MATERIALI E METOD

Per la valutazione del tessuto testicolare, nel nostro studio abbiamo analizzato le biopsie di 75 pazienti affetti da varicocele o criptorchidismo operati presso la Sezione Dipartimentale di Chirurgia Pediatrica e dell’Adolescenza dell’Università di Pisa tra il 2018 e il 2019. Sono state analizzate le biopsie di 50 pazienti affetti da varicocele e 25 affetti da criptorchidismo. Per quanto riguarda i pazienti affetti da varicocele, è stato possibile analizzare solo biopsie di pazienti con età compresa tra i 12 e i 18 anni, con una media di 14,7 anni. Questi pazienti, operati e sottoposti a biopsia, presentavano ipotrofia testicolare, con una asimmetria volumetrica tra i due testicoli di almeno il 20%, valutata con un esame ecografico. La tecnica chirurgica utilizzata nell’intervento di correzione è la varicocelectomia microchirurgica con accesso inguinale, con ingrandimento x 6, con risparmio delle arteriole e dei vasi linfatici. Il paziente viene posto in posizione di anti Trendelenburg per accentuare l’ectasia venosa e si esegue a livello inguinale un’incisione di circa 2 cm. Si seziona l’aponeurosi del muscolo obliquo esterno, evitando di ledere il nervo ileo inguinale. Successivamente si incidono longitudinalmente le fibre del muscolo cremastere, si isola il funicolo spermatico e si carica su una fettuccia. Con l’incisione della fascia spermatica interna è possibile identificare le vene spermatiche interne dilatate, considerate tali solo se hanno un diametro maggiore di 2 mm. Si isola e si repertata con dei vessel loops ciascuna delle vene dilatate. Successivamente si scollano le piccole arterie e i vasi linfatici aderenti alle vene in modo da preservarli. Quindi si identificano le vene deferenziali e cremasteriche, che vengono selettivamente preparate. Si effettua la delivery del testicolo il quale viene lussato attraverso l’incisione inguinale per

63

esaminare tutte le vene spermatiche esterne e le vene gubernaculari del polo caudale del testicolo. Per ottenere una chiara visione di tutte le vene di drenaggio, si esegue una leggera trazione sul testicolo e sul funicolo spermatico, in modo da identificare anche le vene extrafunicolari che non erano state messe in evidenziata. A questo punto si esegue la biopsia: si incide per circa 2 mm, con bisturi n° 11, la tonaca vaginale propria della parete anteriore del testicolo, in una zona avascolare. Applicando una pressione sulla superficie opposta del testicolo si facilita l’evaginazione di una porzione di parenchima testicolare di 2x2x2 mm, il quale viene asportato con forbici bagnate con soluzione fisiologica utilizzando il metodo “non-touch”. Si chiude la ferita con una sutura riassorbibile. Dopo aver effettuato la biopsia, si posiziona il paziente in posizione di Trendelemburg per permettere al sangue presente nelle vene precedentemente identificate di defluire. Tutte queste vene vengono legate e sezionate. Si riposizionando il testicolo e il funicolo spermatico nei loro normali siti anatomici, si effettua la sutura del muscolo cremastere, dell’aponeurosi del muscolo obliquo esterno e del tessuto sottocutaneo. Infine si esegue una sutura intradermica della cute. I reperti ottenuti con la biopsia vengono conservati in soluzione di Bouin. Si effettua la valutazione anatomopatologica su sezioni istologiche colorate con ematossilina-eosina. In tutti i preparati sono stati esaminati almeno 50 tubuli seminiferi. La lettura dei preparati anatomopatologici è stata eseguita da un unico anatomopatologo e il referto è di tipo descrittivo. Nel nostro studio, per la classificazione degli aspetti anatomopatologici, sono stati presi in esame i seguenti parametri:

• Sertoli cell only • Arresto maturativo • Ipospermatogenesi • Fibrosi interstiziale

