il congelamento di tessuto testicolare adulto. Sono stati utilizzati tre crioprotettori diversi: glicerolo al 12%; 1,5 M PrOH (1,2-propanediolo) e 0,7 M DMSO. Sono stati poi utilizzati due diversi metodi per congelare i campioni. Confrontando i tre protocolli con un tessuto fresco non congelato è risultato che il migliore in termini di conservazione morfologica risultava quello in cui veniva utilizzato DMSO. Questo protocollo inoltre è risultato il meno dannoso per gli spermatogoni, che sono stati analizzati mediante

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l’immunoistochimica andando a cercare l’antigene specifico per gli spermatogoni nel tessuto testicolare umano MAGE-A4. Inoltre il testosterone risultava essere prodotto in maggiore quantità nel protocollo con DMSO rispetto agli altri, indicando una miglior sopravvivenza delle cellule di Leydig.326 La crioconservazione è stata eseguita anche su tessuto testicolare di bambini criptorchidi. Nel 2006 su Human Reproduction è stato pubblicato uno studio di K. Kvist et al. Sono state ottenute 11 biopsie da 8 bambini di età compresa tra i 29 mesi e i 12 anni sottoposti ad orchidopessi per criptorchidismo mono o bilaterale. Ogni biopsia è stata suddivisa in 6 parti e due di queste sono state crioconservate utilizzando due protocolli. Nel primo si utilizzava Leibovitz L-15 con aggiunta del crioprotettore 1,5 mol/l di etilen glicole, 0,1 mol/l di sucrosio e 10 mg/mldi albumina sierica umana (HSA). Nel secondo protocollo si utilizza al posto del mezzo di congelamento Leibovitz L-15, il tampone fosfato salino (PBS). Successivamente i campioni sono stati congelati utilizzando un congelatore programmabile. Le analisi morfologiche dei campioni congelati e successivamente scongelati, rivelano che le caratteristiche di questi tessuti erano mantenute a confronto con campioni di tessuto fresco. Dal punto di vista istochimico è stata dimostrata la sopravvivenza degli spermatogoni utilizzando il marker c-kit (CD117). Rispetto ai campioni freschi, i livelli di testosterone e inibina B non riportavano significative differenze, dimostrando la conservata funzione delle cellule di Leydig e le cellule di Sertoli.327

Nel 2007 Keros V. et al. hanno confrontato due differenti protocolli di congelamento lento. E’ stato prelevato tessuto testicolare da 5 bambini tra i 2 e i 14 anni affetti da rabdomiosarcoma, leucemia linfoblastica acuta, leucemia mieloide acuta, beta talassemia maggiore e leucemia mielomonocitica infantile, prima di essere sottoposti a trattamento radio/chemioterapico gonadotossico. Come crioprotettore è stata utilizzata una miscela al 5% di DMSO 0,7 M e 5% di albumina sierica umana (HSA) diluiti nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). I campioni poi sono stati congelati utilizzando due distinti metodi: il programma1 (Cryo I) messo a punto da Keros V. et al. nello studio del 2005 precedentemente descritto, il programma 2 (Cryo II) precedentemente utilizzato per la crioconservazione di tessuto testicolare fetale, più rapido rispetto al primo. E’ stato dimostrato che il primo programma di crioconservazione (Cryo I) era il migliore, dal momento che dal punto di vista morfologico i campioni congelati e scongelati erano più simili ai campioni di tessuto fresco rispetto a quelli che sono stati congelati con il programma 2. All’immunoistochimica sono stati analizzati gli spermatogoni, le cellule di Sertoli e le cellule stromali testicolari valutando rispettivamente MAGE-A4, Vimentina e CD34 ed è stato notato che utilizzando il programma 1 gli spermatogoni erano in numero maggiore rispetto al programma 2.328

4.2.4.2 Vitrificazione

Curaba et al. nel 2011 hanno confrontato la metodica del congelamento lento e la vitrificazione per stabilire quale delle due tecniche fosse la più adatta alla crioconservazione di tessuto testicolare di bambini prepuberi. Il tessuto testicolare è stato prelevato da due bambini di 6 e 12 anni che dovevano essere sottoposti a trattamento gonadotossico per granulomatosi e leucemia linfoblastica acuta. Per il congelamento lento è stato utilizzato DMSO 0,7 mol/l unito a sucrosio 0,1 mol/l e albumina sierica umana HSA 10 mg/ml. Utilizzando un congelatore programmabile, i campioni sono stati portati a -80 °C e infine sono stati immersi in azoto liquido. Per vitrificare i campioni è stato utilizzato un mezzo basico composto da

