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Espressione dell'mRNA del TGF-β negli erosomi come biomarcatore di risposta al trattamento con anti-PD1 in pazienti con melanoma: studio preliminare di correlazioni cliniche e radiomiche.

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DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Magistrale in Farmacia

TESI DI LAUREA

ESPRESSIONE DELL’mRNA DEL TGF-β NEGLI ESOSOMI COME

BIOMARCATORE DI RISPOSTA AL TRATTAMENTO CON ANTI-PD-1 IN

PAZIENTI CON MELANOMA: STUDIO PRELIMINARE DI

CORRELAZIONI CLINICHE E RADIOMICHE

Relatori:

Candidata:

Prof.ssa Alma Martelli

Giuditta Beucci

Prof. Vincenzo Calderone

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Sommario  

RIASSUNTO  ...  6   1. INTRODUZIONE  ...  9   1.1 Epidemiologia  ...  10   1.1.1 Epidemiologia mondiale  ...  10   1.1.2 Epidemiologia in Italia  ...  12   1.2 Fattori di rischio  ...  15  

1.3 Sintomi e segni di riconoscimento del melanoma  ...  17  

1.4 Diagnosi per il melanoma  ...  18  

1.5 Classificazione della malattia  ...  20  

1.6 Crescita del melanoma  ...  22  

1.7 Melanoma metastatico a distanza (DMM)  ...  22  

1.8 Stadiazione del melanoma  ...  23  

1.9 Report diagnostico  ...  25   1.10 Terapia  ...  27   1.10.1 Chirurgia  ...  28   1.10.2 Terapie loco-regionali  ...  29   1.10.3 Radioterapia  ...  30   1.10.4 Terapia farmacologica  ...  30   1.10.4.1 Chemioterapia  ...  31   1.10.4.2 Target Therapy  ...  32   2. IMMUNOTERAPIA  ...  37  

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2.2 Caratteristiche dell’induzione spontanea di immunità antitumorale  ...  39  

2.2.1 Checkpoint immunologici  ...  42  

2.2.1.1 Immunoterapia: farmaci anti-PD-1  ...  54  

2.2.1.1.1 Indicazioni Terapeutiche per il melanoma  ...  57  

2.3 Biomarcatori per la valutazione della risposta clinica all’immunoterapia  ...  58  

2.4 La biopsia come metodica di indagine: tessuto versus plasma  ...  61  

2.5 Radiomica  ...  64  

2.5.1 Tumore e Radiomica: proprietà biologiche e radiologiche  ...  67  

3. RAZIONALE ED OBIETTIVI  ...  69  

3.1 Razionale  ...  69  

3.2 Obiettivi  ...  70  

4. DISEGNO DELLO STUDIO  ...  70  

4.1 Criteri di inclusione  ...  72  

5. PAZIENTI E METODI  ...  72  

5.1 Pazienti  ...  72  

5.2 Metodi  ...  72  

5.2.1 Isolamento dell’RNA esosomiale  ...  73  

5.2.2 Retrotrascrizione dell’RNA a cDNA e amplificazione tramite digital droplet PCR  ...  77  

5.2.3 Metodi della Radiomica  ...  81  

5.2.3.1 Le Features in Radiomica  ...  83  

5.2.3.2 Il Processo di Analisi Radiomica  ...  85  

(5)

7. RISULTATI  ...  90  

7.1 Caratteristiche cliniche dei pazienti  ...  90  

7.2 Tassi di risposte  ...  92  

7.3 Studio dell’influenza delle caratteristiche del paziente e del tipo di trattamento sulla risposta clinica  ...  92  

7.4 Associazione dei livelli di espressione dell’mRNA esosomiale dei biomarcatori con la PFS  ...  94  

7.5 Analisi molecolare dell’espressione dell’mRNA esosomiale dei biomarcatori  ...  110  

7.6 Correlazione tra i livelli di espressione dell’mRNA esosomiale dei biomarcatori  ...  112  

7.7 Ulteriori correlazioni tra livelli di espressione dell’mRNA esosomiale dell’IFN-γ e del TGF-β, dati clinici e di radiomica  ...  113  

7.7.1  Sviluppo  di  algoritmo  predittivo  ...  116  

8. DISCUSSIONE E CONCLUSIONE  ...  118  

Bibliografia  ...  123  

Sitografia  ...  145  

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RIASSUNTO

Introduzione: L’immunoterapia è una nuova strategia terapeutica che ha dimostrato risultati promettenti nel trattamento di molti tumori, tra cui anche il melanoma metastatico. Tuttavia, non abbiamo ancora a disposizione biomarcatori utili per poter predire precocemente la risposta clinica al trattamento immunoterapico e consentire, quindi, una seleziona accurata dei pazienti che risponderanno la trattamento.

Obiettivi: : I) Valutare i livelli di espressione dell’mRNA esosomiale del PD-L1, dell’IFN-γ e del TGF-β all’inizio del trattamento al fine di individuare un potenziale biomarcatore predittivo di risposta.

II) Correlare i risultati delle analisi genetiche con i dati clinici e di radiomica.

Disegno dello studio e metodi: Studio farmacogenetico retrospettivo, in pazienti affetti da melanoma metastatico (III o IV stadio) e candidati al trattamento con immunoterapia (nivolumab o pembrolizumab). Ad ogni paziente arruolato, all’inizio del trattamento è stato prelevato un campione ematico e, dal plasma raccolto, sono stati primariamente isolati gli esosomi e successivamente analizzati i livelli di espressione dell’mRNA esosomiale del PD-L1, dell’IFN-γ e del TGF-β. Contemporaneamente, dalle immagini radiologiche a disposizione sono state estratte le “features” per ricavare i parametri di forma e trama tumorali, strettamente legati al processo fisio-patologico che sottende la lesione neoplastica.

Analisi dei risultati e statistiche: Il valore in copie/ml dei livelli di espressione dell’mRNA esosomiale dei geni PD-L1, IFN-γ, TGF-β è stato normalizzato sui valori dell’espressione dell’mRNA della β -actina considerata come gene housekeeping. Tutti i valori normalizzati sono

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stati riportati come abbondanza frazionale. Le analisi statistiche sono state effettuate con i software SigmaPlot®, GraphPad ® e MatLab®.

Risultati e limiti: Stratificando il totale dei 23 pazienti arruolati – in prima o seconda linea di trattamento con nivolumab o pembrolizumab – in due gruppi distinti in funzione dei livelli di espressione di TGF-β mRNA (alti vs bassi), è stata osservata una differenza statisticamente significativa in termini di PFS (non raggiunta vs 1,87 mesi, p=0,02). Tale differenza è stata mantenuta anche stratificando l’analisi solamente per i 18 pazienti che facevano uso degli inibitori di checkpoint immunitari come terapia di prima linea (PFS non raggiunta in pazienti con alti livelli di TGF- β mRNA vs PFS di 1,83 mesi in pazienti con bassi livelli di TGF-β mRNA, p=0,0194). Per il sottogruppo di soggetti (10/23=43,48%) su cui sono state eseguite indagini di radiomica, attraverso una Pearson Correlation Matrix, sono state messe in evidenza una serie di correlazioni dirette e inverse tra le varie features radiomiche e la serie di parametri clinici e laboratoristici. In maniera più specifica, prese singolarmente le singole lesioni metastatiche, si è evidenziata una correlazione diretta tra la sfericità della massa tumorale e i valori di FrAb di INF-γ (rho=0,21 p-value=0,0039) e TGF-β (rho=0,17, p-value=0,0215), così come tra l’entropia della matrice di co-occorrenza dei livelli di grigio e i medesimi parametri (INF-γ: rho=0,2 p-value=0,0066; TGF-β: rho=0,26, p-value=0,0003), che invece correlano inversamente con i valori di energia (INF-γ: rho=-0,14 p-value= 0,0489; TGF-β: rho=-0,17 p-value=0,0225).

Dalle solite analisi correlative rivalutate considerando, nel singolo soggetto, le lesioni metastatiche nel loro complesso, abbiamo ottenuto

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una correlazione diretta della progressione di malattia sia con il numero di metastasi che con il volume complessivo delle masse metastatiche.

Conclusioni: Lo studio ha dimostrato che la valutazione dell’espressione dell’mRNA del TGF-β a partire da esosomi plasmatici può costituire una metodica non invasiva per predire e monitorare nel tempo la risposta al trattamento immunoterapico in pazienti affetti da melanoma.