• Infiltrati infiammatori interstiziali

• Ispessimento della membrana basale dei tubuli seminiferi

E’ stato studiato dal punto di vista istologico il testicolo omolaterale al lato del varicocele, e nel nostro caso si tratta di pazienti affetti da varicocele sinistro. Per quanto riguarda la Sertoli cell only syndrome abbiamo considerato la percentuale di tessuto analizzato che mostrava la presenza di sole cellule di Sertoli e la mancanza di cellule della linea germinale. Anche per l’arresto maturativo è stata valutata la percentuale del tessuto testicolare con queste alterazioni. Abbiamo valutato 3 diverse condizioni di ipospermatogenesi: assenza di ipospermatogenesi, ipospermatogenesi lieve-moderata e ipospermatogenesi moderata- grave. La fibrosi interstiziale è classificata in: assente, lieve-moderata e moderata-grave. La presenza di infiltrati infiammatori interstiziali è suddivisa in: assente, presenza focale e presenza diffusa. L’ispessimento della membrana basale dei tubuli seminiferi si distingue in: assenza di ispessimento, ispessimento focale e ispessimento diffuso.

Per quanto riguarda i pazienti affetti da criptorchidismo, lo studio è stato condotto su 25 bambini con età compresa tra i 23 mesi e gli 11 anni (età media di 6,16 anni) che presentavano criptorchidismo unilaterale. Sono stati sottoposti ad intervento chirurgico di orchidopessi tra il 2018 e il 2019, 42 bambini criptorchidi. I criteri di esclusione sono stati: • Diminuzione del volume del testicolo criptorchide inferiore al 10% rispetto ai valori

normali;

• Criptorchidismo bilaterale;

• Chirurgia inguino-scrotale precedente; • Patologie multisistemiche;

64

• Anomalie cromosomiche; • Precedenti terapie ormonali.

È stata condotta l’indagine anamnestica in ogni bambino e poi è stato effettuato l’esame obiettivo, con il quale è stato attribuito ad ognuno lo stadio di sviluppo, secondo la stadiazione di Tanner. Al termine dell’esame è stata discussa e successivamente stabilita la necessità di effettuare l’intervento chirurgico. Per l’analisi ultrasonografica inguino-scrotale è stato utilizzato un ecografo Toshiba con sonda lineare 7.5-10 MHz e sono state eseguite le misurazioni dei diametri testicolari: lunghezza massima, larghezza e altezza. Per ciascun testicolo sono state registrate tre immagini trasversali e longitudinali. Il volume testicolare (VT) è stato calcolato sulla base della formula per determinare il volume di un ellissoide, a partire dai tre diametri maggiori ottenuti mediante l’ecografia: VT (ml) = π/6 x (lunghezza x larghezza x altezza).335 I pazienti sono stati suddivisi prospetticamente in due gruppi, secondo la randomizzazione a blocchi, sulla base dell’entità della riduzione testicolare rispetto ai valori dei volumi normali per età. Abbiamo suddiviso i pazienti in:

• GRUPPO A in cui è stata riscontrata una riduzione del volume testicolare del 10- 20% rispetto ai valori normali del volume testicolare stabiliti dallo studio di Geode et al.335

• GRUPPO B in cui la riduzione del volume testicolare è risultata compresa tra il 21 e l’80%

Per l’intervento di orchidopessi sono state impiegate due tecniche: la tecnica secondo Shoemaker e la tecnica transcrotale secondo Spinelli. La prima è stata impiegata nei casi in cui i testicoli erano posizionati in sede alta del canale inguinale. La tecnica di orchidopessi transcrotale secondo Spinelli è stata utilizzata nei casi di testicoli ritenuti in sede bassa del canale inguinale o in quelli in cui i testicoli, se trazionati, raggiungevano adeguatamente la regione scrotale. Durante l’intervento chirurgico è stata eseguita la biopsia del testicolo criptorchide mediante il procedimento descritto in precedenza per i pazienti con varicocele. Ciascun campione bioptico è stato visualizzato tramite microscopia ottica a 400X, esaminando almeno 50 tubuli seminiferi in ognuno di essi. I parametri presi in considerazione per la valutazione del danno istologico sono:

• Grado di fibrosi

• Ispessimento della membrana basale • Anisometria

• Numero di tubuli contenenti spermatogoni • Numero delle cellule del Sertoli per tubulo;

• Numero di spermatogoni per sezione tubulare (FERTILITY INDEX “FI” o “S/T”). La fibrosi è stata classificata in: focale (0 pt), plurifocale (1 pt) o diffusa (2 pt). L’ispessimento della membrana basale e l’anisometria sono stati valutati secondo: grado lieve (0 pt) , grado intermedio (1 pt) e grado severo. I valori del FI superiori o inferiori al 50% del normale sono stati considerati per la valutazione delle condizioni del testicolo. Abbiamo condotto l’indagine statistica basandoci sui dati ottenuti dalle immagini ecografiche e i dati istopatologici. I test adoperati sono stati il chi quadro, il test F di fisher e il T student.

65

Il nostro studio si ferma alla biopsia che è comunque servita a confermare la presenza di spermatogoni nei tubuli seminiferi e soprattutto che criptorchidismo e varicocele comportano alterazioni istologiche già in età precoce. Per il nostro studio di fattibilità è necessario eseguire, in concomitanza della biopsia, la crioconservazione di parte del campione tissutale prelevato, una volta confermata la presenza di spermatogoni negli stessi. Dal momento che in letteratura non vengono riportati casi di crioconservazione di tessuto testicolare di pazienti affetti da varicocele a qualsiasi età, si propone di eseguire la tecnica di Wyns et al. (2007)333 impiegata per uno studio condotto su bambini criptorchidi prepuberi tra i 2 e i 12 anni di età. Gli autori hanno ripreso e leggermente modificato la tecnica riportata da Keros et al. (2005)332 in uno studio condotto su pazienti adulti oncologici. La tecnica utilizzata è quella del congelamento lento. I campioni devono essere posti su una piastra Petri con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 4°C la quale successivamente deve essere posta in ghiaccio. Successivamente i tessuti devono essere immersi in una soluzione contenente dimetilsulfossido (DMSO) 0.7 mol/L con aggiunta dei crioprotettori, sucrosio 0.1 mol/l e albumina sierica umana (HSA) 10 mg/ml. Successivamente i campioni devono essere trasferiti nei cryovials da 2 ml con 1 ml di soluzione per il congelamento a 4°C. Usando un freezer programmabile i campioni devono essere portati a 0°C e la temperatura deve scendere a una velocita di 1°C/min. Devono essere mantenuti a questa temperatura per 9 minuti. Successivamente devono essere portati a -8°C a una velocità di 0,5°C/minuti e mantenuti a tale temperatura per 15 minuti. Successivamente si devono portare a una temperatura di -40°C a una velocità di 0,5°C/min e mantenuti a questa temperatura per 10 minuti. Alla velocità di -7°C/min sono portati a -80°C. A questo punto i cryovials devono essere trasferiti in azoto liquido a -196°C.

Il passaggio seguente prevede che i campioni, per poter essere utilizzati, vengano scongelati, secondo lo studio di K. Kvist et al. 327

I campioni verranno analizzati e si cercherà di capire se il tessuto, dopo il lungo periodo di crioconservazione, non sia stato danneggiato dal punto di vista istologico e funzionale. Per verificare la possibilità di ottenere la fertilità nei pazienti, si indicano una serie di studi che sono ancora sperimentali ma che un giorno, nel caso in cui risultasse possibile la loro applicazione anche nell’uomo, potrebbero portare a risultati concreti.

