ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
GERDA JUODELYTĖ
NESOČIŲJŲ RIEBALŲ RŪGŠČIŲ ĮVERTINIMAS ŽUVŲ
TAUKŲ PREPARATUOSE DUJŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Liudas Ivanauskas
Konsultantas
Lekt. Mindaugas Marksa
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Ramunė Morkūnienė Data:
NESOČIŲJŲ RIEBALŲ RŪGŠČIŲ ĮVERTINIMAS ŽUVŲ
TAUKŲ PREPARATUOSE DUJŲ
CHROMATOGRAFIJOS METODU
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas Darbo vadovas
Mindaugas Marksa Liudas Ivanauskas
Data Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Gerda Juodelytė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Riebalų rūgščių savybės ir klasifikacija ... 12
1.2 Sočiosios riebalų rūgštys ... 14
1.3 Mononesočiosios riebalų rūgštys... 15
1.3.1 Mononesočiosios riebalų rūgštys - cis- konfigūracija ... 15
1.3.2 Mononesočiosios riebalų rūgštys - trans- konfigūracija ... 16
1.4 Polinesočiosios riebalų rūgštys ... 17
1.4.1 Polinesočiosios riebalų rūgštys (Omega-3)... 18
1.4.2 Omega-3 riebalų rūgščių poveikis širdies ir kraujagyslių ligoms ... 19
1.4.3 Polinesočiosios riebalų rūgštys (Omega-6)... 20
1.5 Omega-3 ir omega-6 rūgščių santykio reikšmė ... 21
1.6 Dujų chromatografija ir jos taikymas riebalų rūgščių nustatymui ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1 Tyrimo organizavimas ... 24
2.2 Tyrimo objektas ... 24
2.3 Tyrimo medžiagos ir prietaisai ... 24
2.4 Tyrimo eiga... 25
2.5 Tyrimo metodai ... 25
2.6 Statistinės duomenų analizės metodai ... 27
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1 Riebalų rūgščių vertinimas dujų chromatografijos metodu ... 28
3.1.1 Kokybinis riebalų rūgščių vertinimas dujų chromatografijos metodu ... 28
3.1.2 Kiekybinis riebalų rūgščių vertinimas dujų chromatografijos metodu ... 29
3.2 Nustatytas riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose ... 30
3.2.1 Sočiųjų riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose ... 30
3.2.2 Bendras nesočiųjų riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose ... 31
3.2.3 Nepakeičiamųjų riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose ... 32
3.2.4 Omega-3 riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose ... 33
3.2.6 Omega-6 ir omega-3 riebalų rūgščių santykio palyginimas ... 36
3.2.7 Nesočiųjų riebalų rūgščių (DHR ir EPR) reglamentuojamo ant pakuotės kiekio palyginimas su tyrime gautais duomenimis ... 36
3.3 Mononesočiųjų riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose ... 37
IŠVADOS ... 40
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42
SANTRAUKA
ASSESSMENT OF UNSATURATED FATTY ACIDS IN FISH OIL PREPARATIONS BY GAS CHROMATOGRAPHY
G. Juodelytės magistro baigiamasis darbas „Nesočiųjų riebalų rūgščių įvertinimas žuvų taukų preparatuose dujų chromatografijos metodu“. Mokslinio darbo vadovas prof. dr. L. Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: Nesočiosios riebalų rūgštys, Omega-3, Omega-6, Omega-9 riebalų rūgštys, polinesočiosios riebalų rūgštys, Omega-6/ Omega-3 santykis, riebalų rūgščių šaltiniai, mononesočiosios riebalų rūgštys, dujų chromatografija, riebalų rūgštys, žuvų taukai, eruko rūgštis, DHR ir EPR riebalų rūgštys.
Tyrimo tikslas: Nustatyti nesočiųjų riebalų rugščių kiekį ir kokybę žuvų taukų preparatuose, taikant silinimo kaitinant metodą ir dujų chromatografinę analizę.
Tyrimo uždaviniai: 1. Nustatyti bendruosius sočiųjų ir nesočiųjų riebalų rūgščių kiekius skirtinguose žuvų taukuose. 2. Įvertinti omega-3, 6, 9 bendruosius kiekius žuvų taukuose, bei omega-6 ir omega-3 santykį. 4. Nustatyti nepakeičiamųjų riebalų rūgščių kiekius žuvų taukuose, įvertinti DHR ir EPR koncentracijas bei palyginti su ant pakuotėje nurodytomis.
Tyrimo objektas ir metodika: Magistrinio darbo tyrimo objektas - vaistinėse įsigyti, penkių skirtingų gamintojų, kapsuliuoti ir skystos formos žuvų taukai. Riebalų rūgščių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui mėginiuose taikyta dujų chromatografinė analizė, prieš tai atliktas riebalų rūgščių silinimas kaitinant, tokiu būdu riebalų rūgštis paverčiant į metilesterius, kurie buvo išekstrahuoti heksanu.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausia nustatyta sočiųjų riebalų rugščių koncentracija buvo lietuviškuose Nr.2 žuvų taukuose (98,15±0,17%), mažiausia norvegiškuose Nr.1 (1,08±0,06%). Didžiausias nesočiųjų riebalų rūgščių nustatytas kiekis Nr.2 žuvų taukuose (65,55±0,23%) ir islandiškuose Nr.5 žuvų taukuose (30,67±0,36%). Didžiausia koncentracija nepakeičiamųjų riebalų rūgščių (74,64±0,2%) nustatyta islandiškuose Nr.3 žuvų taukuose, kiek mažiau (60,78±0,34%) norvegiškuose Nr.4. Didžiausia Omega-3 riebalų rūgščių koncentracija nustatyta lietuviškuose Nr.2 (22,32±0,26%), isladiškuose Nr.3 (19,13±0,41%) bei norvegiškuose Nr.4 (18,42±0,16%) žuvų taukuose. Didžiausia EPR ir DHR procentinė koncentracija buvo nustatyta islandiškuose Nr.3 (25,75±0,31%) ir norvegiškuose Nr.4 (25,60±0,12%) žuvų taukuose. Didžiausia nustatyta Omega-6 koncentracija buvo islandiškuose Nr.5 (66,88±0,4%) bei Lietuviškuose Nr.2 (23,21±0,22%) žuvų taukuose.
Rekomenduojamą Omega-6 ir Omega-3 santykį atitiko lietuviški Nr.2 ir Nr.1 (1:1). Didžiausias nustatytas kiekis EPR ir DHR, lyginant su ant pakuotės nurodytu kiekiu, buvo Norvegiškuose Nr.4 žuvų taukuose (71,45, 25,98%). Didžiausia mononesočiųjų riebalų rūgščių (Omega-9) koncentracija nustatyta lietuviškuose Nr.2 (94,16±0,11%) žuvų taukuose.
SUMMARY
G. Juodelytės master thesis “Nesočiųjų riebalų rūgščių įvertinimas žuvų taukų preparatuose dujų chromatografijos metodu”. Scientific supervisor prof. L. Ivanauskas; Lithuania University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Analytical and Toxicological chemistry. – Kaunas.
Key words: Unsaturated fatty acids, Omega-3, Omega-6, Omega-9 fatty acids, polyunsaturated fatty acids, Omega-6 and Omega-9 relationship, source of fatty acids, monounsaturated fatty acids, gas chromatography, fish oil, erucic acid, DHA and EPA fatty acids.
The aim: To determine quantity and quality composition of unsaturated fatty acids in fish oil using cold esterification method combined with gas chromatography.
Tasks: 1. To evaluate the quantities of omega-3, 6, 9, compare omega-6 and omega-3 relationship in different fish oil. 2. To determine unchangeable fatty acids quantities in different fish oil, to evaluate DHA and EPA concentration and make the comparison with announcement that is shown on the original package. 3. To evaluate which fish oil food supplement is enriched with the most optimal composition based on results obtained.
Object and methods: Master thesis object: in the pharmacies received five different capsulated fish oil food supplements. Method: For quantity and quality determination in fish oil was applied gas chromatography method. Before chromatography starts, fish oil testers were derivatizated using hot method this way fatty acids were exchanged in to methyl esters and lastly they were extracted using hexane solution.
Results and conclusions: The biggest concentration of saturated fatty acids in fish oils were obtained in lithuanian Nr.2 (98,15±0,17%) and the lowest – in norwegian Nr.1 (1,08 ±0,06%). The biggest concentration of unsaturated fatty acids were obtained in lithuanian Nr.2 (65,55±0,23%) and islandic Nr.5 (30,67±0,36%) fish oils. The most unchangeable fatty acids carrying fish oil was islandic Nr.3 (74,64±0,2%), a bit less – norwegian Nr.4 (60,78±0,34%). The biggest amount of Omega-3 fatty acids were obtained in lithuanian Nr.2 (22,32±0,26%), islandic Nr.3 (19,13±0,41%) and norwegian Nr.4 (18,42±0,16%) fish oils. The biggest percentage amount of EPA and DHA were obtained in islandic Nr.3 (25,75±0,31%) and norwegian Nr.4 (25,60±0,12%) fish oils. The biggest amount of Omega-6 fatty acids were obtained in islandic Nr.5 (66,88±0,4%) and lithuanian Nr.2 (23,21±0,22%) fish oils. The closest relationship that corresponds to 1:1 between Omega-6 and Omega-3 were obtained in lithuanian Nr.2 and Nr.1 (1:1). The biggest amount of EPA and DHA that was compared with on the original food supplement package announced amounts were obtained in norwegian Nr.4 (71,45mg 25,95%). The biggest monounsaturated fatty acids (Omega-9) concentration was obtained in lithuanian Nr.2 (94,16±0,11%) fish oils.
PADĖKA
Už visas darbui atlikti suteiktas būtinas sąlygas, patarimus bei pagalbą atliekant baigiamąjį magistrinį darbą, noriu nuoširdžiai padėkoti savo darbo vadovui, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof. Liudui Ivanauskui.
Už operatyvią pagalbą bei patarimus vykdant mokslinius tyrimus laboratorijoje noriu nuoširdžiai padėkoti Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros lekt. Mindaugui Marksai bei visam katedros kolektyvui.