I risultati di biopsia liquida e radiomica concorrono nella solita direzione nel descrivere l’aumentata resistenza alla terapia con inibitori di PD-1. Le features radiomiche, che definiscono sia l’immagine tumorale nella sua tridimensionalità che le caratteristiche morfologiche e di trama delle lesioni metastatiche, correlando direttamente o indirettamente con i parametri di biopsia liquida, rafforzano l’ipotesi che i biomarcatori sono diretta espressione sia dell’attività neoplastica che del pathway maggiormente coinvolto nella progressione di malattia, avvalorando l’ipotesi del loro utilizzo come predittori di scelta per la valutazione dell’efficacia dell’immunoterapia nei pazienti con melanoma con setting metastatico. Infine, l’algoritmo predittivo automatizzato ci permette di prevedere come le features radiomiche correlino con i dati laboratoristici e di clinica. L’integrazione di queste informazioni, definiscono nell’insieme come un tumore possa rispondere al trattamento.

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1. INTRODUZIONE

Il melanoma è un tumore maligno della cute che si origina dalla trasformazione dei melanociti, cellule cutanee presenti nello strato più profondo dell’epidermide che producono e contengono melanina (Figura 1), pigmento cutaneo responsabile del “colore proprio” della pelle e di quello “acquisito” dopo l’esposizione ai raggi solari (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

Figura 1: Strati cutanei e identificazione dei melanociti produttori di melanina.

L’esposizione ai raggi solari, ed in particolare a quelli ultravioletti, porta alla comparsa di melanosomi, metaboliti tossici prodotti dai melanociti (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole) che, migrando nei cheratinociti, sinterizzano ed accumulano la melanina (Thong et al. 2003).

La melanogenesi è un processo biochimico che porta alla sintesi della melanina in seguito all’attivazione dell’enzima tirosinasi da parte dei melanociti.

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Con l’esposizione ai raggi ultravioletti, l’enzima tirosinasi catalizza la reazione di ossidazione sia dell’aminoacido tirosina (o monoidrossifenilalanina) a DOPA (o diidrossifenilalanina), sia dell’amminoacido DOPA a DOPA-Chinone, entrambi substrati di partenza da cui ha origine la sintesi della melanina. Mentre la tirosinasi trasforma lentamente la tirosina in melanina, la formazione della stessa, a partire dall’amminoacido DOPA, avviene invece più rapidamente (Anastasi Giuseppe et al., Trattato di Anatomia Umana, 2012).

La melanina, prodotto finale di questa combustione (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole), ha una vera e propria funzione protettiva nei confronti dei danni cutanei causati delle radiazioni ultraviolette (Cantrell et al. 2001) e viene eliminata attraverso le cellule più superficiali dell’epidermide colorando cosi la pelle di un colore definito “abbronzatura” (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

1.1 Epidemiologia

1.1.1 Epidemiologia mondiale

Il melanoma è una neoplasia potenzialmente fatale la cui incidenza (MacKie et al. 2009) e mortalità nel mondo (Markovic et al. 2007) sono in continuo aumento.

L’incidenza più alta è stata registrata a Queensland (Australia) dove i dati attestano che, su un campione annuo di 105 persone, 55.8/105 pazienti sono uomini mentre 41.1/105 pazienti sono donne, seguita poi dalla Nuova Zelanda con 34.8 pazienti uomini e 31.4 pazienti donne.

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Negli Stati Uniti 1 americano su 63 svilupperà il melanoma: è il quinto tumore più diffuso negli uomini ed il sesto nelle donne (Rastrelli et al. 2014).

Il tasso di incidenza in Europa è di 9 casi su 100.000 annui (Linee Guida Aiom – Melanoma – 2018) e la probabilità di riscontrare la patologia è più alta nei paesi del Nord, come la Svizzera ed i Paesi Scandinavi quali la Norvegia, Svezia e Danimarca (12-17 casi ogni 100.000 annui) (Linee Guida Aiom- Melanoma- 2018), e più bassa nei paesi del Sud e nell’Europa Orientale come la Lettonia, Lituania, Estonia, Bielorussia e Serbia (MacKie et al. 2009).

Questa diversità è spiegabile dal fatto che in Europa Meridionale, si ha una maggior protezione dai raggi UV data dalla pelle altamente pigmentata e da una esposizione al sole di tipo cronico piuttosto che intermittente (Rastrelli et al. 2014).

Il tasso di incidenza varia anche a seconda della razza (Linee Guida Aiom – Melanoma -2018): la popolazione caucasica difatti ha un rischio circa 10 volte maggiore di sviluppare melanoma cutaneo rispetto alle popolazioni africane, asiatiche ed ispaniche (Rastrelli et al. 2014) (Figura 2).

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Figura 2: Analisi de tempo di sopravvivenza tra 1106 afro-americani e 212.721 caucasici con (A) melanoma a diffusione superficiale, (B) melanoma nodulare, (C) melanoma lentigo maligna e (D) melanoma acrale lentigginoso dall'epidemiologia di sorveglianza. Le differenze tra le curve di sopravvivenza sono significative (P = 0.05).

1.1.2 Epidemiologia in Italia

I casi di melanoma sono maggiormente diffusi nelle regioni del Nord e del CentroItalia anziché nelle regioni del Sud, dove i tassi di incidenza sono fino a due volte più bassi (Linee Guida Aiom – Melanoma – 2018).

Annualmente l'incidenza del melanoma in Italia è pari a 5-7 casi ogni 100.000 abitanti (Rastrelli et al. 2014) e circa 11.500 sono i nuovi casi di melanoma che vengono diagnosticati all'anno (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

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Solo nel 2017, 14.000 sono stati i nuovi casi di malattia in Italia con un’incidenza maggiore negli uomini (+ 4.4% annui) rispetto alle donne (+ 3.1% annui) (Linee Guida Aiom – Melanoma – 2018) (Figura 3).

Figura 3: Tasso di incidenza per il melanoma nel periodo 1975-2010 nella popolazione italiana maschile e femminile.

Secondo alcuni studi, questa diversità di manifestazione di malattia, varia solo in relazione al sesso sostenendo che gli uomini hanno una probabilità di sviluppare melanoma 1.5 volte più alta rispetto alle donne. Altri studi, sostengono invece che, la diversità deve essere relazionata non solo al sesso ma anche all'età del paziente. Pertanto, è stato osservato che, fino ai 40 anni di età, il tasso di incidenza è maggiore nelle donne ma, non appena vengono raggiunti i 75 anni di età, l'incidenza di malattia cambia ed aumenta di quasi tre volte negli uomini (145.6 pazienti uomini ogni 100.000 abitanti) piuttosto che nelle donne (47.3 pazienti donne ogni 100.000 abitanti) (Rigel 2010) (Figura 4).

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Figura 4: Tasso di incidenza per il melanoma, per classi di età, nella popolazione italiana maschile e femminile.

Infine, è stato osservato che il melanoma, a differenza di altri tumori solidi, colpisce prevalentemente i giovani e le persone di mezza età. E' difatti possibile osservare un aumento dell'incidenza di malattia lineare dai 25 anni fino ai 50 anni, ed una diminuzione all'aumentare dell'età, soprattutto nelle donne (Rastrelli et al. 2014) (Figura 5).

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Figura 5: Analisi de tempo di sopravvivenza di pazienti con melanoma suddivisi per classi di età.

1.2 Fattori di rischio

La predisposizione all’insorgenza e allo sviluppo della malattia dipendono sia dalla sensibilità individuale alla luce solare sia da alcuni fattori di rischio come ad esempio le scottature gravi prima dei 15 anni (A. Testori et al ., Marzo 2017 - La Collana del Girasole) (indici di un’esposizione intermittente al sole, che ne aumenta il rischio) (Rastrelli et al. 2014), le ustioni nei soggetti con carnagione particolarmente chiara (fototipo I e II), l’esposizione intensa ai raggi solari nei primi vent’anni di vita, l’uso frequente di lampade abbronzanti prima dei 30 anni (A. Testori et al ., Marzo 2017 - La Collana del Girasole), l’immunodeficienza dovuta a

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trapianti, terapie o malattie come l’AIDS (Melanoma – www.airc.it), aver avuto già un melanoma oppure aver avuto familiarità con questa malattia (Rastrelli et al. 2014).

Poiché l’insorgenza della malattia nei pazienti con una predisposizione genetica avviene in giovane età (<40 anni) e la familiarità costituisce un forte rischio di malattia, sono state ricercate le basi genetiche del melanoma nelle famiglie colpite (Rastrelli et al. 2014).