Per capire se è possibile la proliferazione in vitro delle SSCs si propone di seguire il modello di L. Dong336 messo a punto per tessuto di bambini criptorchidi sottoposti a orchidopessi. Per il reimpianto autologo di queste cellule si indica di seguire il modello di Hermann et

al.337 Per la progressione in vitro di SSCs isolate della spermatogenesi si suggerisce di utilizzare il modello sperimentale di Elhija et al.338 Per la progressione della spermatogenesi in vitro da colture di tessuto testicolare si propone il modello di Yokonishi et al.339: poiché tale tecnica è stata eseguita esclusivamente su tessuti di topi prepuberi, dovrà essere verificata la sua fattibilità su colture tissutali di tessuto testicolare umano. Infine per capire se è possibile una ripresa della spermatogenesi in vitro si propone il modello di Fayomi et

66

Figura 8. Immagini intraoperatorie di biopsie testicolari. 5.3 RISULTATI

Per i pazienti sottoposti a correzione chirurgica del varicocele, analizzando i referti istologici dei testicoli abbiamo trovato le alterazioni riportate nella sottostante tabella.

Tabella 8. Alterazioni istologiche nei pazienti affetti da varicocele.

Paz. Età SCO % AM % IPO Fibr. Int Interst. Isp. Membr. N°.ST

1 12 0 0 1 1 1 0 >50 2 14 0 2 1 2 0 2 >50 3 13 0 0 0 1 0 2 50 4 12 0 0 0 2 0 2 50 5 15 0 0 0 2 0 2 50 6 13 0 10 0 1 2 1 50 7 16 0 0 0 2 0 2 >50 8 18 0 0 0 1 1 2 50 9 13 0 0 0 2 1 1 50 10 13 10 60 2 1 0 2 >50 11 16 8 20 1 1 0 1 >50 12 14 0 30 1 2 0 2 >50 13 13 0 0 0 1 2 1 50 14 17 0 0 0 1 0 1 50 15 13 0 0 1 1 0 1 50 16 12 0 0 0 1 1 0 >50 17 15 0 10 0 2 2 2 >50

67 18 14 0 0 1 1 0 1 50 19 18 10 50 2 1 0 2 50 20 13 0 0 0 2 1 1 50 21 12 0 0 0 2 0 1 >50 22 16 0 0 1 1 2 2 50 23 13 0 0 2 1 0 1 50 24 17 0 30 0 1 0 2 >50 25 15 0 0 1 2 0 2 50 26 13 5 0 0 1 0 1 50 27 16 0 0 0 1 1 1 50 28 13 0 0 2 1 0 1 >50 29 14 0 0 0 2 0 2 >50 30 15 0 20 1 1 0 2 50 31 13 0 0 0 2 0 1 50 32 18 10 0 0 2 0 1 50 33 16 0 0 1 1 1 2 50 34 13 0 0 0 2 0 1 >50 35 17 0 0 0 1 0 1 50 36 15 0 0 0 1 0 0 >50 37 14 70 0 0 1 0 0 50 38 15 0 0 0 2 0 1 50 39 14 0 0 0 2 0 1 >50 40 14 0 0 0 1 0 1 50 41 13 0 0 1 1 0 1 >50 42 12 80 0 0 2 0 2 50 43 16 0 30 0 2 0 1 >50 44 17 0 0 0 1 0 1 50 45 18 0 10 1 1 0 0 >50 46 17 0 5 0 1 0 0 50 47 15 0 0 0 1 0 1 50 48 16 0 10 1 1 0 0 >50 49 18 0 10 1 1 0 0 >50

68

50 18 0 0 0 1 0 1 >50

ABBREVIAZIONI:

SCO= Sertoli cell only AM= arresto maturativo

IPO= ipospermatogenesi (0: assente; 1: lieve-moderata; 2: moderata-grave) Fibr. Int.= fibrosi interstiziale (0: assente; 1: lieve-moderata; 2: moderata-grave) Interst.= infiltrati infiammatori interstiziali(0: assenti; 1: presenza focale; 2: presenti) Isp. Membr= ispessimento membrane basale (0: non ispessita; 1: ispessimento focale; 2: ispessimento diffuso)