SANTRUMPOS
α-LR – α-linoleno rūgštis
BRRK – bendras riebalų rūgščių kiekis DHR – dokozaheksaeno rūgštis
DTL – didelio tankio lipoproteinai EPR – eikozapentaeno rūgštis
MNRR – mononesočiosios riebalų rūgštys MTL – mažo tankio lipoproteinai
PNRR – polinesočiosios riebalų rūgštys PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija SRR – sočiosios riebalų rūgštys
DC – dujų chromatografija MS – masių spektrometrija KŠL – koronarinės širdies ligos
ĮVADAS
Riebalai – viena iš pagrindinių sudėtinių maisto dalių, kurių pagrindinės funkcijos: struktūrinė, apsauginė, energetinė, reguliacinė bei mitybos. Riebalai sudaryti iš glicerolio, riebalų rūgščių ir kitų sudėtinių dalių [29]. Pastaraisiais dešimtmečiais labai stipriai padidėjo suvartojamo maisto, kuriame gausu nesočiųjų omega-6 riebalų rūgščių ir gerokai sumažėjo nesočiųjų omega-3. Šių riebalų rūgščių santykis vakarietiškoje žmonių mityboje siekia 10:1–20:1, kuomet Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) rekomenduojamas omega-6 ir omega-3 riebalų rūgščių santykis yra 1:1–5:1 [47,46,1]. Abiejų riebalų rūgščių apykaitai naudojami tie patys fermentai, dėl to tarp jų atsiranda konkurencija. Per didelis kiekis omega-6 riebalų rūgščių sutrigdo normalią omega-3 riebalų rūgščių apykaitą ir neleidžia organizmui jų įsisavinti, ko pasekoje padidėja įvairių sutrikimų rizika: uždegimo, širdies ir kraujagyslių ligų, depresijos, normalaus vystymosi, alerginių susirgimų ir t.t [47].
Dėl pastebimo daugelyje šalių per mažo omega-3 suvartojimo rekomenduojama vartoti produktus, turinčius daugiau šių riebalų rūgščių. Vieni iš produktų, praturtinti omega-3 RR yra žuvys, ypač riebiosios žuvys. Tačiau 2013 metais Vilniaus universitete, Visuomenės sveikatos institute, atliktame tyrime rezultatai parodė, jog dalis Lietuvos gyventojų, t.y. 64% - žuvies produktus vartoja rečiau nei kartą per savaitę arba visai nevartoja.
Siekdami išvengti sveikatos sutrikimų žmonės dažniau kreipiasi i farmacijos spacialistus ir vartoja įvairių gamintojų žuvų taukus. Problema, jog maisto papildų gamyba nėra griežtai kontroliuojama, todėl nemaža dalis gamintojų netiria savo produktų ir nežino jų tikrosios sudėties. Susiduriama su kokybinės bei kiekybinės sudėties pažeidimais, kuomet reglamentuojami ant pakuočių kiekiai neatitinka eksperimentiškai nustatytų. Norint užtikrinti, jog vartotojai gautų nurodytus nesočiųjų riebalų rūgščių kiekius, yra aktualu ištirti maisto papildus ir pateikti objektyvius kokybinius ir kiekybinius duomenis. Svarbu įvertinti, ar žuvų taukų papilduose esantis omega-6 ir omega-3 santykis yra racionalus bei ar šie papildai atitinkamai papildo vartotojų mitybą.
Šio tyrimo metu bus pritaikytas dujų chromatografijos metodas nesočiųjų riebalų rūgščių kiekio įvertinimui pasirinktų gamintojų produktuose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Nustatyti nesočiųjų riebalų rūgščių kiekį ir kokybę žuvų taukų preparatuose, taikant silinimo kaitinant metodą ir dujų chromatografinę analizę.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti bendruosius sočiųjų ir nesočiųjų riebalų rūgščių kiekius skirtinguose žuvų taukuose. 2. Įvertinti omega-3, 6, 9 bendruosius kiekius žuvų taukuose bei omega-6 ir omega-3 santykį.
3. Nustatyti nepakeičiamųjų riebalų rūgščių kiekius žuvų taukuose, įvertinti DHR ir EPR koncentracijas bei palyginti su ant pakuotėje nurodytomis.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Riebalų rūgščių savybės ir klasifikacija
Riebalų rūgštys (RR) - linijinės struktūros angliavandenilių grandinės, dažniausiai turinčios lyginį anglies atomų skaičių (diapazone tarp 12 ir 22) ir grandinėlės gale prisitvirtinusią karboksilo grupę. Angliavandenilių grandinėlė suteikia riebalų rūgštims hidrofobiškumą ir nulemia tirpumą lipiduose, o karboksi grupė suteikia rūgštines savybes, bei nulemia tirpumą vandenyje. RR tirpumas vandenyje mažėja ilgėjant grandinei [51,9]. Bendroji riebalų rūgščių struktūra nurodyta 1 paveiksle.
1 pav. Bendroji riebalų rūgščių struktūra [27]
Riebalų rūgštys skirstomos į prisotintas ir neprisotintas. Prisotintos riebalų rūgštys yra tokios, kurių grandinėlėje kiekvienas anglies atomas, išskyrus du paskutiniuosius, yra prisijungę vandenilio atomus. Neprisotintos riebalų rūgštys - kurių anglies atomai prisijungę tik vieną vandenilio atomą ir tarp jų yra bent viena dviguboji jungtis (2 pav.). Neprisotinimo laipsniui didėjant, lydymosi temperatūra mažėja ir suteikia geresnį tirpumą Omega-3 polinesočiosioms RR. Kuomet grandinėlėje yra tik vienas dvigubasis ryšys - riebalų rūgštys vadinamos mononesočiosiomis (MNRR), tačiau jeigu grandinėlėje yra daugiau nei viena dviguboji jungtis - polinesočiosiomis riebalų rūgštimis (PNRR) (3 pav.) [51].
3 pav. MNRR ir PNRR cheminė struktūra [27]
Polinesočiosios riebalų rūgštys turinčios dvi ar daugiau dvigubųjų jungčių yra pavadintos pagal šių jugčių poziciją ir bendrą grandinės ilgį. Pavyzdžiui, dokozaheksaeno rūgštis (DHR) su 22 anglies atomais ir šešiom dvigubosiom jungtim yra priskiriama Omega-3 RR, kadangi pirmoji dviguba jungtis nutolusi per tris anglies atomus. Tuo tarpu Omega-6 dviguba jungtis nutolusi per šešis anglies atomus, o Omega- 9 per devynis. 1- oje lentelėje nurodytos svarbiausios Omega 3, 6, 9 RR [9,15,54].
1 lentelė. Svarbiausios omega - 3, 6, 9 riebalų rūgštys [9]
Riebalų rūgštys klasifikuojamos pagal kelis kriterijus: anglies atomų skaičių, nesočiųjų jungčių skaičių ir jų padėtį grandinėje. RR klasifikuojamos, remiantis anglies atomų skaičiumi: ilgos grandinės (>10 anglies atomų), trumpos grandinės (2-10 anglies atomų), vidutinės grandinės (8-10 anglies atomų), bei labai ilgos grandinės (nuo 22 anglies atomų). Atsižvelgiant į dvigubųjų jungčių buvimą ar nebuvimą RR skirstomos - sočiosios ir nesočiosios RR. Nesočiosios RR skirstomos pagal dvigubųjų jungčių skaičių į polinesočiąsias ir mononesočiąsias. Mononesočiosios RR skirstomos pagal erdvinę konfigūraciją - cis ir trans riebalų rūgštys. Riebalų rūgščių klasifikacija pateikta 4 paveiksle [7,13, 20].
Oleino rūgštis Mononesočioji 18:1 (Omega-9)
α-linoleno rūgštis (α-LR) Polinesočioji 18:3 (Omega-3)
Eikozapentaeno rūgštis (EPR) Polinesočioji 20:5 (Omega-3)
Dokozaheksaeno rūgštis (DHR) Polinesočioji 22:6 (Omega-3)
Linolo rūgštis (LR) Polinesočioji 18:2 (Omega-6)
4 pav. Riebalų rūgščių klasifikacija [7,13,15,53]
1.2 Sočiosios riebalų rūgštys
Sočiosios riebalų rūgštys (SRR) savo struktūroje neturi dvigubųjų jungčių ir skirstomos į pogrupius pagal jų grandinės ilgį. Trumpos grandinės riebalų rūgštys: acto, propiono ir sviesto. SRR funkcijos storosios žarnos srityje: skatina vandens, natrio, chloridų ir bikarbonatų absorbciją, kraujo tekėjimą per gaubtinės žarnos gleivinę, gleivių gamybą, ribotą saprofitinių bakterijų dauginimąsi. Vidutinės grandinės riebalų rūgštims priskiriamos: heksano, kaprilo ir kaprino RR. Ilgos grandinės riebiosios rūgštys: lauro, miristo, palmitino ir stearino - turi reikšmingą aterogeninį ir trombogeninį potencialą. Labiausiai paplitusios ir didžiausiais kiekiais aptinkamos SRR – stearino ir palmitino [53,26]. Sočiųjų RR per didelis vartojimas padidina cholesterolio, būtent mažo tankio lipoproteinų (MTL) kiekį, kuris yra susijęs su padidėjusiu mirtingumu nuo koronarinės širdies ligos [53,26,5]. Tačiau, yra keletas tyrimų, kurie rodo, kad stearino rūgštis (5 pav.) sumažina MTL ir padidina didelio tankio lipoproteinų (DTL) kiekį ir pasižymi antiaterogeninėmis savybėmis. Taip pat yra duomenų, kad stearino riebalų rūgštis nepadidina postprandialinės hiperglikemijos bei turi didžiausią protrombozinį potencialą, palyginti su kitoms sočiosiomis riebalų rūgštimis. Sočiųjų riebalų rūgščių šaltiniai yra gyvūninės kilmės produktai (pvz.: sviestas, kiaulių taukai) bei augalinės kilmės aliejai (pvz.: kokoso, palmių)[53].