Altre caratteristiche fenotipiche quali i capelli rossi, la pelle e gli occhi chiari, le numerose lentiggini e l’incapacità di abbronzarsi, aumentano del 50% il rischio di sviluppare la malattia (Titus-Ernstoff et al. 2005). E’ pertanto raccomandabile evitare l’esposizione prolungata al sole soprattutto nelle ore centrali e senza l’utilizzo di creme solari che riflettono, assorbono e/o dissipano le radiazioni A e le radiazioni UV-B (A. Testori et al ., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

I raggi ultravioletti (UV) sono delle radiazioni elettromagnetiche invisibili, che si distinguono in base alla diversa lunghezza d’onda. Poiché i raggi UV-A (320-400 nm) ed i raggi UV-B (290-320nm) perforano l’atmosfera fino a raggiungere la superficie terrestre, riescono a penetrare negli strati cutanei più profondi, causando così eritemi, ustioni, invecchiamento cutaneo e tumori della pelle, tra cui il melanoma (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

Tra i fattori di rischio sono coinvolti anche il nevo displastico, in quanto è ritenuto avere un ruolo come precursore potenziale ma non sempre effettivo nell’insorgenza del melanoma (Elder 2010), ed il nevo melanocitico (Rastrelli et al. 2014).

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Il nevo displastico è un neo atipico che differisce da quelli definiti “abitatori normali” della pelle essendo di dimensioni più grande, rialzato rispetto alla superficie corporea, con un margine irregolare e dal colore disomogeneo; mentre il nevo melanocitico è un accumulo di cellule benigne, formate da una crescita anomala dei melanociti (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

Inoltre, oggi si ritiene che il 25% dei casi di melanoma si verifica su un neo congenito, ossia un neo presente fin dalla nascita o entro due anni dalla nascita, (Bevona and Sober 2002) con un rischio decisamente maggiore rispetto a quello che si sviluppa sulla cute normale (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

Un’indagine recente ha evidenziato che i pazienti con più di 100 nevi hanno un rischio, sette volte superiore, di sviluppare la malattia (Gandini et al. 2005) e che le dimensioni dei nevi, influiscono sulla sua manifestazione: maggiore è la loro dimensione (oltre i 5 mm), maggiore è il rischio di insorgenza del tumore (Watt et al. 2004).

E’ importante che avvenga un controllo periodico, da parte di un dermatologo, dei nevi congeniti, di quelli acquisiti (cioè sviluppati durante o successivamente all’infanzia e/o adolescenza) (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole) e dei nevi atipici da cui dipende la possibilità che si sviluppi il melanoma (Gandini et al. 2005).

1.3 Sintomi e segni di riconoscimento del melanoma

Il melanoma è un tumore asintomatico, riconoscibile con la comparsa, sulla cute sana, di macchie scure in accrescimento o con la modifica della

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I sintomi come il prurito, la secrezione di siero o il sanguinamento possono eventualmente manifestarsi solo nella fase avanzata della malattia (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

1.4 Diagnosi per il melanoma

La diagnosi precoce del melanoma maligno è molto importante per ridurne la mortalità.

L’autoesame della pelle e la capacità di identificare le caratteristiche clinicamente macroscopiche del melanoma, costituiscono un rapito metodo di screening della malattia (Rastrelli et al. 2014).

Poiché il riconoscimento precoce del melanoma sta diventando una priorità per la salute pubblica (Bevona and Sober 2002), sono stati definiti dei criteri, chiamati “parametri dell’ABCDE”, utili per aumentare l’accuratezza dell’autoesame (Robinson and Turrisi 2006).

Sono cinque le tecniche con cui un melanoma può essere individuato fin dall’inizio del suo sviluppo e sono facilmente ricordabili perché i loro nomi cominciano con le prime cinque lettere dell’alfabeto (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole):

1. Asimmetria nella forma (non c’è una corrispondenza tra le due metà della macchia scura). (Figura 6).

2. Bordo: il contorno della macchia è irregolare. (Figura 7).

3. Colore: l’aspetto della macchia non è uniforme, talvolta possono essere presenti sfumature più scure o aree più bianche. (Figura 8). 4. Diametro: non c’è una regolarità nelle dimensioni delle macchie.

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5. Evoluzione: intesa come variazione di forma e colore in un arco

temporale breve (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del

Girasole), è un parametro molto importante soprattutto per il melanoma nodulare (Friedman et al. 1985).

Figura 6. Asimmetria Figura 7. Bordo

Figura 8. Colore Figura 9. Diametro

Questi criteri servono per allertare operatori sanitari e dermatologi (Rastrelli et al. 2014) indirizzandoli verso una più accurata valutazione del paziente con esami più approfonditi (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole) come:

- la microscopia in epiluminescenza (o dermoscopia) un esame che, attraverso una telecamera o una lente di ingrandimento, permette di osservare il pigmento nella lesione, permettendo così di stabilirne la pericolosità;

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- il microscopio laser confocale, uno strumento che permette di osservare un neo a livello cellulare consentendo una valutazione simile a quella dell’esame istologico tradizionale;

- l’esame istologico vero e proprio che permette di dare la diagnosi definitiva in seguito alla biopsia del tessuto di cui si sospetta la presenza di cellule tumorali.

1.5 Classificazione della malattia

Le diverse caratteristiche cliniche ed istologiche differenziano il melanoma cutaneo in tre sottotipi principali:

- Il melanoma a diffusione superficiale (SSM) è il tumore maggiormente diffuso e costituisce il 70% dei casi di melanoma cutaneo. E’ spesso associato ad un’esposizione intermittente al sole ed i siti di insorgenza dipendono dal sesso: nelle donne le aree maggiormente colpite sono gli arti superiori e la parte posteriore degli arti inferiori mentre negli uomini è la schiena. Dal punto di vista clinico, l’SSM si può mostrare con una varietà di colori (che vanno dal marrone chiaro, grigio, nero, violaceo, rosa e raramente blu o bianco), un margine con sporgenze irregolari fortemente accentuate ed una superficie talvolta rialzata per diversi millimetri dall’epidermide (Rastrelli et al. 2014).

- Il melanoma nodulare (NMM) rappresenta il 5% dei casi di melanoma cutaneo ed è correlato ad un’esposizione intermittente al sole. È un tumore che si manifesta spesso sul tronco o sugli arti dei pazienti, ed è maggiormente diffuso negli uomini anziché nelle donne. Clinicamente, l’NMM si presenta con una colorazione uniforme (marrone, nera o blu-nera), mostrandosi spesso ulcerato (come un polipo ulcerato), come una placca rialzata con contorni irregolari o come noduli a superficie liscia (Rastrelli et al. 2014). Istologicamente, si presenta come un tumore

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invasivo cutaneo, composto da piccoli aggregati di cellule tumorali che insieme formano il vero e proprio nodulo tumorale complessivo (Duncan 2009).

- Il melanoma lentigo maligna (LMM) rappresenta dal 4% al 15% dei casi di melanoma cutaneo che, a differenza dell’SSM e dell’NMM, è correlato ad un’esposizione prolungata ai raggi solari ed all’aumento dell’età (Rastrelli et al. 2014). Solitamente si manifesta sul derma di testa e sul collo (Duncan 2009) e possono volerci decenni prima che questo tumore invada il derma papillare (Markovic et al. 2007). Clinicamente, l’LLM si può presentare con una varietà di colori (che vanno dal marrone su uno sfondo marrone chiaro o nero), con un contorno irregolare e dalla superficie estesa e piatta nonostante il focus di invasione possa essere individuato in rilievo.

Istologicamente, è caratterizzato da una proliferazione di cellule annidate negli strati basali dell’epidermide (Rastrelli et al. 2014).

Meno comune tra i pazienti caucasici, è il melanoma lenticolare acrale (ALM) che costituisce solo il 5% dei casi di melanoma cutaneo ma, al contempo, è il melanoma più comune e diffuso tra la popolazione africana, quella asiatica e quella ispanica. Ad essere maggiormente colpiti sono le donne ed i pazienti anziani (Rastrelli et al. 2014) in cui il tumore compare sulla pelle glabra e sul letto ungueale di pollice o alluce (Markovic et al. 2007). Sempre nei pazienti anziani, generalmente uomini, di cui l’età è compresa tra i 60 ed i 70 anni, si può manifestare anche il melanoma desmoplastico (DM) comunemente diffuso sulle mucose e sul derma di testa e collo a causa di un’esposizione nociva al sole.