N.° TS= numero di tubuli seminiferi esaminati

Dall’analisi dei referti anatomopatologici dei nostri pazienti abbiamo ricavato la frequenza delle alterazioni istologiche che abbiamo preso in considerazione. Nella tabella 2 possiamo vedere il numero dei casi in cui sono presenti e la relativa percentuale. La presenza di sole cellule di Sertoli, o aplasia delle cellule germinali che è una condizione caratterizzata dalla totale mancanza di cellule germinali, in assenza di danni a carico delle cellule di Sertoli, è stata ritrovata nel 14% dei pazienti. Nel 28% dei casi abbiamo invece riscontrato un arresto maturativo. L’arresto maturativo può avvenire in diverse fasi della spermatogenesi. È più grave se avviene in fase precoce, cioè in fase spermatocitica-spermatogoniale, rispetto ad un arresto maturativo più tardivo, in fase spermatidica. L’ipospermatogenesi è definita come una riduzione del numero degli spermatozoi maturi e è presente nel 36% dei pazienti esaminati. La fibrosi interstiziale è presente nel 100% dei casi esaminati e nel 22% dei casi si ritrovano di infiltrati infiammatori. Infine nell’84% dei casi troviamo un ispessimento della membrana basale.

Tabella 3. Frequenza delle alterazioni istologiche nei pazienti affetti da varicocele.

Alterazioni N.° casi %

Sertoli cell only 7/50 14%

Arresto maturativo 14/50 28%

Ipospermatogenesi 18/50 36%

Fibrosi interstiziale 50/50 100%

Infiltrati infiammatori 11/50 22%

Ispessimento membrana basale 42/50 84%

Le varie alterazioni istologiche si presentano con una gravità variabile. Per cui, per ogni singolo aspetto anatomopatologico analizzato, è stata studiata la sua frequenza in relazione al suo grado di alterazione. Dai dati analizzati si riscontra che la fibrosi interstiziale è l’alterazione più frequentemente ritrovata in quanto è presente nel 100% dei casi. In 32 casi su 50 (64%) si ha una fibrosi lieve-moderata, mentre in 18 casi su 50 (36%) la fibrosi è moderata-grave. La seconda alterazione per frequenza è l’ispessimento della membrana basale, presente nell’84% dei pazienti studiati. Il 16% dei casi non mostra alterazioni della membrana basale, Il 50% (25 casi su 50) presenta ispessimento focale, il 34 % (17 casi su

69

50) presenta un ispessimento diffuso a carico della membrana. L’ipospermatogenesi, caratterizzata da ridotto numero di spermatozoi maturi, è riscontrata nel 36% dei nostri pazienti. In 14 casi su 50 (28%) la riduzione della spermatogenesi è solamente moderata lieve, mentre in 4 casi su 50 (8%) si presenta moderata-grave. La presenza di infiltrati infiammatori si ritrova nel 22% dei casi: in 7 casi su 50 (14%) sono presenti infiltrati focali, mentre in 4 casi su 50 (8%) l’infiltrato infiammatorio è diffuso. L’arresto maturativo si riscontra nel 28 % dei casi, e la Sertoli cell only syndrome , nel 14%. Nei pazienti con arresto maturativo esso è ritrovato in percentuali che vanno dal 2% al 60% del totale dei tubuli. In questi pazienti i tubuli con arresto maturativo sono interessati in un numero minore o uguale al 10 % nella maggior parte dei casi (7/50 o 14%). Pazienti con un interessamento tra il 10% e il 50 % dei tubuli sono 5/50 (10%), mentre 2 pazienti su 50 (4%) presentano un arresto maturativo in un numero di tubuli maggiore o uguale al 50%. Nel 14% della popolazione presa in esame sono stati ritrovati Tubuli con sole cellule di Sertoli e in questi pazienti rappresentano una percentuale che va dal 5% al 70 % del totale dei tubuli. Solo 2 pazienti su 50 (4%) presentano percentuali maggiori o uguali del 60% di tubuli con sole cellule di Sertoli, mentre la maggior parte, 5 su 50 (10%), hanno meno del 10 % dei tubuli con sole cellule di Sertoli e assenza di cellule germinali. Le alterazioni istologiche sono in genere presenti simultaneamente. Infatti, tranne che in 1 caso su 50 pazienti esaminati, coesistono almeno due delle alterazioni istologiche prese in esame.