5 pav. Stearino riebalų rūgštis [27]
1.3 Mononesočiosios riebalų rūgštys
1.3.1 Mononesočiosios riebalų rūgštys - cis- konfigūracija
Mononesočiosios riebalų rūgštys (MNRR) yra cis konfigūracijos, kuomet vandenilio atomai prie dvigubosios jungties yra toje pačioje molekulės pusėje (6 pav.). Tokia struktūra lemia skirtingą gretimų anglies atomų orientaciją aplink dvigubąjį ryšį, dėl kurio susidaro molekulė, turinti išlenktą struktūrą [53]. Pagrindiniai šios grupės atstovai: oleino (Omega- 9) ir palmitoleino (Omega-7) rūgštys. Didelis kiekis oleino rūgšties turi stiprų priešuždegiminį ir antitrombozinį poveikį, kadangi mažina trombocitų agregaciją, bei pasižymi antiaterogeniniu poveikiu, nes mažina mažo tankio lipoproteinų kocentraciją ir didina didelio tankio lipoproteinų kocentraciją [40,45,12]. Taip pat svarbus aspektas, jog oleino RR pagerina endotelio disfunkciją, mažina oksidacinį stresą ir uždegiminių ląstelių aktyvavimą [44].
6 pav. Cis- konfigūracijos MNRR [27]
Europinis alyvuogių aliejus ( lot. Olea europaea) yra pagrindinis oleino rūgšties šaltinis, tačiau taip pat galima rasti kanopos aliejuje, hibridiniam dygmių žiedų aliejuje ( lot. Olea Carthamus /
Tinctorius), rapsų aliejuje (lot. Olea Brassica campestris), žemės riešutų aliejuje (lot. Olea Arachis hypogaea), amerikiniame lazdyno riešutų aliejuje ( lot. Olea Corylus americana) ir kituose [53].
Kitos MNRR sintezuojamos endogeniškai - miristoleino, eruko ir nervono rūgštys, tačiau jos organizme aptinkamos tik mažomis koncentracijomis. Eruko rūgšties didelė koncentracija aptinkama
nevalytame rapsų aliejuje [53]. Įstatymais yra ribojamas eruko rūgšties kiekis JAV- ne daugiau 2%, Europos Sąjungoje- ne daugiau 5%. Kai eruko rūgšties kiekiai atitinka nustatytus reikalavimus, tuomet nedaro žalos net naujagimių organizmui [4]. Buvo atliekami eksperimentai suaugusioms vyriškos lyties žiurkėms, kurioms 16 savaičių buvo duodama rapsų aliejaus. Ekperimentinėms žiurkėms dažniau pasireiškė širdies pažeidimai, nei kontrolinėms žiurkėms, kurios buvo maitinamos kiaulių taukų ir kukurūzų aliejaus mišiniu. Tiek didelės, tiek mažesnės koncentracijos eruko rūgšties rapsų aliejuje buvo susiję su atsiradusia širdies nekroze ir fibroze. Duomenys parodė padidėjusį riebalų nusėdimą, ko pasekoje susidaro miokardo pažeidimas. Šie tyrimai inicijavo rapsų aliejaus auginimą, kurio sudėtyje būtų mažai eruko rūgšties[8].
Apibendrinant, galime teigti, jog, dėl įrodyto teigiamo oleino riebalų rūgšties poveikio organizmui, sveikatos priežiūros specialistai, turėtų šviesti žmones apie jos teikiamą naudą, bei teikti rekomendacijas apie šios riebalų rūgšties šaltinius.
1.3.2 Mononesočiosios riebalų rūgštys - trans- konfigūracija
MNRR yra trans- konfigūracijos, kuomet vandenilio atomai prie dvigubosios jungties yra priešingose molekulės pusėse (7 pav.). Dėl neišlenktos struktūros, fizikinių ir cheminių savybių šios rūgštys artimos sočiosioms RR bei ląstelių membranas veikia panašiai. Pagrindinės trans- konfigūracijos MNRR yra elaidino (Omega-9) ir vaceninė (Omega-7)[53]. Jų aterogeninis poveikis yra dvigubai didesnis nei SRR. Buvo atliktas kontroliuojamas tyrimas, kurio metu nustatyta, jog trans RR didina MTL ir mažina DTL kiekį, taip pat pasižymi uždegiminiu poveikiu ( didina naviko nekrozės faktoriaus-α, C reaktyvaus baltymo, bei interleukino-6 aktyvumą) ir skatina endotelio disfunkciją. Šios RR gali pabloginti jautrumą insulinui, ypač asmenims, kurie jau turi polikį insulino atsparumui. Penki retrospektyviniai tyrimai ir keturi kohortinio tyrimo rezultatai parodė teigiamas asociacijas tarp šių RR vartojimo ir koronarinių širdies ligų atvejų. Tikslinių tyrimų metaanalizė parodė, kad kiekvienas pacientas vartojantis 2% trans- MNRR 24, 20, 27 ir 32% padidina galimą miokardo infarkto riziką [34,5].
Pagrindiniai trans- MNRR šaltiniai: hidrinti augaliniai aliejai, tokie kaip margarinas, aliejuje skrudintos bulvytės, bulvių, kukurūzų traškučiai, spragėsiai ir kiti greito maisto restoranų patiekalai [32,16]. Taigi, remiantis moksline literatūrą apie neigiamą trans- mononesočiųjų RR poveikį sveikatai, šių RR suvartojimas žmonių mityboje turėtų būti kuo mažesnis, siekiant išvengti nepageidaujamų sveikatos sutrikimų.
7 pav. Cis- konfigūracijos MNRR [27]
1.4 Polinesočiosios riebalų rūgštys
Polinesočiosios riebalų rūgštys (PNRR) - riebalų rūgštys, turinčios dvi ar daugiau dvigubųjų jungčių. PNRR klasifikuojamos į Omega-3 (ω -3) ir Omega-6 (ω -6) [1]. Šios riebalų rūgštys kaupiamos audinių ląstelių fosfolipidų membranose atlieka dvi svarbias funkcijas: yra ląstelių membranų struktūriniai komponentai, užtikrinantys jų stabilumą, apsaugą, bei yra konvertuojamos į svarbiausias aktyvias molekules – prostaglandinus [9,53]. Skirtumas tarp ω - 3 ir ω - 6 riebalų rūgščių: priešingai nei AR (ω-6), EPR (ω -3) gali būti metabolizuojama į eikozanoidus: prostaglandinus-3, leukotrienus-5 ir tromboksaną-3, DHR gali būti metabolizuojama į kitus autakoidus, tokius kaip restivinai, dokozatrienai ir neuroprotektinai. Eikozanoidai, kurie susidaro iš ω-3 - (EPR ir DHR) yra priešuždegiminiai, antiaritminiai, turintys vazodilatacinį poveikį, o tie, kurie formuojami iš ω-6 - (arachidono(AR)) - uždegiminiai, proaritminai, turintys vazokonstrikcinį poveikį. 2-oje lentelėje nurodyti pagrindiniai skirtumai tarp ω -6 ir ω -3 rūgščių eikozanoidų sukeliamo poveikio[42,9,15,37].
1.4.1 Polinesočiosios riebalų rūgštys (Omega-3)
Polinesočiųjų RR grupėje pagrindinė riebalų rūgštis yra α- linoleno rūgštis (α-LR). Pagrindiniai jos metabolitai yra EPR (eikozapentaeno rūgštis) ir DHR (dokozaheksaeno rūgštis) [31,37,1].
Pagrindiniai Omega-3 RR šaltiniai yra žuvys ir ypač riebiosios, tokios kaip: tunas, skumbrė, kodas, ančiuviai, lašiša, taip pat kai kurių augalų sėklos ir lapai - sojos pupelės (lot. Glycine), linų sėmenys (lot. Linum usitatissimum), juodųjų serbentų sėklos (lot. Ribes nigrum) ir dumblių lapai (lot.
Borago officinalis), chia sėklos (lot. Semen Chiae), šalto spaudimo rapsų aliejus (lot. Olea Brassica napus) ir t.t.
α-LR metabolitų EPR ir DHR pagrindiniai šaltiniai yra riebiosios žuvys, kurių sudėtyje yra apie 2 g EPR+DHR. EPR ir DHR iš α-LR konvertuojasi labai mažai, o kitokia sintezė žmogaus organizme nevyksta, todėl šios rūgštys vadinamos nepakeičiamomis ir turi būti gaunamos su maistu [53,31,30]. Norint pasiekti teigiamą poveikį sveikatai „Europos maisto saugos tarnybos komisija” rekomenduoja vartoti minimaliai 250 mg Omega-3 RR per parą [1].
Maisto ir vaistų administracijos tarnyba patvirtino, jog kaip papildoma dieta, siekiant sumažinti trigliceridų (TG) koncentraciją suaugusiems pacientams, kuriems yra sunki hipertrigliceridemija, per parą omega-3 dozė turėtų būti 2 g arba 4 g. Buvo atliekamas 12 savaičių trukmės, daugiacentris, placebo kontroliuojamas (alyvuogių aliejus), atsitiktinių imčių, dvigubai aklas, 3 fazių tyrimas, kuriame dalyvavo 162 pacientai, sergantys sunkia hipertrigliceridemija, kurie atsitiktiniu būdu buvo suskirstyti į omega-3 - 2 g per parą ir alyvuogių aliejus - 2 g per parą. Pagrindinis tyrimo tikslas buvo nustatyti omega-3 - 2 g per parą veiksmingumą lyginant su alyvuogių aliejumi. Gydant pacientus su Omega-3 ir alyvuogių aliejumi skirtumas buvo statistiškai reikšmingas. Sumažintas bendras cholesterolio kiekis (skirtumas − 15.9% [95% omega-3: −24.0% alyvuogių aliejus − 7.8%]), bei labai mažo tankio cholesterolio kiekis (skirtumas − 25.0% [95% omega-3: −36.7% alyvuogių aliejus- 11.0%]). Taigi tyrimas įrodo, kad gydymas Omega-3 - 2 g per parą statistiškai reikšmingai sumažina trigliceridų koncentraciją pacientams, kurių trigliceridų lygis yra didesnis nei 885 mg/dL, palyginus su gydymu alyvuogių aliejumi 2 g per parą [52].