Questo tumore solitamente si concretizza sulla cute sottoforma di placca o come un nodulo eritematoso (di colore chiaro o pallido) ed è caratterizzato da alti tassi di recidiva locale, a causa della sua crescita

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altamente infiltrativa, ma raramente metastatizza ai linfonodi (Rastrelli et al. 2014).

1.6 Crescita del melanoma

Il melanoma è caratterizzato da due fasi di crescita (Clark Jr. et al. 1989): - radiale, ossia una diffusione orizzontale del tumore attraverso

l’epidermide, con piccoli nidi di cellule dermiche atipiche che possono diffondersi fino allo strato superiore del derma chiamato strato papillare.

- verticale, contraddistinta da una crescita perpendicolare del tumore attraverso l’epidermide, formando grandi nidi cellulari e noduli asimmetrici.

La distinzione biologica tra la fase di crescita radiale e quella verticale riflette probabilmente la distinzione delle caratteristiche fenotipiche delle cellule. I melanomi che mantengono una fase di crescita radiale non metastatizzano quasi mai, lasciando presupporre che le cellule di melanoma metastatico si formano durante la fase di crescita verticale (Clark Jr. et al. 1989).

1.7 Melanoma metastatico a distanza (DMM)

Il melanoma cutaneo può sviluppare metastasi in qualunque organo o tessuto. Una percentuale di pazienti compresa tra il 42% e il 59% sviluppa metastasi inizialmente a livello della pelle, del tessuto sottocutaneo e dei linfonodi a distanza. I più frequenti siti di metastasi viscerali sono polmone, fegato, cervello, ossa e intestino. Le analisi del database del melanoma del Comitato Americano Congiunto sul Cancro hanno indicato differenti aspettative di sopravvivenza a seconda delle metastasi dei

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pazienti. In particolare, pazienti aventi metastasi a livello della pelle, del tessuto sottocutaneo e dei linfonodi a distanza, hanno mostrato una sopravvivenza media di 18 mesi; pazienti con metastasi polmonari hanno presentato una sopravvivenza media di 12 mesi; infine, pazienti con metastasi viscerali, diverse da quelle polmonari, hanno avuto una sopravvivenza media di 7 mesi (Balch et al. 2009).

L’università dell’Alabama ha condotto uno studio su 200 pazienti con melanoma al IV stadio ed ha constatato un tasso di sopravvivenza ad un anno del 36% nel caso di pazienti con un solo sito metastatico, del 13% per pazienti con due siti metastatici e dell’1% per pazienti aventi tre o più siti di metastasi (Balch et al. 1983). Differentemente da questo studio, un’analisi multivariata condotta dall’ Istituto John Wayne ha mostrato che il numero dei siti metastatici, non è un significativo fattore prognostico indipendente, aggiungendo anche che alcuni siti metastatici, hanno un effetto negativo dominante sulla sopravvivenza (Barth et al. 1995).

1.8 Stadiazione del melanoma

Lo stadio clinico del tumore è utile allo specialista (Dermatologo, Oncologo o Chirurgo) per valutare la prognosi e il trattamento più idoneo per ciascun paziente sulla base delle sue condizioni generali, delle condizioni del tumore e della sua estensione (Melanoma- Linee guida Aiom).

Per valutarlo, è necessario conoscere l’estensione della malattia e l’eventuale presenza di metastasi (ossia la diffusione del tumore al di fuori dell’organo in cui ha avuto origine) [A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole].

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Per definire una stadiazione corretta, a seconda dei segni e sintomi che il paziente presenta, il clinico può richiedere diversi esami diagnostici. Generalmente, per i pazienti privi di sintomi vengono richiesti esami quali, esami del sangue, radiografia del torace, ecografia del fegato e delle stazioni linfonodali mentre indagini più approfondite come la tomografia computerizzata (TC), risonanza magnetica nucleare (RMN) o tomografia con emissione di positroni (PET), vengono richieste per pazienti con sintomi particolari o di cui si sospettano possibili metastasi [A. Testori et al ., Marzo 2017 - La Collana del Girasole ].

La tomografia computerizzata (TC) è una tecnica radiologica, indolore e ben tollerata che, in poco tempo, permette una valutazione accurata delle strutture interne del corpo apportando un importante dose di raggi X. In ambito oncologico, il radiologo prima della TC procede sottoponendo il paziente agli esami del sangue e delle urine e all’iniezione in vena di un mezzo di contrasto contenente iodio (Haubitz et al. 1991).

Nei pazienti allo stadio IIC-III appare consigliabile l’impiego di una TAC total body con mezzo di contrasto e anche per i pazienti con metastasi in transito si consiglia lo stesso tipo di stadiazione (Melanoma-Linee guida Aiom).

La risonanza magnetica nucleare (RMN) permette di ottenere una serie di immagini in sezione trasversale delle strutture interne dell’organo in esame e differisce dalla TC per l’utilizzo dei campi magnetici anziché dei raggi X, per la maggior durata dell’esame e per la ridotta tollerabilità (in quanto il paziente viene inserito all’interno di un cilindro metallico). Caratteristica comune è l’iniezione di un mezzo di contrasto nel braccio, con lo scopo di migliorare la qualità delle immagini (Popolizio et al. 1997). Una RMN encefalo è auspicabile sia per dubbie lesioni evidenziate alla TAC, sia per definire numero e dimensione delle lesioni ai fini di un eventuale trattamento radioterapico (Melanoma-Linee guida Aiom).

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Infine, la tomografia ad emissione di positroni (PET) è una procedura diagnostica che sfrutta la capacità delle cellule tumorali di assorbire più glucosio di quelle normali, identificando così la presenza eventuali di tumori. Circa due ore prima dell’esame, al paziente viene somministrato in vena un composto contenente glucosio marcato radioattivamente che si diffonderà in tutto il corpo consentendo successivamente l’analisi delle zone dove l’assorbimento sarà avvenuto maggiormente (Griffeth 2005).

Generalmente, il melanoma viene classificato secondo quattro stadi (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole):

• Stadio I e II: esenti da metastasi.

• Stadio III: infiltrazione delle metastasi ai linfonodi regionali. • Stadio IV: diffusione a distanza delle metastasi.

Nei pazienti con sospetto stadio IV di malattia è consigliato un accertamento bioptico (con ago-sottile o incisionale) della lesione metastatica, soprattutto se TAC o PET/TAC non sono dirimenti. Qualora non si abbia a disposizione alcun campione per la determinazione dello status mutazionale del paziente, è indicata la biopsia della lesione metastatica per l’analisi mutazionale dei geni

BRAF, NRAS e/o c-KIT (Melanoma-Linee guida Aiom).

1.9 Report diagnostico

I due sistemi principali di cui fa uso il Patologo per descrivere la profondità dell’invasione del melanoma sono i metodi di Clark e di Breslow.

Il metodo di Clark classifica i melanomi (Figura 10) in base agli strati cutanei coinvolti (Clark et al. 1969):

§ Lesione di Clark di I Livello, si tratta di un melanoma confinato all’epidermide definito in “situ” ossia dentro la membrana basale.

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§ Lesione di Clark di II Livello, il melanoma subisce una fase di crescita radiale ed inizia ad infiltrarsi nel derma papillare.

§ Lesione di Clark di III Livello, espansione totale del melanoma nel derma papillare.

§ Lesione di Clark di IV Livello, il melanoma invade il derma in profondità fino a raggiungere lo strato reticolare.

§ Lesione di Clark di V Livello, estensione del melanoma fino ai tessuti sottocutanei.

Figura 10: Classificazione del melanoma secondo i metodi di Clark e di Breslow.

Il metodo di Breslow è quello più ampiamente utilizzato per descrivere la profondità dell’invasione del melanoma (Breslow 1970) e costituisce un indice attendibile di sopravvivenza (Giannetti Alberto, Trattato di Dermatologia 2°Ed ., 2002].

§ Melanomi con profondità < 1mm hanno un indice di sopravvivenza a 7 anni del 95%.

§ Melanomi con profondità compresa tra 1 e 1,69 mm, hanno un basso rischio.

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§ Melanomi con profondità compresa tra 1,70 e 3,99 mm, hanno un rischio moderato.

§ Melanomi con profondità > 4 mm, hanno un rischio alto.