Tabella 9. Frequenza dei vari gradi di alterazioni istologiche nei pazienti affetti da varicocele.

Fibrosi interstiziale Assente Lieve-moderata Moderata-grave

0% 64% 36%

Ispessimento della membrana basale Assente Ispessimento focale Ispessimento diffuso 16% 50% 34%

Ipospermatogenesi Assente Lieve-moderata Moderata-grave

64% 28% 8%

Infiltrati infiammatori

interstiziali

Assenti Focali Diffusi

78% 14% 8%

Arresto maturativo ≤ 10% 10%-50% ≥50%

14% 10% 4%

Sertoli cell only syndrome ≤ 10% 10-50% ≥50%

70

Tra il 2018 e il 2019, sono stati sottoposti ad intervento chirurgico di orchidopessi 42 pazienti pediatrici e tra questi sono stati inclusi nello studio 25 bambini affetti da criptorchidismo monolaterale: 14 presentavano testicolo non disceso destro e 11, testicolo non disceso sinistro.

L’età media del campione è di 6.08 anni (range: 23 mesi-11 anni). Guardando alle distribuzioni di età nei due gruppi non risultano differenze significative. E’ stata testata la significatività sulla differenza delle medie tramite il test di Student, descritto in seguito, e risultante in un p-value di 0.211, superiore al limite di accettabilità di 0.05. Dei 25 pazienti, 21 appartengono allo stadio 1 della classificazione secondo Tanner e 4 allo stadio 2. All’ecografia pre-operatoria, abbiamo osservato che i testicoli criptorchidi avevano dimensioni minori rispetto a quello controlaterale. In particolare, 10 pazienti (il 40%) presentavano una riduzione del volume compresa tra il 10 e il 20% rispetto ai valori normali (GRUPPO A) e 15 bambini (il 60%) presentavano una riduzione delle dimensioni testicolari maggiore del 21% rispetto alle dimensioni nella popolazione pediatrica di controllo335 (GRUPPO B). E’ presente una differenza significativa tra i due gruppi a livello di distribuzione del volume, valutata similmente all’età e dal p-value di 0.03. Per riassumere i risultati istologici ottenuti mediante la biopsia intraoperatoria, abbiamo utilizzato una “severity scale”, ossia un sistema che quantifica i dati anatomopatologici. Non risultano differenze significative tra i gruppi A e B per nessuna categoria elencata: i valori del p-value associato compaiono in tabella e sono tutti superiori al limite di accettabilità. Per stabilire il futuro potenziale di fertilità abbiamo considerato il Fertility Index (FI), i cui valori sono stati calcolati e paragonati con quelli della popolazione generale: nei pazienti criptorchidi, i valori sono risultati inferiori rispetto ai valori normali.340 Nel gruppo A, in cui la riduzione del volume testicolare è del 10-20%, 8 su 10 bambini (80%) hanno un Fertility Index superiore al 50% rispetto ai valori normali e il restante 20% un Fertility index minore del 50%. I gruppo B, costituito da pazienti con volume testicolare ridotto tra il 21% e l’ 80%, il 26.7% (4 bambini su 15) ha mostrato un Fertility index minore del 50%, mentre il 73.3% (11 bambini su 15) ha un FI maggiore del 50%.

71

Tabella 10. Confronto tra i volumi misurati e i valori normali dei volumi testicolari nei due gruppi di pazienti affetti da criptorchidismo.

PAZIENTE