Taip pat ilgos grandinės PNRR (EPR ir DHR) atlieka svarbų vaidmenį smegenyse, nes apie 50-60% suaugusių smegenų sauso svorio sudaro lipidai ir mažiausiai 35% lipidų kiekio sudaro PNRR, taigi šios RR yra svarbus smegenų ląstelių struktūrinis komponentas membranų fosfolipidų sluoksnyje. EPR ir DHR yra susitelkę smegenų membraninėse sinapsėse, o tai turi didelę reikšmę pažinimo, smegenų atminties, vykdymo ir elgsenos funkcijai [18,7,2]. DHR sudaro apie 20% smegenų riebalų rūgščių, o arachidono rūgštis sudaro apie 15%. Šių riebalų rūgščių kaupimasis smegenyse yra intensyviausias per trečiąjį nėštumo trimestrą ir pirmuosius dvejus metus nuo gimimo, todėl ypač svarbu nėštumo metu
užtikrinti pakankamą kiekį omega-3 RR rūgščių maisto racione, nes kūdikiams, kurie nepakankamai gauna šių rūgščių, gresia įvairūs nervų sistemos, vystymosi ir regėjimo sutrikimai [23,14,50].
Nustatyta, kad EPR ir DHR koncentracijos kraujyje būna mažos pas asmenis, kurie serga psichiatrinėmis ligomis, įskaitant bipolinį sutrikimą, šizofreniją, savižudybes. Epidemiologiniai tyrimai rodo, kad omega-3 RR trūkumas gali būti bipolinių sutrikimų rizikos veiksnys, nes bipoliniams pacientams DHR plazmoje yra reikšmingai sumažėjusi. Randomizuotų tyrimų metu nustatyta, kad vartojant kelis gramus papildomai EPR ir DHR pagerėjo depresijos simptomai, bei sumažėjo minčių apie savižudybę, pagerėjo kognityvinės funkcijos, įskaitant kalbos įgūdžius, koncentraciją, šizofrenijos simptomus, agresyvų ir impulsyvų elgesį. Intervenciniai tyrimai parodė, jog omega-3 papildai sumažino agresiją, pyktį, priešiškumą, antisocialinį elgesį, nerimą ir mokyklinių vaikų impulsyvumą [39,41,55].
Pagrindinės PNRR funkcijos [1,56]:
Slopina vazoagresyvių MTL sintezę ir greitina eliminaciją.
Mažina trombocitų skaičių, todėl prailginamas kraujavimo laikas bei sukeliamas kraujospūdžio sumažėjimas;
Turi teigiamą poveikį kitoms nei širdies ar kraujagyslių ligoms. Kadangi pasižymi priešuždegiminiu poveikiu pastebimas teigiamas poveikis gydant: odos ligas, astmą, artritą, nefritą, raudonąją vilkligę ir išsėtinę sklerozę;
Didelė DHR koncentracija aptinkama tinklainėje bei žmogaus ir kitų žinduolių smegenyse, todėl yra būtina normaliai regėjimo ir smegenų funkcijai;
Prisideda prie membranos skvarbos, kuri gali paveikti membraninių receptorių, tokių kaip rodopsinas funkciją;
DHR tiesiogiai veikia neurotransmiterių biosintezę, signalo perdavimą, serotonino įsisavinimą, jungimąsi prie β-adrenerginių ir serotonerginių receptorių bei lemia monoamino oksidazės aktyvumą;
Teigiamas poveikis širdies ir kraujagyslių ligų, vėžio prevencijai;
Riebaluose tirpių vitaminų A, D, E ir K transportavimas – kraujotakos pagalba riebalai transportuoja šiuos vitaminus ten, kur jų reikia.
1.4.2 Omega-3 riebalų rūgščių poveikis širdies ir kraujagyslių ligoms
Remiantis Europos sąjungos pateikta pastarojo laikotarpio mirčių statistika, didžiausią mirtingumo rodiklį sudaro širdies ir kraujagyslių ligos, kurių dažniausia priežastis: aukštas kraujospūdis, didelis mažo tankio cholesterolio kiekis, cukrinis diabetas bei rūkymas [33]. Dažniausia mirties nuo šios grupės ligų priežastis - išeminė širdies liga ar smegenų kraujagyslių ligos. 2013 m. Europos sąjungos
mirtingumo nuo išeminės širdies ligos rodiklis buvo 132 mirties atvejai 100 000 gyventojų. Didžiausi standartiniai mirtingumo nuo išeminės širdies ligos rodikliai nustatyti Lietuvoje, Latvijoje, Slovakijoje[19].
Omega-3 PNRR teigiamas poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai aiškinamas jų gebėjimu mažinti kepenyse trigliceridų gamybą ir didinti jų klirensą, taip pat gebėjimu įsiterpti į fosfolipidus ląstelių membranose, taip sumažinant substratų gamybą, kurie reikalingi uždegiminių molekulių gamybai [17]. 2017 metais paskelbtame tyrime pateikiami nauji įrodymai, jog omega-3 riebalų rūgštys turi reikšmingą poveikį pirminėje ir antrinėje koronarinės širdies ligos prevencijoje (KŠL) [36,43]. Šiame tyrime buvo sujungti 19 kohortinių tyrimų duomenų, kurie buvo atlikti 16 šalių. Dalyvavo daugiau nei 45000 asmenų, kurių stebėjimo laikotarpis sudarė 10 metų. Tyrimo dalyvių vidutinis amžius buvo 59 metai. Rezultatuose aprašomi: mirtinas arba nemirtinas miokardo infarktas, KŠL, koronarinis nepakankamumas, koronarinė mirtis, krūtinės angina ar angiografinė koronarinė stenozė. Nustatyta, kad kiekviena iš trijų omega-3 riebalų rūgščių: α-LR, EPR, DHR buvo susijusi su sumažėjusia mirtina CHD rizika. Taip pat nustatyta, jog santykinė rizika sumažėja maždaug 10%.
Remiantis tyrimu galima teigti, kad visos trys ištirtos omega-3 riebalų rūgštys mažina mirtinų CHD riziką ir įrodo omega-3 riebalų rūgščių teigiamą vaidmenį pirminėje širdies ligų prevencijoje [36]. Rekomenduojama EPR ir DHR suvartoti 500 mg per parą asmenims, kuriems yra didelė CHD rizika ir mažiausiai 800-1000 mg per parą asmenims, kuriems yra nustatyta koronarinė širdies liga [11].
1.4.3 Polinesočiosios riebalų rūgštys (Omega-6)
Omega–6 pagrindiniai metaboliniai produktai yra α-linolo ir arachidono rūgštys. Linolo rūgštis yra nepakeičiama ir būtina organizmui, nes ji negali būti sintetinama organizme. Omega-6 RR yra svarbios, kadangi prisideda prie ląstelių membranų struktūros ir funkcijos, bei atlieka tam tikrą vaidmenį reguliuojant genų aktyvumą ląstelėje. Arachidono rūgšties yra ypač daug smegenyse, todėl ji labai svarbi normaliam vaisiaus ir kūdikio smegenų vystymuisi. Tiek arachidono rūgštis, tiek α-linolo rūgštis yra prekursorius eikozanoidams (PGD2, LTC4, LTD4, LTE4), kurie veikia uždegimą, kraujo krešėjimą, raumenų tonusą ir daugelį kitų organizmo funkcijų [53].
Didelės koncentracijos Omega-6 (> 60%) yra sojos aliejuje, saulėgrąžų sėklų aliejuje (lot.
Helianthus annuus), dygmių aliejuje (lot. Carthamus tinctorius), vynuogių sėklų aliejuje (lot. Vitis vinifera), dumblių sėklų aliejuje (lot. Borago officinalis), juodųjų serbentų sėklų aliejuje (lot. Ribes nigrum) ir mažesnėmis koncentracijomis (40-50%) kviečių gemalų aliejuje (lot. Triticum vulgare),
1.5 Omega-3 ir omega-6 rūgščių santykio reikšmė
Omega-6 ir omega-3 RR - nepakeičiamos ir jų santykis yra labai svarbus norint išvengti ar sumažinti ligų riziką. Metaboliniu ir funkciniu požiūriu šios RR rūgštys skiriasi, bei turi reikšmingą priešingą fiziologinį poveikį organizmui. Gydant lėtines ligas labai svarbu subalansuoti omega-6 ir omega-3 riebalų rūgščių įsisavinamą kiekį [48]. Didžioji dauguma lėtinių ligų: širdies ir kraujagyslių, cukrinis diabetas, vežys, autoimuninės ligos, reumatoidinis artritas, astma, depresija ir nutukimas yra glaudžiai susijusios su uždegimo bei imuninės sistemos atsako mediatorių ir reguliatorių: tromboksano A2, leukotrieno B4, IL-1, IL-6, naviko nekrozės faktoriaus ir C-reaktyvaus proteino padidėjusia gamyba organizme [49]. Šių faktorių gamyba suaktyvėja padidėjus omega-6 ir sumažėjus omega-3 riebalų rūgščių įsisavinimui organizme, taip pat esant α-LR, EPR ir DHR sumažėjimui [47]. Optimali omega-6 ir omega-3 riebalų rūgščių dozė arba santykis varijuoja nuo 1:1 iki 1:5, priklausomai nuo nagrinėjamos ligos bei analizuojamo regiono, tačiau pastaraisiais dešimtmečiais labai stipriai padidėjo suvartojamo maisto, kuriame gausu nesočiųjų omega-6 RR ir gerokai sumažėjo nesočiųjų omega-3. Šių RR santykis vakarietiškoje žmonių mityboje šiuo metu siekia 10:1–20:1. [47,46,1]. Abiejų riebalų rūgščių apykaitai naudojami tie patys fermentai, dėl to tarp jų atsiranda konkurencija. Per didelis kiekis omega-6 riebalų rūgščių sutrigdo normalią omega-3 riebalų rūgščių apykaitą ir neleidžia organizmui jų įsisavinti, ko pasekoje padidėja įvairių sutrikimų rizika: uždegimo, širdies ir kraujagyslių ligų, depresijos, normalaus vystymosi, alerginių susirgimų ir t.t [47].