In entrambi i sistemi, più aumenta la profondità dell’invasione e più aumenta il rischio di metastasi. Il rischio che il melanoma metastatizzi è relativo e non assoluto in quanto i melanomi più piccoli di 1mm (o Lesione di Clark di II livello) raramente metastatizzeranno (Clark Jr. et al. 1989).

Infine, per pazienti con lesioni di profondità intermedia (tra 1 e 4 mm), è preferibile procede con la mappatura del linfonodo sentinella (ovvero il primo linfonodo a ricevere linfa direttamente dal tumore e il primo ad essere coinvolto da eventuali metastasi) per valutare con accuratezza se il bacino linfonodale è stato metastatizzato dal melanoma. L’esame viene svolto iniettando un colorante o un radionuclide intorno al sito del tumore primario per identificare il primo linfonodo drenante (o linfonodo sentinella) (Brady and Coit 1997).

1.10 Terapia

Nella pratica clinica, la scelta del trattamento dipende dall’estensione della malattia, dalla necessità o meno di avere una risposta tempestiva e duratura e dall’eventuale presenza di patologie concomitanti (Melanoma - www.airc.it).

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1.10.1 Chirurgia

La chirurgia è spesso risolutiva nelle fasi iniziali della malattia e l’entità dell’intervento dipende dallo stadio del melanoma. Si ricorre alla chirurgia per rimuovere il tessuto malato e quello sano limitrofe con lo scopo di ridurre la presenza di cellule tumorali residue (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole). Qualora l’esame istologico confermasse la presenza di melanoma è necessario eseguire un secondo intervento chirurgico definito “di sicurezza”.

La chirurgia è l’unico trattamento potenzialmente curativo per i pazienti con melanoma in stadio I e II ed è anche la terapia più efficace per i pazienti con malattia in stadio III. In pazienti con melanoma in stadioIV, il ruolo della chirurgia è meno chiaro. Nei pazienti aventi tra 1 e 3 metastasi contemporaneamente in un determinato sito la chirurgia può ridurre le diffusioni ad altri siti. Nel caso in cui il trattamento chirurgico fallisca il paziente verrà sottoposto alla terapia sistemica (Ollila 2006). La chirurgia è spesso risolutiva nelle fasi iniziali della malattia e l’entità dell’intervento dipende dallo stadio del melanoma. Si ricorre alla chirurgia per rimuovere il tessuto malato e quello sano limitrofe con lo scopo di ridurre la presenza di cellule tumorali residue (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole). Qualora l’esame istologico confermasse la presenza di melanoma, è necessario eseguire un secondo intervento chirurgico definito “di sicurezza”.

Infine, si ricorre alla chirurgia per asportare i linfonodi solo nel caso in cui quelli sentinella, dovessero risultare positivi alla presenza di metastasi (Melanoma - www.airc.it).

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La metodica richiede l’esecuzione preoperatoria di una linfo-scintigrafia dinamica, al fine di individuare correttamente il linfonodo da asportare (Melanoma – Linee guida Aiom). La biopsia del linfonodo sentinella deve essere offerta a tutti i pazienti con melanoma primitivo con spessore superiore 1mm, indipendentemente dalle altre caratteristiche istopatologiche associate. In particolare, è raccomandata nei pazienti con lesioni a rischio intermedio (spessore di Breslow 1-4 mm) e nei melanomi spessi (>4mm) per una più accurata stadiazione e un maggior controllo loco-regionale della malattia (Melanoma – Linee guida Aiom).

1.10.2 Terapie loco-regionali

Le terapie loco-regionali prevedono la somministrazione di farmaci in dosi particolarmente elevate necessarie per il trattamento di lesioni cutanee e sottocutanee circoscritte a regioni specifiche del corpo (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

Nel caso del melanoma, il paziente viene sottoposto sia a elettro-chemioterapia, basata sulla combinazione di un farmaco chemioterapico con impulsi elettrici direttamente applicati sulle cellule tumorali per mezzo di un elettrodo (favorendo così la penetrazione del chemioterapico), sia a perfusione isolata di arto con chemioterapici, utile in caso di metastasi multiple localizzate a un arto (Melanoma - www.airc.it).

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1.10.3 Radioterapia

Si ricorre alla radioterapia come terapia adiuvante dopo la chirurgia in caso di metastasi ossee e cerebrali in associazione con altri trattamenti e nelle fasi finali della malattia per alleviarne i sintomi. Il vantaggio della radioterapia è quello di essere una terapia locale che agisce contro le cellule tumorali presenti nella zona irradiata, limitando il coinvolgimento delle cellule sane (Melanoma - www.airc.it).

Studi clinici retrospettivi hanno dimostrato che il melanoma è un tumore in parte radioresistente poiché il trattamento radioterapico è efficace solo nel 40% dei siti irradianti. Nei restanti casi, la mancanza di risposta potrebbe essere dovuta alla presenza di frazioni di cellule ipossiche e cloni cellulari aventi la capacità di riparare il danno provocato dalla reazione (Trinh 2008).

La radioterapia può dimostrarsi utile in presenza di metastasi sistematiche e viene usata di solito in associazione con la terapia sistemica (Forschner et al. 2013).

1.10.4 Terapia farmacologica

Le terapie farmacologiche impiegate per il trattamento del melanoma in fase avanzata comprendono sia nuovi approcci terapeutici “personalizzati”, come la terapia mirata a bersaglio molecolare (target therapy) e l’immunoterapia, sia approcci terapeutici più “classici” come la chemioterapia, a cui si ricorre soprattutto nel caso in cui le nuove tecniche conducano verso un fallimento terapeutico (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

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1.10.4.1 Chemioterapia

La chemioterapia è un tipo di trattamento che viene attuato a cicli il cui numero dipende dal tipo di tumore e dalla sua risposta ai farmici (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole). Il melanoma in fase metastatica è da sempre associato ad una cattiva prognosi. Differenti agenti chemioterapici hanno dimostrato una qualche attività quando impiegati in mono-chemioterapia tra cui dacarbazina, fotemustina e temozolomide mentre gli altri chemioterapici, vengono utilizzati in associazione (Bedane et al. 2013). Il trattamento medico con dacarbazina in mono-chemioterapia è stato a lungo considerato un trattamento standard (Serrone et al. 2000).

Fotemustina e temozolomide sono state confrontate in termini di efficacia e tollerabilità rispetto alla dacarbazina in tre distinti studi di Fase III che hanno dimostrato una non-inferiorità in termini di risposte obiettive (10-20%), tempo alla progressione (2-3 mesi) e sopravvivenza globale (5-8 mesi) (Avril et al. 2004; Patel et al. 2011). Peraltro, entrambi questi agenti sono in grado di attraversare la barriera emato-encefalica, rivestendo pertanto un ruolo nel trattamento di pazienti con localizzazioni cerebrali (Melanoma – Linee guida Aiom).

Il trattamento poli-chemioterapico non ha dimostrato un beneficio in termini di sopravvivenza rispetto al trattamento a single agent (Legha et al. 1989).

La chemioterapia viene oggi utilizzata dopo la somministrazione di farmaci BRAF e MEK inibitori (nella popolazione con mutazione BRAF V600) o immunoterapici, oppure nelle condizioni in cui queste terapie siano controindicate (Melanoma – Linee guida Aiom).

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1.10.4.2 Target therapy

Un approccio differente nella terapia del cancro è rappresentato dal targeting di oncogeni mutati. Due terzi dei pazienti con melanoma, mostrano mutazioni a livello di alcune protein-chinasi e l’inibizione della loro attività, è stata associata al restringimento del tumore (Rughani et al. 2012).

Si ricorre alla terapia a bersaglio molecolare solo in presenza di marcatori diagnostici specifici individuati nelle cellule tumorali, nel sangue o in altri campioni biologici prelevati dal paziente (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

La target therapy è finalizzata ad un trattamento specifico e selettivo. Infatti, attraverso la stimolazione o l’inibizione del bersaglio molecolare, si tende a correggere la mutazione genetica caratteristica della malattia (Geni Driver e Geni Passenger) (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

Nello sviluppo del melanoma sono coinvolte più mutazioni genetiche (BRAF, MEK, c-KIT) su cui agiscono specifici farmaci con il medesimo meccanismo d’azione ossia l’inibizione di reazioni chimiche che sono alla base della crescita e riproduzione cellulare. Importante specificare che queste reazioni chimiche sono normalmente indotte dai fattori di crescita in seguito al legame con determinate proteine presenti sulla superfice di alcune cellule.