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MEM/Glutamax I e 25 mg di HSA al 25% in aggiunta ai crioprotettori DMSO (Dimetil sulfosside 2,8mol/l) e etilen glicole (2,8 mol/L). La disidratazione è stata raggiunta in tre distinti passaggi e i campioni immersi direttamente in azoto liquido (LN2). Dopo 24 ore tutti i campioni sono stati scongelati e analizzati. Gli spermatogoni sono stati valutati all’immunoistochimica utilizzando il marker specifico MAGE-A4 e la loro proliferazione è stata valutata mediante gli anticorpi anti Ki67. Confrontando i campioni criopreservati mediante congelamento lento, vitrificazione e quelli freschi, non si sono notate sostanziali differenze dal punto di vista immunoistochimico e nemmeno da quello istologico. Dal punto di vista morfologico in tutti i campioni venivano mantenute le caratteristiche degli spermatogoni e delle cellule di Sertoli. In questo studio si dimostra che la vitrificazione è un metodo di crioconservazione altrettanto valido, ma rispetto al congelamento lento è più veloce e più economico.329

In uno studio di Baert et al. sono stati confrontati il congelamento lento, la vitrificazione su superficie solida e “direct cover vitrification” (DCV). E’ stato dimostrato che sebbene la vitrificazione riportasse minori danni ultrastrutturali per gli spermatogoni, con il congelamento lento è possibile conservare un numero maggiore di sparmatogoni.321,330

Con la crioconservazione del tessuto testicolare si potrebbe permettere ai bambini a rischio di infertilità di beneficiare, una volta adulti, di tecniche sperimentali che un giorno potrebbero entrare nella pratica clinica. Tra queste abbiamo il trapianto autologo di tessuto testicolare per dare luogo alla formazione di spermatozoi. Lo studio di Fayomi et al., pubblicato su Science, prevedeva il trapianto autologo di tessuto testicolare criopreservato di Macacus Reshus prepuberi castrati. Sono stati emicastrati 5 macacus prepuberi e il tessuto testicolare è stato sezionato e criopreservato. 7 mesi dopo l’emicastrazione, alle scimmie è stato prelevato anche il testicolo rimanente e sezionato in piccoli campioni. Una parte è stata destinata al trapianto di tessuto fresco e il resto è stato crioconservato.331 Per la crioconservazione è stato utilizzato il protocollo messo a punto da Keros et al. (2005),332 eseguendo un congelamento lento ma utilizzando il dimetilsolfossido (DMSO) 0,7M invece che 1,4 M. Subito dopo la castrazione sono stati trapiantati nei macacus i campioni di tessuto fresco e crioconservati a livello dello scroto (2 siti di impianto) e a livello del sottocute del dorso (6 siti di impianto). Le analisi istologiche dei tessuti confermavano che si trattava di tessuto testicolare immaturo in quanto si osservavano solo spermatogoni di tipo A e di tipo B ma non spermatozoi. Anche l’analisi immunoistochimica confermava che i campioni di tessuto erano immaturi in quanto positivi per VASA+ e GFRA1+, marcatori di spermatogoni indifferenziati, ma non ACROSIN+ marker di cellule in fase post-meiotica. Alcuni mesi dopo il trapianto autologo è stato osservato che, oltre alla proliferazione del tessuto, i livelli di testosterone erano aumentati e i livelli di FSH erano normali come nel macaco adulto non castrato. 8-12 mesi dopo il trapianto autologo, sono stati recuperati i campioni e sono stati analizzati. E’ stata dimostrata una completa spermatogenesi in più del 70% dei tubuli seminiferi e nel 100% dei campioni di tessuto trapiantato. Sono stati successivamente prelevati gli spermatozoi e in parte crioconservati, mentre in parte sono stati utilizzati per la fecondazione in vitro mediante la tecnica ICSI. Con questa tecnica è stato possibile portare alla nascita di una femmina di Macacus Rhesus.331

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