Taip pat dauguma nagrinėjamų šaltinių teigia, jog žmogaus homeostazei ir normaliam organizmo vystymuisi optimalus šių omega riebalų rūgščių santykis yra 1:2, kuomet santykis 4:1 - 70% sumažėja mirtingumas nuo širdies ir kraujagyslių ligų, bei krūties vėžio rizika, esant santykiui 2,5:1 – sumažėja rektalinių ląstelių proliferacija, 2-3:1 mažėja uždegimas sergantiems reumatoidiniu artritu, 5:1 – pastebėti teigiami rezultatai sergantiems astma, o santykis 10:1 turėjo priešingą, neigiamą poveikį organizmui [46].
Išanalizavus mokslinę literatūrą galima teigti, jog svarbiausia užtikrinti omega-6 ir omega-3 reikiamą santykį organizme, kadangi padidėjęs Omega-6 suvartojimas neleidžia įsisavinti Omgea-3 RR ir pasiekti teigiamo poveikio organizmui.
1.6 Dujų chromatografija ir jos taikymas riebalų rūgščių nustatymui
Šio darbo pagrindinis tikslas yra įvertinti nesočiąsias riebalų rūgštis kokybiškai ir kiekybiškai žuvų taukų preparatuose. Šiam tikslui ir reikiamiems rezultatams pasiekti buvo pasirinktas dujų chromatografijos metodas kartu su liepsnos jonizacijos detektoriumi.
Dujų chromatografija (DC) - tai yra chromatografinis skirstymo metodas, kuriame judančioji fazė yra dujos, o stacionari – kietas nešiklis. Metodas pagrįstas skirtinga dujinės fazės mišinio komponentų sugertimi pasirinkto sorbento paviršiuje [25]. Atliekant analizę šiuo būdu, mėginys, kuriame yra lakieji junginiai, įpurškiamas į dujų chromatografą. Viduje jis greitai kaitinamas iki aukštos temperatūros, kad visi mėginiai galėtų patekti į dujinę fazę - mobilią fazę. Vėliau išgarintas mėginys per ploną kolonėlę pernešamas dujų, tokių kaip helis, azotas, argonas ar vandenilis, ir sąveikauja su nejudria (stacionaria faze).[23] Metodas taikomas analizuoti įvairios kilmės daugiakomponenčius junginius, organinės kilmės lakius junginius, organinių ir neorganinių junginių mišinius, įvairias dujas, medžiagas, kurių virimo temperatūra gali būti tiek aukšta ir žema [28].
Privalumai, lyginant šį metodą su kitais: didelis medžiagų atskyrimo laipsnis bei jautrumas, gebėjimas aiškiai atskirti chromatografines smailes viena nuo kitos, lengvai koreguojami parametrai, tokie kaip: temperatūra, dujų tėkmės greitis bei kolonėlių pasirinkimo įvairovė. Taip pat šis metodas yra greitas, idealiai tinka lakių junginių analizei, medžiagas galima analizuoti kokybiškai ir kiekybiškai, platus tiriamųjų medžiagų pasirinkimas, kadangi tinka analizuoti: dujas, skysčius, kietąsias medžiagas [28].
Pagrindinės dujų chromatografo dalys: dujų šaltinis, dujų nešiklio reguliatorius, injektorius, kolonėlė, kurią sudaro stacionari kieta fazė, per kurią nuolat teka mobili fazė (dujos), detektorius ir vaizduoklis [28].
Prie sistemos prinjungtos dujos (dažniausiai analizei naudojamos helio ar azoto dujos), kurios nuolatos yra tiekiamos į sistemą. Taip pat šios dujos turi būti chemiškai inertiškos, jog nesąveikautų su tiriamomis medžiagomis. Dujų pasirinkimas priklauso nuo tiriamųjų medžiagų, bei naudojamos kolonėlės. Dujos užtikrina nuolatinį analazijuojamojo bandinio transportą sistemoje, ko pasekoje vyksta absorbcijos procesas. Absorbcijos procesas svarbus faktorius analizuojant mėginį. Injektoriaus ir kaitinimo elemanto paskirtis - analizuojamų medžiagų įvedimas į sistemą . Chromatografinę kolonėlę užpildo polimerinė medžiaga, kuri lemia medžiagų tarpusavio atsiskyrimą. Sorbentai, kuriais gali būti užpildoma chromatografinė kolonėlė: aliuminio oksidas, aktyvinta anglis, silikagelis, kolonėlėje medžiagos mišinys išsiskirsto į atskirus komponentus ir įvyksta atsiskyrimas. Pagrindiniai reikalavimai stacionariai fazei - ji turi užtikrinti tinkamą selektyvumo laipsnį molekulių atskyrimui. Taip pat turi turėti cheminį ir fizikinį stabilumą, kad prailgintų kolonėlės darbinį gyvavimo laiką. Injektoriaus paskirtis – įvesti analizuojamąjį mėginį į sistemą. Detektoriaus paskirtis – užfiksuoti ir identifikuoti analizuojamojo mėginio sudedamąsias dalis, kurios gaunamos iš kolonėlės. Naudojamų detektorių įvairovė gana gausi, jie gali būti įvairių tipų: dažnai taikomi liepsnos jonizacijos, šiluminio laidumo, fotojonizacijos, elektronų laidumo, infraraudonasis bei kiti detektoriai. [28]
Derivatizacija svarbi, kadangi RR pasižymi dideliu poliariškumu ir yra linkusios sudaryti vandenilinias jungtis, todėl susiduriama su junginių absorbcijos problemomis. Sumažinus jų poliariškumą (atlikus derivatizaciją) junginiai gali būti identifikuojami taikant DC metodą. Norint atskirti labai nežymius nesočiųjų RR skirtumus pirmiasia reikia neutralizuoti polines karboksilo funkcines grupes. Neutralizavus šias grupes, kolonėlė geba atskirti junginius, remiantis jų virimo temperatūra, nesotumo laipsniu, neprisotintos jungties pozicija, bei cis ir trans konfigūracija [6].
DC naudojamos kapiliarinės kolonėlės pasižymi dideliu poliariškumu, kas užtikrina selektyvumą norint atskirti ir identifikuoti skirtingus junginius riebaluose. 2013 metais buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo analizuojamos RR jūriniuose organizmuose, taikant DC metodą, naudojant kartu detektorių - masių spektrofotometrą. Tyrime pateikti rezultatai bei išvados teigia, jog DC-MS pateikia tikslius, aiškius duomenis, apie kiekvienos RR kokybę bei kiekybę skirtinguose jūrų organizmuose. Taip pat tyrimo rezultatuose pabrėžiama, jog jūros organizmai yra praturtinti žmogui būtinomis RR [6].
Dujų chromatografija dažniausiai derinama su masių spektrometrijos detektoriumi, siekiant toliau analizuoti mėginius. Masių spektrometras pateikia papildomos informacijos apie mėginį, kurios dujų chromatografija negali analizuoti, pvz., junginio molekulinę masę ir molekulės struktūrą, taip pat pateikia mums kiekybinius duomenis. Šis detektorius naudojamas, kuomet reikalingas labai mažas paruoštų mėginių kiekis (~1μl) padavimui į sistemą, kurie esant aukštai temperatūrai (~250 C) yra tiriami bei analizuojami. Veikimo principas: organinės molekulės (analizuojamasis mėginys) garų fazėje yra apšaudomos elekronais ir suformuoja teigiamai įkrautus jonus (įvyksta jonizacija). Jonai gali fragmentuotis skirtingais būdais į mažesnius jonizuotus fragmentus, kurie yra praleidžiami per magnetinį lauką arba elektrostatinį lauką ir atskiriami pagal jų masės ir krūvio santykį. Detektoriuje užfiksuotas elektrinis signalas yra perduodamas į kompiuterį, kuris pagal gautus signalus, pateikia analizuojamojo mėginio grafinę išraišką – chromatogramą. Junginiai identifikuojami, pirmiausia, išmatuojant tiriamųjų medžiagų spektrus, o paskui palyginant juos su kompiuterio programoje esančiose bibliotekose užfiksuotais skirtingų junginių masių spektrais [22,38].
Apibendrinant DC metodas yra tinkamas, tikslus, patikimas ir greitas, norint ištirti RR kokybiškai ir kiekybiškai, todėl savo magistriniame darbe taikysiu būtent šį analizės metodą.
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo organizavimas
Tyrimas buvo vygdomas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Medicinos akademijoje, Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje. Tyrimo atlikimo laikas 2016-2018 metai.
Tyrimo organizavimo eiga:
1. Mokslinės literatūros analizė bei vertinimas;
2. Magistrinio darbo tikslo bei uždavinių suformulavimas;
3. Magistrinio darbo tyrimo eigos suformulavimas, remiantis pasirinkta metodika.
2.2 Tyrimo objektas
Magistrinio darbo tyrimo objektas - vaistinėse įsigyti, penkių skirtingų gamintojų, kapsuliuoti ir skystos formos žuvų taukų maisto papildai. Paimti 5 mėginiai iš skirtingų gamintojų žuvų taukų kapsulių ir skystos formos. Buvo padaryta tos pačios serijos maisto papildo 3 pakartojimai, kurie buvo analizuojami kokybiškai ir kiekybiškai, taikant dujų chromatografijos metodą. Tyrimo mėginiams pasirinkti 3-oje lentelėje nurodyti žuvų taukų gamintojai.
3 lentelė. Tiriamieji žuvų taukai Numeris Tiriamieji žuvų taukai
Nr.1 Norvegiški „Zinzin“ Nr.2 Lietuviški „Omega-1000“ Nr.3 Islandiški „LiveWell“
Nr.4 Norvegiški „Mollers Doppel Imunity“ Nr.5 Islandiški „Shark liver oil“
2.3 Tyrimo medžiagos ir prietaisai
Tyrimui naudotos medžiagos Metanolis („Sigma Aldrich“, Steinheim, Vokietija); Natrio chloridas („Sigma Aldrich“, Steinheim, Vokietija);
Natrio hidroksidas („Sigma Aldrich“, Steinheim, Vokietija); Azoto dujos („Gaschema“, Lietuva);
Heksanas („Sigma Aldrich“, Steinheim, Vokietija); Helio dujos („AGA GAS“, Lietuva);
Darbui atlikti naudota aparatūra bei prietaisai:
Automatinės pipetės „Eppendorf“ (Hamburgas, Vokietija“); Vandens vonelė „Heidolph“ (Vokietija);
Vandens išgryninimo sistema „Milipore“ (Darmstadt, Vokietija);
Dujų chromatografas su liepsnos jonizaciniu detektoriumi Shimadzu GC – 2010 PLUS, Shimadzu Corporation, Japonija.