Ad esempio, il vemurafenib ed il dabrafenib agiscono quando è presente una mutazione dell’oncogene BRAF.

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Figura 11: struttura chimica del vemurafenib.

Il vemurafenib (Figura 11) costituisce un importante passo avanti nella terapia farmacologica del melanoma e viene utilizzato in monoterapia nei pazienti con melanoma metastatico positivo per la mutazione a carico del gene BRAF (V600) (Chapman et al. 2011): inibendone l’azione, rallenta la progressione delle lesioni (Robert et al. 2011).

La mutazione è localizzata a livello del codone 600 del gene BRAF e porta alla sostituzione della valina, codificata dal suddetto codone, con un altro amminoacido ottenendo così le proteine BRAF attivate che possono indurre la proliferazione cellulare in assenza dei fattori di crescita (Weeraratna 2012). Pertanto la proteina BRAF è coinvolta nella regolazione della crescita cellulare e risulta mutata in circa la metà dei pazienti con melanoma allo stadio finale (Chapman et al. 2011).

Rispetto alla dacarbazina il vemurafenib ha dimostrato una miglior capacita nel prolungare la sopravvivenza globale che è pari all’84% annuo, rispetto al 64% della dacarbazina (Davies et al. 2002).

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Figura 12: Struttura chimica del dabrafenib.

Il dabrafenib (Figura 12) è un altro inibitore della proteina BRAF costitutivamente attiva a causa di mutazioni del codone 600. Questo BRAF inibitore ha dimostrato di portare ad una riduzione del 70% il rischio di progressione o morte nei pazienti con melanoma e BRAF mutato, rispetto alla dacarbazina.

Il trametinib e il cobimetinib, agiscono in presenza di mutazioni a carico del gene MEK.

Figura 13: Struttura chimica del trametinib.

Il trametinib (Figura 13) è un inibitore delle proteine MEK, utilizzato per il trattamento del melanoma metastatico con mutazione della proteina BRAF (V600E e V600K). Questo farmaco agisce bloccando direttamente la proteina MEK e impedendone l'attivazione da parte della proteina BRAF

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costitutivamente attiva, rallentando così la crescita e la diffusione del tumore (Melanoma - www.aimac.it).

Confrontato con la chemioterapia (dacarbazina o paclitaxel), il trametinib determina un aumento della sopravvivenza libera da progressione (PFS) ed un tasso di risposta superiore (Flaherty et al. 2012).

L’associazione del trametinib (inibitore del MEK) e del dabrafenib (inibitore del BRAF) ha mostrato una promettente attività nei pazienti con melanoma in III e IV stadio poiché la proteina MEK costituisce l’elemento a valle dell’attività chinasica di BRAF. Lo scopo dell’associazione di questi due farmaci, è di creare una risposta più forte per combattere il cancro e prevenire o ritardare la resistenza al trattamento indotta dal vemurafenib.

Infine, l’altro vantaggio correlato alla terapia combinata dabrafenib/trametinib, è stato quello di riscontrare una minor frequenza di reazioni avverse, come ad esempio le lesioni cutanee, rispetto a quella riscontrata nei pazienti trattati solo con vemurafenib (Weber et al. 2012). Sulle mutazioni c-KIT, recettore tirosin-chinasico responsabile della migrazione e sopravvivenza cellulare nei melanomi (Rastrelli et al. 2014), agiscono sia imatinib sia nilotinib.

Entrambi i farmaci vengono utilizzati nel trattamento della leucemia mieloide cronica (LMC), malattia in cui le cellule presentano una proteina recettore danneggiata che invia il segnale di crescita e riproduzione alle cellule anche in assenza del fattore di crescita. Questi farmaci bloccano la trasduzione del segnale poiché, identificato il recettore danneggiato, vi si legano, inibendolo (Melanoma - www.aimac.it).

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Figura 14: Struttura chimica dell’imatinib.

Nello specifico, imatinib (Figura 14) è un inibitore selettivo della chinasi ALB dell’oncoproteina BCR-ABL (detta anche proteina tirosin-chinasi BCR-ABL), prodotta dalle stesse cellule leucemiche.

La tirosin-chinasi BCR-ABL agisce legandosi all’ATP e trasferendo un gruppo fosfato dall’ ATP ai residui di tirosina su diversi substrati. Quest’attività induce un’eccessiva proliferazione di cellule mieloidi, fattore scatenante della leucemia mieloide cronica (LMC). Imatinib, bloccando il legame dell’ATP con la tirosin-chinasi BCR-ABL, ne inibisce l’attività. In assenza di attività tirosin-chinasica, i substrati necessari per la funzione di BCR-ABL, non possono essere fosforilati (Mauro and Druker 2001).

Oltre ad essere utile per il trattamento di LMC, imatinib rappresenta un potente agente anche per la terapia della leucemia linfocitica acuta positiva per il cromosoma Philadelphia (Ph+ ALL) (Mauro and Druker 2001).

Nel caso di melanomi delle mucose, è stata dimostrata la presenza di mutazioni del gene c-KIT che risponde al trattamento con c-KIT inibitori (imatinib, nilotinib) (Melanoma – Linee guida Aiom).

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Nei pazienti con melanoma in stadio IV e IIIC non operabile e mutazione di BRAF V600 è raccomandabile il trattamento con BRAF e MEK inibitore (Melanoma – Linee guida Aiom).

Il trattamento di combinazione con BRAF+MEK inibitori valutato in tre studi (Larkin et al. 2014; Long et al. 2015; Robert et al. 2015) presenta un buon profilo di tollerabilità, con una generale riduzione degli eventi avversi cutanei tipici del trattamento con BRAF inibitore. Tuttavia è da segnalare un modesto incremento del rischio di tossicità oculare, diarrea e ipertensione. Inoltre, il trattamento con dabrafenib-trametinib si associa ad un incremento del rischio di piressia mentre il trattamento con vemurafenib-cobimetinib, presenta maggiore fotosensibilità e aumento delle transaminasi (Melanoma – Linee guida Aiom).

Nel caso di melanomi con mutazione del gene BRAF la disponibilità̀ dell’immunoterapia e della terapia a bersaglio molecolare ha apertonuove potenzialità di cura in uno scenario complesso che richiederà ulteriori studi. (Melanoma – Linee guida Aiom).

2. IMMUNOTERAPIA

Le recenti evidenze scientifiche hanno portato, nell’ultimo anno, a porre sempre maggiore attenzione a una nuova strategia terapeutica nell’ambito del melanoma: l’immunoterapia (Melanoma – Linee guida Aiom).

L’immunoterapia, a differenza delle tradizionali chemioterapie, ma anche della terapia biologica, è una bioterapia finalizzata a potenziare l’azione del sistema immunitario contro la malattia, attraverso l’utilizzo degli

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anticorpi monoclonali, ossia farmaci a bersaglio specifico contro una proteina presente sulle cellule tumorali o nel circolo sanguigno, che riconoscono in modo selettivo (A. Testori et al., Marzo 2017 - La Collana del Girasole).

E’ stato necessario oltre un secolo per dimostrare come la risposta immunitaria, se opportunamente stimolata, possa divenire uno strumento utile per migliorare significativamente la sopravvivenza dei pazienti oncologici.

La complessità del sistema immune e le alterazioni in esso indotte dal tumore, hanno richiesto uno studio preclinico approfondito e un’estesa sperimentazione nei pazienti. Allo stesso modo, saranno necessari altro tempo e altra ricerca perché l’immunoterapia mostri a pieno le proprie potenzialità e divenga un trattamento applicabile nella maggior parte dei pazienti (Carmine Pinto, Immuno-oncologia generale Vol 1, 2015).

2.1 Il Sistema Immunitario: uno strumento terapeutico

A livello teorico, l’immunoterapia può rappresentare un approccio universale finalizzato a potenziare le naturali difese che l’organismo mette in atto in presenza di un processo di trasformazione neoplastica, in quanto è in grado di:

1. Agire in maniera specifica contro le cellule trasformate, risparmiando invece quelle sane.

2. Mantenere una protezione a lungo termine, grazie alla memoria immunologica.

3. Attivarsi in maniera intrinseca in ciascun paziente, superando restrizioni di isotopo o di alterazioni molecolari, che invece

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vincolano altre strategie terapeutiche come la chemioterapia o la target therapy.

La possibilità di modulare il sistema immunitario richiede però che le nostre difese siano realmente in grado di riconoscere una cellula tumorale come “estranea” ed inneschino una serie di reazioni che ne portino all’eliminazione [Carmine Pinto, Immuno-oncologia generale Vol 1., 2015]. Su questo presupposto si basa la teoria dell’immunosorveglianza (Galon et al. 2013) secondo cui, un organismo immunocompetente è in grado di individuare le cellule tumorali, distruggendole. La dimostrazione indiretta dell’esistenza di tale livello di protezione, è data dal fatto che, nei pazienti cronicamente immunocompromessi si abbia un’incidenza di neoplasie superiore rispetto ai soggetti sani (Oliveira Cobucci et al. 2012).

2.2 Caratteristiche dell’induzione spontanea di immunità antitumorale

I meccanismi che portano all’induzione spontanea di immunità antitumorale nel soggetto affetto da neoplasia, sono rappresentati da una serie di eventi concatenanti che, come evento finale, hanno la distruzione immuno-mediata delle cellule tumorali.

L’immunità anti-tumorale avviene attraverso una cascata immunologica (Figura 15) in cui le cellule tumorali, in seguito alla loro crescita incontrollata, vengono bersagliate dalle cellule citotossiche del sistema immunitario (Cellule Natural Killer, NK) che ne causano la distruzione ed il rilascio dei dendriti contenenti gli antigeni tumorali (Figura 15). Tali frammenti vengono raccolti dalle cellule dendritiche (DC), anch’esse presenti a livello tissutale, che ne processano il contenuto antigenico

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(fagocitosi) presentandolo sulla propria superficie nel contesto delle molecole di HLA (Oliveira Cobucci et al. 2012).

Figura 15: L’induzione dell’immunità antitumorale è un processo multistep che coinvolge diverse popolazioni leucocitarie.

Le DC sono le uniche cellule che, una volta migrate nei linfonodi drenanti, sono in grado di determinare l’attivazione dei linfociti T (priming) e la successiva espansione clonale (Miller and Sadelain 2015), rappresentando così un elemento centrale nell’induzione dell’immunità specifica.

Il linfocita T per mezzo del suo recettore (TCR) interagisce con un complesso espresso sulla superficie della cellula tumorale, composto da frammenti dell’antigene (peptidi) legati a molecole HLA. Si attivano così i linfonodi specifici per l’antigene che possono essere il linfocita T CD8+ (citotossico) e il linfocita T CD4+ (helper).

Il linfocita T CD8+, riconoscendo la cellula tumorale grazie all’espressione dell’antigene, rilascia granuli citotossici che formano veri e propri fori nella membrana della cellula bersaglio (cellule neoplastiche) (Schalper et

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al. 2015), la quale muore in pochi minuti a causa di uno shock osmotico. Il linfocita T CD4 invece rilascia sostanze che favoriscono la proliferazione e l’attivazione linfocitaria (ad esempio interleuchina 2) di modo da sostenere e amplificare la risposta immunitaria. Nel caso di un’infezione acuta i linfociti T specifici sono in grado di eliminare l’agente patogeno e quando ciò avviene, le cellule immunologiche vengono eliminate mediante un meccanismo a feedback negativo portando allo spegnimento della risposta immunitaria. Nel caso dei tumori, invece, l’antigene raramente viene eliminato, portando così ad una stimolazione cronica dell’immunità e ad un accumulo dei meccanismi a feedback negativo che esauriscono l’efficacia citotossica dei linfociti T, rendendo il controllo immunitario sempre meno efficace. Oltre a ciò, sul sito tumorale, vengono richiamate cellule immunosoppressorie come le cellule T regolatorie (Treg) (Roychoudhuri et al. 2015) e le cellule mieloidi (MDSC) (Vetsika et al. 2014) che, tramite diversi meccanismi (tra cui l’espressione degli Immune checkpoint), contribuiscono a silenziare la risposta immune (Licia Rivoltini, Immuno-oncologia generale Vol 1, 2015). Tra i meccanismi immunosoppressivi indotti dal tumore, abbiamo la capacità di esprimere molecole in grado di inibire la risposta immunitaria (PD-L1, IL-10, TGF-β) oppure la riduzione dell’espressione del complesso HLA/antigene che lo rendeva identificabile ai linfociti T. Per di più, il tumore è in grado a sua volta di sviluppare una serie di meccanismi di

Immune Escape per mezzo dei quali, evade il controllo immunitario e

sopravvive nell’ospite. Queste, insieme ad altre strategie, annullano i tentativi delle nostre difese di controllare la crescita neoplastica, conferendo alla cellula tumorale la possibilità di crescere incontrollatamente (Bhatia and Kumar 2014).

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Obbiettivo della ricerca oncologica è quello di individuare proprio questi meccanismi molecolari cosi da definire nuove strategie di immunoterapia che impediscano al tumore di evitare l’eliminazione immuno-mediata (Lesokhin et al. 2015).

Con la scoperta degli immune checkpoint, e del loro ruolo nell’inibizione della risposta immunitaria endogena, è nato il vero punto di svolta nello sviluppo degli approcci immunoterapici (Lesokhin et al. 2015).

Accorti che il blocco dei recettori di feedback negativo (CTLA-4 e PD-1) permetteva di ottenere una potente e duratura reattività dei linfociti T CD8+, è stata formulata nuova sperimentazione clinica con una diversa strategia immunoterapeutica: non si stimola più l’immunità antitumore (come nei vaccini anticancro), ma si stimola una risposta immunitaria endogena già esistente ma completamente paralizzata dai meccanismi inibitori provocati dal tumore (Carmine Pinto, Immuno-oncologia generale Vol 1 ., 2015).

2.2.1 Checkpoint immunologici

I dati scientifici raccolti negli ultimi anni dimostrano che il meccanismo principale con il quale i tumori eludono il sistema immunitario è attraverso l’impiego di checkpoint immunologici (Vesely and Schreiber 2013).

• CTLA-4

CTLA-4 è il primo recettore appartenente al sistema dei checkpoint

immunologici ad essere stato utilizzato con successo nell’immunoterapia

(Pico de Coaña et al. 2015). Questo recettore è espresso sulle cellule T attivate e la sua funzione primaria è quella di diminuire il grado di

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attivazione delle cellule T, contrastando il segnale co-stimolatorio prodotto da CD28 (Figura 16) (Walker and Sansom 2015).

Figura 16: Inibizione delle cellule T da parte dei checkpoint immunologici (CTLA-4 e PD-1) in seguito alla loro attivazione da parte di specifici ligandi.

Sia il CTLA-4 che il CD28 condividono gli stessi ligandi: il CD80 (conosciuto anche come B7.1) ed il CD86 (denominato anche B7.2). Tuttavia, il CTLA-4 ha maggiore affinità, rispetto al CD28, con i ligandi portando così all’inibizione delle reazioni delle cellule T (Figura 17) (Romo-Tena et al. 2013).

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Figura 17: il recettore CTLA-4 ha una maggiore affinità, rispetto al recettore CD28, con i ligandi.

L’ipilimumab è un anticorpo monoclonale ricombinante completamente umano anti-CTLA-4 nonchè il primo inibitore del checkpoint immunologico a ricevere l’approvazione della Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento del melanoma avanzato (Blank and Enk 2015). Ipilimumab legandosi al recettore CTLA-4 lo blocca (Figura 18), promuovendo l’attivazione delle cellule T principalmente nei tessuti linfatici. Tuttavia quest’attivazione immunologica può portare alla comparsa di reazioni avverse infiammatorie dovute ad un’eccessiva stimolazione immunitaria collegata al suo meccanismo d’azione sui tessuti normali (Haanen et al. 2015).

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Figura 18: CTLA-4 and PD-1/PD-L1 nella sinapsi immunitaria; TCR: recettore delle cellule T; B7.1 e B7.2: ligandi del CTLA-4 ; recettore CTLA-4; recettore PD-1; PD-L1 e PD-L2: ligandi del PD-1; meccanismo d’azione degli anti-CTLA-4 e anti-PD-1.

• PD-1 / PD-L1

Il PD-1 è un recettore inibitorio caratterizzato da un dominio simile a quello immunoglobulinico, con un dominio di transmembrana ed un dominio citoplastico (Figura 19) (Boussiotis 2016) che viene attivato dai suoi ligandi PD-L1 e PD-L2 (Figura 16) (Borch et al. 2015).

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Il PD-1, glicoproteina a 288 aminoacidi (Boussiotis 2016), è presente nelle cellule T attivate, nelle cellule B, nei monociti e nelle cellule NK.