2.4 Tyrimo eiga
Tyrimo atlikimo eigą sudarė šie punktai:
1. Mėginių paėmimas iš tiriamojo objekto; 2. Paimtų mėginių paruošimas;
3. Esterifikacijos reagento ir katalizatoriaus paruošimas; 4. Riebalų rūgščių pavertimas į metilesterius;
5. Paruoštų riebalų rūgščių metilesterių ekstrakcija; 6. Chromatografinės analizės atlikimas;
7. Duomenų, gautų iš chromatogramų analizė;
8. Kokybinis bei kiekybinis riebalų rūgščių vertinimas.
2.5 Tyrimo metodai
Norint įvertinti tiriamuosiuose žuvų taukuose esančių riebalų rūgščių kokybinę bei kiekybinę sudėtį, buvo taikytas silinimas šildant, kurio tikslas buvo paruošti mėginius DC analizei, kartu naudojant liepsnos jonizacijos detektorių.
Riebalų rūgščių analizei mėginiai paruošiami remiantis LST EN ISO 12966- 2:2011 reikalavimais. Kokybinei ir kiekybinei riebalų rūgščių analizei buvo naudotas „Shimadzu GC-2010-PLUS” dujų chromatografas. Visa naudota metodika pateikiama punktais:
I. Mėginių paėmimas.
Mėginių tikslus tūris buvo imamas naudojant automatinę pipetę. Paimti žuvų taukų mėginiai buvo sandariai uždaryti ir laikomi šaldytuve 2 – 8 °C temperatūroje. Kiekvieną kartą prieš atliekant eksperimentus, mėginiai buvo išimami ir atšildomi iki kambario temperatūros.
II. Esterifikacijos reagento ( 0,5 M natrio hidroksido (NaOH) metanolyje) gamyba
Visų pirma matavimo kolboje pamatuojamas tikslus tūris (100ml) metanolio tirpalo. Tuomet atsveriame tiksliai 4g natrio šarmo. Natrio hidroksidas ištirpinamas metanolyje. Proceso pagreitinimui buvo panaudota ultragarso vonelė. Tokiu būdu gautas 0,5 M NaOH tirpalas, kuris veikia kaip katalizatorius, sudarydamas joninius ryšius su naujai susidariusiomis laisvomis RR, o vėliau užleisdamas vietą alkoholinėms grupėms ir sudarydamas riebalų rūgščių metilo esterius. Gautas NaOH metanolinis tirpalas naudojamas tolimesniems tyrimamams.
III. Sotaus natrio chlorido (NaCl) gamyba
Atsveriama 40g NaCl. Natrio chloridas perkeliamas į kaitinimo kolbą, kurioje ištirpinamas 100ml distiliuoto vandens. Kolba kaitinama ant kaitinimo plytelės ir nuolat maišoma. Gautas sotus NaCl tirpalas, kuris veikia kaip katalizatorius ir bus naudojamas tolimesniuose tyrimuose.
IV. Riebalų rūgščių metilesterių gamyba
Norint atlikti RR analizę dujų chromatografu, pirmiausia RR reikia paversti į nepolinius, mažos molekulinės masės junginius – metilesterius. RR pavertimui į metilesterius buvo naudotas silinimas šildant. Tyrimui atlikti buvo imta 100mg mėginio į 100ml kolbą. Įpilama pasigaminto metanolinio NaOH tirpalo (c = 0,5 mol/L). Toliau mišinys buvo šildomas vandens vonelėje, 50oC 5min. Temperatūra reikalinga derivatizacijos pagreitinimui. Šio proceso metu įvyksta transmetilinimas.
V. Riebalų rūgščių metilesterių ekstrakcija
Po 5 minučių šildymo į mišinį įpilama 8 ml heksano ir toliau šildoma apie 1 minutę vandens vonelėje, esant 50°C temperatūrai. Praėjus 1 min. įpilama 5 ml sotaus natrio chlorido (NaCl) tirpalo į mišinį ir laukiama, kol tirpalas atvės. Sotusis natrio chlorido tirpalas padeda atsiskirti organiniams sluoksniams. Tuomet tirpalas atvėsinamas ir su automatine pipete paimama 1 ml viršutinio heksano sluoksnio. Gaunamas ekstraktas yra analizuojamas dujų chromatografu.
Paruošti mėginiai sudedami į chromatografą. Rezultatai gaunami kitą dieną po paleidimo. Atėjus į laboratoriją gauti chromatogramų duomenys buvo išsaugoti atskirame dokumente. Kadangi RR metilesteriai pasižymi skirtinga sulaikymo trukme, pradžioje buvo aptinkami silpniau adsorbuojami, o vėliau stipriau adsorbuojami metilesteriai. Kiekviena chromatograma buvo analizuojama vertinant gautas smailes. Smailės buvo sunumeruotos ir šalia pateikta lentelė su kiekvienos riebalų rūgšties sulaikymo laiku, pločiu ir ilgiu. Ploto skaičius buvo naudojamas norint apsiskaičiuoti koncentraciją, naudotos tiesinės regresijos lygtys. Dujos nešėjos buvo pasirinktos – helio, kadangi yra saugesnės, mažiau sprogios, taip pat pasiekiamas geresnis chromatografinis išskirstymas. Naudota kolonėlė buvo 110 metrų, siekiant geresnės junginių išskirstymo kokybės, kadangi standartą sudarė 37 RR. Naudotas detektorius buvo liepsnos jonizacijos, kuriame užfiksuotas elektrinis signalas buvo perduodamas į kompiuterį, kuris pagal gautus signalus, pateikė analizuojamojo mėginio grafinę išraišką – chromatogramą. Gauti chromatogramų duomenys buvo palyginti su standarto chromatograma.
Eksperimentinio tyrimo sąlygos
Buvo naudojama „Rt-2560” kolonėlė, kurios parametrai 110 m x 0.25 mm x 0.20 µl. Tyrime naudotas temperatūros gradientas: 100-240 oC per 71,67 min. Kaip nešančios dujos buvo naudojamos 99,99% grynumo helio dujos. Bendras tėkmės greitis 29,5 ml/min, o tėkmės greitis kolonėlėje buvo 1,26 ml/min, slėgis- 287,1 kPa. Injektoriaus temperatūra 230 oC.
2.6 Statistinės duomenų analizės metodai
Atlikus chromatografinę analizę buvo gautos skirtingų mėginių chromatogramos. Chromatogramose buvo užfiksuoti skirtingi riebalų rūgščių sulaikymo laikai bei smailių plotai, kurie buvo lyginami su standartu. Kiekybiniam kiekvienos rūgšties įvertinimui taikytos skirtingos formulės, naudojant „Microsoft Corporation Excell 2016” programą. Eksperimentas buvo atliekamas tris kartus, rezultatai pateikti vidurkių standartine išraiška, sudarytos diagramos bei apskaičiuoti standartinių nuokrypių dydžiai. Gauti rezultatai pateikti remiantis p< 0,05 statistiniu patikimumu.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Riebalų rūgščių vertinimas dujų chromatografijos metodu
3.1.1 Kokybinis riebalų rūgščių vertinimas dujų chromatografijos metodu
Šio tyrimo metu buvo naudotas „ST 37MIX 1207” standartas, į kurio sudėtį įeina 37 skirtingos riebalų rūgštys, kurios nurodytos prieduose pateiktoje 4 lentelėje. Kokybiniam riebalų rūgščių įvertinimui buvo naudotas dujų chromatografijos metodas. Šiai metodikai reikalingos sąlygos buvo nustatytos vadovaujantis kartu su standartu pateiktame sertifikate.
Atlikus dujų chromatografiją buvo gauta standarto chromatograma (8 pav.), kurioje matomos riebalų rūgščių smailės bei jų sulaikymo laikai, kas leidžia teigti, jog taikyta metodika yra specifiška, tai yra geba identifikuoti kiekvieną atskirą riebalų rūgštį skirtinguose analizuojamuose žuvų taukų mėginiuose (9 pav.). Atlikus ir įvertinus gautus žuvų taukų kokybinės analizės duomenis, buvo nustatyta, jog ne visos riebalų rūgštys buvo identifikuotos, dėl sąlyginai mažų koncentracijų. Tirtuose žuvų taukuose identifikuota vidutiniškai nuo 14 iki 26 skirtingų riebalų rūgščių.
9 pav. Analizuojamųjų mėginių chromatogramos
3.1.2 Kiekybinis riebalų rūgščių vertinimas dujų chromatografijos metodu
Po kokybinio riebalų rūgščių įvertinimo buvo taikomas kiekybinis riebalų rūgščių įvertinimas, taikant dujų chromatografijos metodą. Buvo sudarytos kalibracinės kreivės visoms tiriamosioms riebalų rūgštims, kalibracinė kreivė sudaryta iš 7 taškų. Naudoto etaloninio tirpalo koncentracijų intervalas varijavo nuo 3,09 – 399,8 µg/ml. Kalibracinio grafiko koeficientas buvo nemažesnis nei 0,999, todėl galima teigti, jog kalibracinis grafikas buvo tiesiškas.
3.2 Nustatytas riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose
Tyrimas suskirstytas į kelias dalis. Pirmiausia darbe analizuojamas bendras sočiųjų ir nesočiųjų riebalų rūgščių kiekis bei kokią procentinę dalį sudaro nepakeičiamos riebalų rūgštys, antras etapas - atskirų omega 3, 6, 9 riebalų rūgščių kiekio vertinimas, svarbiausių omega-3 RR (DHR ir EPR) kiekio įvertinimas bei omega-3/omega-6 santykio vertinimas, 3 etapas – riebalų rūgščių kiekybinis palyginimas su reglamentuojamu ant pakuotės kiekiu.
3.2.1 Sočiųjų riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose
Šios tyrimo dalies tikslas buvo nustatyti, kokią procentinę dalį sudaro sočiosios riebalų rūgštys tiriamuosiuose skirtinguose žuvų taukuose (10 pav.), o vėliau palyginti sočiųjų RR procentinį kiekį su nesočiosiomis riebalų rūgštimis. Koncentracijos pateiktos procentais lyginant su bendru riebalų rūgščių kiekiu.
10 pav. Sočiųjų riebalų rūgščių koncentracija % lyginant su BRRK
Remiantis gautais duomenimis galime daryti prielaidą, jog didžiausia aptikta sočiųjų riebalų rugščių koncentracija buvo lietuviškuose Nr.2 žuvų taukuose (98,15±0,17%). Mažesnis sočiųjų RR kiekis buvo nustatytas Islandiškuose Nr.5 (7.63±0,2%) žuvų taukuose. Mažiau nei 2% sočiųjų RR buvo nustatyta islandiškuose Nr.3 (1,62%±0,1%), norvegiškuose Nr.4 (1.18±0,03%) ir norvegiškuose Nr.1 (1,08±0,06%) tirtuose žuvų taukuose.
Remiantis Europos sąjungos reglamentu Nr. 1169/2011 rekomenduojamas sočiųjų riebalų
1.08 1.18 1.62 7.63 98.15 0 20 40 60 80 100 120 Norvegiški Nr.1 Norvegiški Nr.2 Islandiški Nr.3 Islandiški Nr.5 Lietuviški Nr.2 Koncentracija,%
labai svarbus, nes per dideli kiekiai gali būti pagrindinis rizikos faktorius širdies ir kraujagyslių ligų atsiradimui, nutukimui, cukriniam diabetui ir padidėjusiai vėžio rizikai [26,24,22]. Taigi, apibendrinant gautus rezultatus, galime teigti, jog visi tirti žuvų taukai neviršija sočiųjų RR rekomenduojamos normos, tačiau saugiausi, su mažiausia sočiųjų riebalų koncentracija buvo norvegiški Nr.1 ir Nr.4 bei islandiški Nr.3 žuvų taukai.
3.2.2 Bendras nesočiųjų riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose
Nesočiosios riebalų rūgštys skirstomos į polinesočiąsias riebalų rūgštis, kurias sudaro omega-3 ir omega-6 RR bei kurios žmogaus organizme nėra sintetinamos, todėl privaloma jas gauti su maistu. Taip pat nesočiosioms RR priskiriamos mononesočiosios (omega-9) ir Trans RR [37].
Išanalizavus tyrimo duomenis nustatyta, jog visuose tirtuose žuvų taukuose aptiktos nesočiosios RR, kurių koncentracija svyravo atitinkamai nuo 62,58- 5,12%. Didžiausia nesočiųjų RR koncentracija buvo nustatyta lietuviškuose Nr.2 žuvų taukuose (65,55±0,23%), o mažiausia norvegiškuose Nr.1 žuvų taukuose (5,18±0,09%). Nr.5, Nr.4 ir Nr.3 žuvų taukuose nustatytos koncentracijos buvo mažesnės: tirtuose islandiškuose Nr.5 žuvų taukuose (30,67±0,36%), norvegiškuose Nr.4 (9,34±0,24%) ir islandiškuose Nr.3 (7,55±0,91%). Koncentracijos pateiktos procentais lyginant su bendru riebalų rūgščių kiekiu. Gauti rezultatai pateikti 11 paveiksle.
11 pav. Bendra nesočiųjų riebalų rūgščių koncentracija % lyginant su BRRK
Mokslinėje literatūroje gausu informacijos apie nesočiųjų riebalų rūgščių teigiamą poveikį organizmui. MNRR mažina MTL ir didina DTL, polinesočiosios svarbios imunitetui, širdies ir kraujagyslių lygų, Alzhaimerio prevencijai ir t.t [35,10,21]. Todėl tyrime analizavau būtent šių rūgščių
5.18 7.55 9.34 30.67 65.55 0 20 40 60 80 100 Norvegiški Nr.1 Islandiški Nr.3 Norvegiški Nr.4 Islandiški Nr.5 Lietuviški Nr.2 Koncentracija, %
koncentraciją žūvų taukuose. Apibendrinant gautus tyrimo duomenis galima teigti, kad nesočiųjų riebalų rugščių kiekis visuose žuvų taukuose procentaliai buvo didesnis nei sočiųjų riebalų rūgščių, išskyrus lietuviškus Nr.2 žuvų taukus. Didžiausias nesočiųjų riebalų rūgščių kiekis užfiksuotas taip pat būtent lietuviškuose Nr.2 bei islandiškuose Nr.5 žuvų taukuose.
Remiantis vienu parametru, tai yra, bendru nesočiųjų RR kiekiu, negalime įvertinti žuvų taukų kokybinės ir kiekybinės sudėties, kadangi atskirų sudedamųjų dalių kiekio vertinimai yra gerokai svarbesni norint įvertinti žuvų taukus. Todėl tolimesniuose tyrimuose bus vertinama, kokią procentinę dalį sudaro nepakeičiamos riebalų rūgštys, bei kokia jų kiekybinė sudėtis.
3.2.3 Nepakeičiamųjų riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose
Nepakeičiamoms riebalų rūgštims priskiriamos polinesočiosios riebalų rūgštys: Omega-3 (α-linoleno, DHR ir EPR) bei omega-6 (linolo rūgštis)[37]. Šiame tyrimo etape analizuota būtent šių riebalų rūgščių kiekybinė sudėtis analizuojamuose mėginiuose. Atlikus eksperimentinius tyrimus nustatytas procentinis nepakeičiamųjų riebalų rūgščių kiekis, lyginant su bendru nepakeičiamųjų riebalų rūgščių kiekiu, rezultatai pateikti 12 paveiksle.
12 pav. Nepakeičiamųjų riebalų rūgščių koncentracija % lyginant su BRRK
Didžiausia koncentracija nepakeičiamųjų riebalų rūgščių (74,64±0,2%) nustatyta islandiškuose Nr.3 žuvų taukuose, mažiau (60,78±0,34%) buvo nustatyta norvegiškuose Nr.4 žuvų taukuose. Mažiausi kiekiai nepakeičiamų riebalų rūgščių buvo nustatyti šiuose analizuojamuose žuvų taukuose: norvegiški Nr.1 (11,21±0,27%), lietuviški Nr.2 (11,2±0,16%) bei (3,42±0,22%) islandiški Nr.5 žuvų taukai.
3.42 11.2 11.21 60.78 74.64 0 20 40 60 80 100 Islandiški Nr.5 Lietuviški Nr.2 Norvegiški Nr.1 Norvegiški Nr.4 Islandiški Nr.3 Koncentracija, %
Kadangi žmogaus organizme nepakeičiamos rūgštys nėra sintetinamos ir turi būti gaunamos su maistu arba maisto papildais, buvo labai svarbu įvertinti, kurių žuvų taukų sudėtyje yra didžiausias kiekis šių RR. Apibendrinant tyrimo rezultatus, galima teigti, jog visuose tiriamuosiuose žuvų taukuose buvo aptikta atitinkamai nuo 3-74% nepakeičiamųjų riebalų rūgščių. Didžiausios užfiksuotos koncentracijos nesočiųjų RR buvo islandiškuose Nr.3 bei norvegiškuose Nr.4 žuvų taukuose, todėl galima teigti, jog šie žuvų taukai vertingesni savo sudėtimi. Tolimesnėje tyrimų eigoje svarbu išanalizuoti, kokią procentinę dalį, tiriamuosiuose žuvų taukuose, sudaro Omega-3 RR ir Omega-6, bei palyginti šių rūgščių santykį.
3.2.4 Omega-3 riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose
Šiame tyrimo etape analizuotos Omega-3 riebalų rūgštys, kurioms priskiriamos: α-linoleno rūgštis, EPR ir DHR [37]. Visų šių riebalų rūgščių procentinis kiekis buvo apskaičiuotas remiantis bendru Omega-3 riebalų rūgščių kiekiu. Gauti rezultatai pateikiami 13 paveiksle.
13 pav. Omega-3 riebalų rūgščių koncentracija % lyginant su BRRK
Remiantis gautais tyrimo duomenimis, galima teigti, jog didžiausia Omega-3 RR koncentracija nustatyta lietuviškuose Nr.2 (22,32±0,26%) žuvų taukuose, panašios koncentracijos buvo nustatytos islandiškuose Nr.3 (19,13±0,41%) bei norvegiškuose Nr.4 (18,42±0,16%) žuvų taukuose. Mažesnės koncentracijos buvo nustatytos islandiškuose Nr.5 (3,23±0,15%) bei norvegiškuose Nr.1 (1,72±0,2%) žuvų taukuose.
Dėl teigiamo poveikio sveikatai ir padidėjusio poreikio, galima teigti, jog Omega-3 yra pačios svarbiausios RR, todėl, norint išsirinkti tinkamiausius žuvų taukus, reikia atsižvelgti į Omega-3 kiekį
1.72 3.23 18.42 19.13 22.32 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Norvegiški Nr.1 Islandiški Nr.5 Norvegiški Nr.4 Islandiški Nr.3 Lietuviški Nr.2 Koncentracija, %
juose. Apibendrinant gautus duomenis galima daryti išvadą, jog visuose analizuojamuose žuvų taukuose buvo aptiktos Omega-3 riebalų rūgštys, bet didžiausia jų koncentracija nustatyta lietuviškuose Nr.2 ir islandiškuose Nr.3 žuvų taukuose.
Dvi svarbiausios omega-3 riebalų rūgštys – EPR (eikozapentaeno rūgštis) ir DHR (dokozaheksaeno rūgštis), iš kurių organizme gaminamos biologiškai aktyvios medžiagos. Šios RR -pagrindiniai ląstelių membranų komponentai, kurie reguliuoja odos, smegenų ląstelių, akių tinklainės bei kitas funkcijas [9]. Todėl kitas mano tyrimo etapas sudaro būtent šių RR koncentracijos įvertinimą %, lyginant su BRRK kiekiu skirtinguose žuvų taukuose. Gauti tyrimo rezultatai pateikiami 14 paveiksle.