Il PD-L1 (ligando per la morte programmata-1) è il principale ligando di PD-1. Si tratta di una glicoproteina di transmembrana di tipo I che adotta la struttura di una immunoglobulina. La proteina PD-L1 è ancorata alla membrana cellulare grazie ad una sequenza idrofobica, seguita da una corta regione intra-citoplasmatica (Figura 20) (Escors et al. 2018).

Figura 20. Struttura del PD-L1.

PD-L1 è costitutivamente espresso a vari livelli dalle cellule della linea mieloide tra cui le cellule dendritiche, i macrofagi, le cellule soppressorie di derivazione mieloide ed altri tipi cellulari tra cui le cellule della maggior parte dei tumori solidi (tumori polmone non a piccole cellule, del colon retto, melanomi, carcinomi renali, del tratto gastro-intestinale, dell’ovaio, gliomi, neoplasie della mammella, tumori testa-collo). Il suo ruolo è quello di inibire la produzione di citochine e, conseguentemente, l’attività citolitica dei linfociti T CD4+ e CD8+ PD-1+ che infiltrano il tumore. Queste proprietà hanno reso il PD-L1 un potenziale e promettente target (Brahmer et al. 2012), ma anche un possibile

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biomarcatore predittivo di risposta all’immunoterapia con i farmaci anti-PD-1 ed anti PD-L1 (Topalian et al. 2012).

Le cellule tumorali esprimono spesso alti livelli della proteina PD-L1, che si lega alle cellule regolatrici della risposta immunitaria dell’ospite, attraverso il recettore PD-1, inibendole. L’interazione tra PD-1 e PD-L1 ha come risultato finale la soppressione dei linfociti T. Pertanto, si ha una riduzione dell’attività dei linfociti T nel microambiente tumorale (Boussiotis 2016).

Il PD-L2 è espresso principalmente nei macrofagi e in alcune cellule tumorali (Liang et al. 2003).

Come già accennato, uno dei meccanismi con i quali il tumore è in grado di limitare la risposta immunitaria dell’ospite, è la sovra-espressione della proteina PD-L1 nel microambiente tumorale. L’espressione del PD-L1 sulle superficie delle cellule tumorali può essere mediata da diversi meccanismi (Figura 21). Ad esempio, l’espressione del PD-L1 può essere indotta da citochine infiammatorie, tra cui l’IFN-γ.

Figura 21. Meccanismo di induzione dell’espressione del PD-L1 sulle cellule tumorali da parte dell’l’IFN-γ.

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IFN-γ

IFN-γ, citochina immunomodulante sulle cellule del melanoma (Garbe and Krasagakis 1993), costituisce un’arma a doppio taglio nella sorveglianza immunitaria (Gao et al. 2018). Se da un lato le cellule T CD8+ inibiscono la proliferazione delle cellule tumorali e migliorano l’attività immunitaria secernendo IFN-γ, dall’altra l’IFN-γ (prodotto dalle stesse cellule T) regola direttamente l’espressione di PD-L1 sulla cellula tumorale andandole a proteggere dall’attacco della sorveglianza immunitaria (Tremblay-LeMay et al. 2018).

Tuttavia, con il blocco PD-1/PD-L1, si ha una maggiore probabilità di sopravvivenza e proliferazione delle cellule tumorali che hanno un deficit nella via di segnalazione dell’ IFN-γ (Abril-Rodriguez and Ribas 2017). Invece, la perdita di segnali a valle dell’IFN-γ è correlata alla resistenza adattiva ai farmaci durante l’immunoterapia (Gao et al. 2018) indotta sia dall’IFN-γ che da altre citochine. Perciò, la via di segnalazione IFN-γ inalterata, costituisce un fattore determinante necessario ma non sufficiente per un efficace effetto antitumorale (Yi et al. 2018).

Nel microambiente tumorale, l’IFN-γ si lega al proprio recettore espresso sulla superficie delle cellule tumorali, determinando l’attivazione del pathway JAK-STAT, con conseguente attivazione trascrizionale del fattore regolatorio dell’interferone 1 (IRF1), il quale successivamente andrà a legarsi al promotore del gene PD-L1 (Figura 22) (Escors et al. 2018).

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Figura 22. Meccanismo nucleare di attivazione trascrizionale dell’mRNA codificante il PD-L1 per effetto della stimolazione dell’IFN-γ.

Il blocco della trasduzione del segnale PD-L1/ PD-1 inibisce sensibilmente la soppressione funzionale di TCR favorendo: la produzione di linfociti T CD8+ attivati (Figura 18), l’accelerazione delle risposte immunitarie antitumorali ed il potenziamento delle capacità anticancro delle cellule dendritiche (Ramos et al. 2013).

• TGF-β

Un altro meccanismo di evasione all’ attività T-citotossica messo in atto dalle cellule neoplastiche è quello che vede impegnato il TGF-β.

Il TGF-β è una citochina oggi conosciuta non solo come un fattore di crescita, in grado di stimolare la proliferazione e indurre la trasformazione delle cellule mesenchimali (Massagué 2008), ma anche come potente inibitore della proliferazione delle cellule epiteliali,

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endoteliali ed ematopoietiche (Massagué 2008). Il TGF-β ha dunque il compito di regolare i sistemi in espansione dei tessuti epiteliali e il sistema immunitario (Massagué 2008).

Il TGF-β infatti è considerato un immunosoppressore per le sue azioni sui linfociti T (Taipale et al. 1998): esso , sintetizzato e secreto dalle cellule T, è in grado di bloccare la produzione dell’interleuchina-2 (IL-2) (Kehrl et al. 1986) e di inibire la differenziazione dei linfociti T impedendone l’acquisizione delle funzioni effettrici (citotossiche o helper) (Gorelik and Flavell 2002).

Legati a questi ruoli regolatori cruciali del TGF-β, sono le gravi conseguenze che si verificano quando questa via di segnalazione funziona male, vale a dire durante il processo della tumori-genesi (Massagué 2008). Durante la tumori-genesi, il TGF-β mantiene l’omeostasi dei tessuti e impedisce la progressione dei tumori (Massagué 2008) non solo stimolando l’attività proteolitica delle cellule cancerose (aumentando l’espressione degli enzimi che ne degradano la matrice) (Park et al. 2016), ma anche regolando il microambiente cellulare (Massagué 2008). Come entità generalmente stabile, le cellule tumorali hanno però la capacità di evitare o, peggio ancora, di alterare l’influenza soppressiva della via del TGF-β (Figura 23).

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Figura 23: Nelle cellule normali e pre-maligne, il TGF-β impone l’omeostasi e sopprime la progressione tumorale direttamente attraverso gli effetti soppressivi del tumore (citosi, differenziazione, apoptosi) o indirettamente attraverso gli effetti sullo stroma. Tuttavia, quando le cellule tumorali perdono risposte soppressive del tumore TGF-β, possono utilizzare TGF-β a proprio vantaggio per sfuggire alla sorveglianza immunitaria

Le forme patologiche di segnalazione del TGF-β, promuovono a loro volta la crescita e l’invasione di metastasi tumorali permettendo al tumore di evadere alla sorveglianza immunitaria (Figura 23) (Massagué 2008).

Le cellule maligne infatti, eludono gli effetti soppressivi del TGF-β attraverso due meccanismi d’azione principali: l’inattivazione dei recettori del TGF-β (Figura 24, percorso 1) o la disattivazione della porzione soppressiva del tumore attraverso alterazioni a valle (Figura 24, percorso 2), consentendo alle cellule tumorali non solo di annullare l’inibizione della crescita tumorale, ma anche di creare un potenziale aggiunto per la sua progressione. In entrambi i casi, le cellule tumorali possono utilizzare TGF-β per modulare il microambiente e indurre la produzione di citochine pro-metastatiche (Massagué 2008).

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Figura 24: Nel percorso 1, le cellule maligne inattivano i recettori del TGF-β mentre nel percorso 2, si ha l’amputazione del braccio soppressore del tumore. Entrambi i percorsi favoriscono l’evasione del tumore alla sorveglianza immunitaria, favorendone la crescita.

Quindi le cellule tumorali sfuggono all’inibizione della proliferazione indotta dal TGF-β accumulando mutazioni che sono in grado di attenuarne o addirittura spegnerne il segnale, riuscendo a convertire l’azione del TGF-β da oncosoppressore a mediatore delle metastasi (Figura 25) (Massagué 2008).

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