14 pav. DHR ir EPR riebalų rūgščių koncentracija procentais lyginant su BRRK
Remiantis gautais tyrimo duomenimis matyti, jog didžiausia EPR ir DHR procentinė koncentracija buvo nustatyta islandiškuose Nr.3 (25,76±0,31%) bei norvegiškuose Nr.4 (25,60±0,12%) žuvų taukuose. Kituose tiriamuosiuose taukuose buvo užfiksuotos mažesnės šių RR koncentracijos: islandiškuose Nr.5 (4,35±0,3%), norvegiškuose Nr.1 (2,99±0,23%), bei lietuviškuose Nr.2 (1,88±0,15%).
Apibendrinant galima teigti, jog EPR ir DHR RR buvo aptiktos visuose žuvų taukuose, tačiau tik islandiškuose Nr.3 bei norvegiškuose Nr.4 žuvų taukuose šių RR koncetracija buvo didesnė nei 20%.Visuose kituose tirtuose žuvų taukuose koncentracija neviršijo 5%. Taigi duomenys įrodo, kad bendras omega-3 riebalų rūgščių kiekis neparodo, kokią dalį sudaro būtinosios RR - DHR ir EPR, dėl to yra būtinas atskiras DHR ir EPR riebalų rūgščių koncentracijos vertinimas, norint įvertinti žuvų taukų kokybę. 1.88 2.99 4.35 25.6 25.76 0 20 40 60 80 100 Lietuviški Nr.2 Norvegiški Nr.1 Islandiški Nr.5 Norvegiški Nr.4 Islandiški Nr.3 Koncentracija, %
3.2.5 Omega-6 riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose
Šio tyrimo etapo tikslas išanalizuoti omega-6 riebalų rūgščių koncentraciją skirtinguose žuvų taukuose, kadangi šie duomenys yra labai svarbūs norint įvertinti, ar omega-3 bei omega-6 santykis yra tinkamas ir atitinkantis PSO keliamus reikalavimus. Omega-6 riebalų rūgštys, kurios bus analizuojamos: linolo, linolelaido, γ-linoleno, cis-11,14-eikozadieno ir cis-8,11,14-eikozatrieno, cis-5,8,11,14-eikozatetraeno ir cis-13,16- dokozadieno riebalų rūgštys. Gauti tyrimo rezultatai pateikiami % lyginant su BRRK 15 paveiksle.
15 pav. Omega-6 riebalų rūgščių koncentracija % lyginant su BRRK
Remiantis gautais rezultatais galima teigti, jog didžiausia nustatyta omega-6 koncentracija buvo islandiškuose Nr.5 (66,88±0,4%) žuvų taukuose. Mažesnė koncentracija nustatyta Lietuviškuose Nr.2 žuvų taukuose (23,21±0,22%). Mažiausios nustatytos koncentracijos buvo: norvegiškuose Nr.1 (6,15±0,15%), norvegiškuose Nr.4 (4,69±0,17%), islandiškuose Nr.3 (2,39±0,14%) žuvų taukuose.
Vakarietiškose dietose omega-6 kiekis stipriai padidėjęs, šios rūgšties perteklius gali sukelti neigiamą poveikį organizme: aritmijas, uždegimo skatinimą ir t.t [42] Apibendrinant galima daryti išvadą, jog visuose tiriamuosiuose žuvų taukuose yra aptikta atitinkamai nuo 2-67 % omega-6 RR. Didžiausias nustatytas kiekis omega-6 buvo islandiškuose Nr.5, o mažiausias islandiškuose Nr. 3 žuvų taukuose, tačiau norint įvertinti poveikį organizmui būtinas omega-6 ir omega-3 santykio vertinimas.
2.39 4.69 6.15 23.21 66.88 0 20 40 60 80 100 Islandiški Nr.3 Norvegiški Nr.4 Norvegiški Nr.1 Lietuviški Nr.2 Islandiški Nr.5 Koncentracija, %
3.2.6 Omega-6 ir omega-3 riebalų rūgščių santykio palyginimas
Šiame tyrimo etape buvo analizuojamas omega-6 ir omega-3 nesočiųjų riebalų rūgščių santykis skirtinguose žuvų taukuose, kadangi būtent šis santykis labai svarbus norint pasiekti teigiamą poveikį sveikatai. Remiantis PSO omega-6 ir omega-3 nesočiųjų riebalų rūgščių santykis turėtų būti nuo 1:1 iki 5:1[18, 47]. Rezultatai pateikiami % lyginant su BRRK 4 lentelėje.
4 lentelė. Omega-6 ir Omega-3 santykis analizuojamuose žuvų taukuose
Analizuojami žuvų taukai Omega-6/Omega-3 santykis
Norvegiški Nr.1 1:1
Lietuviški Nr.2 1:1
Islandiški Nr.3 1:8
Norvegiški Nr.4 1:4
Islandiški Nr.5 1:0,04
Palyginus žuvų taukuose esančių omega-3 ir omega-6 riebalų rūgščių santykį, buvo nustatyta, jog reglamentuojamą PSO santykį atitiko lietuviški Nr.2 6/ ω-3 santykis 1:1) ir norvegiški Nr.1 (ω-6/ ω-3 santykis 1:1). Islandiški Nr.3 žuvų taukai viršijo rekomenduojamą santykį (ω-(ω-6/ ω-3 santykis 1:8), taip pat rekomenduojamų normų neatitiko ir norvegiški Nr.4 (ω-6/ω-3 santykis 1:4) žuvų taukai.
Apibendrinant gautus rezultatus, galima teigti, jog labiausiai santykio neatitiko islandiški Nr.3 ir norvegiški Nr.4 žuvų taukai, tačiau remiantis moksline literatūra, vakarietiškose dietose omega-6 ir omega-3 santykis padidėjęs iki 20:1, todėl norint išvengti neigiamo poveikio organizmui svarbu padidinti būtent omega-3 RR kiekį. Islandiškuose Nr.3 ir norvegiškuose Nr.4 žuvų taukuose nustatyta didesnė omega-3 riebalų rūgščių koncentracija, tačiau jie priskiriami tinkamiems, nes didesnis omega-3 RR kiekis neturi neigiamo poveikio organizmui, ir dėl esamo omega-3 RR trūkumo mityboje yra rekomenduojama suvartoti didesnį jų kiekį.
3.2.7 Nesočiųjų riebalų rūgščių (DHR ir EPR) reglamentuojamo ant pakuotės
kiekio palyginimas su tyrime gautais duomenimis
Visuose tirtuose žuvų taukuose ant pakuotės buvo nurodytas reglamentuojamas nepakeičiamųjų riebalų rūgščių: EPR ir DHR kiekis, išskyrus islandiškus Nr. 5 žuvų taukus. Gauti rezultatai nurodyti 6 lentelėje.
6 lentelė. DHR ir EPR reglamentuojamo kiekio palyginimas su eksperimentiškai gautais rezultatais.
Žuvų Taukai
DHR ir EPR reglamentuojamas kiekis ant pakuotės
(mg) Ekspermentiškai nustatytas EPR ir DHR kiekis (mg) EPR ir DHR procentinis palyginimas (%) Norvegiški Nr. 1 1229 129,64 10.55 Lietuviški Nr. 2 300 11,919 3.97 Islandiški Nr. 3 473 110,285 23,32 Norvegiški Nr. 4 275 71,45 25.98 Islandiški Nr. 5 * * *
Remiantis gautais tyrimo duomenimis didžiausias nustatytas kiekis EPR ir DHR, lyginant su ant pakuotės nurodytu kiekiu, buvo norvegiškuose Nr.4 žuvų taukuose (71,45 mg, 25,98%), mažiau nustatyta islandiškuose Nr.3 (110,285mg, 23,32%). Mažesni kiekiai, lyginant su pakuotėje nurodytu kiekiu, aptikti norvegiškuose Nr.1 žuvų taukuose (129,64mg, 10.5%), bei lietuviškuose Nr. 2 žuvų taukuose (11,919mg, 3.97%). Gauti rezultatai buvo statistiškai reikšmingi p<0,05.
Atlikus duomenų analizę galima teigti, kad visų tirtų žuvų taukų kiekiai neatitinka pakuotėsė nurodytų reglamentuojamų kiekių, tačiau gauti duomenys yra orientaciniai norint įvertinti žuvų taukų kokybę. Remiantis rezultatais labiausiai reglamentuojamą kiekį atitiko norvegiški Nr.4, mažiausiai atitiko lietuviški Nr.2. Gautų duomenų kokybiniams bei kiekybiniams nuokrypiams galėjo turėti įtakos šie faktoriai: gamintojo laikymo sąlygos, naudota žaliava, gamybos technologija, transportavimo sąlygos ir t.t. Norint tiksliau įvertinti bei palyginti žuvų taukų preparatų eksperimentinius kiekius su ant pakuotėse nurodytu reglamentuojamu kiekiu, reiktų papildomai ištirti kelias skirtingas serijas ir tyrimus atlikti skirtingose laboratorijose, naudojant skirtingus reagentus, katalizatorius ir sąlygas.
3.3 Mononesočiųjų riebalų rūgščių kiekis skirtinguose žuvų taukuose
Šiame tyrimo etape analizuojamos mononesočiosios RR: trans-9-elaido, cis-9-oleino, eruko bei nervono. Šis tyrimo etapas apima dvi dalis. Pirmoje dalyje analizuosiu bendrą mononesočiųjų RR kiekį
skirtinguose žuvų taukuose, o antroje dalyje analizuosiu būtent oleino RR koncentracijas. Gauti tyrimo rezultatai pateikti % lyginant su BRRK 16 paveiksle.
16 pav. Mononesočiųjų riebalų rūgščių koncentracija % lyginant su BRRK
Remiantis gautais rezultatais galima teigti, jog didžiausia mononesočiųjų RR (Omega-9) koncentracija nustatyta lietuviškuose Nr.2 (94,16±0,11%) žuvų taukuose, sekančiuose žuvų taukuose nustatytos koncentracijos buvo labai panašios: islandiškuose Nr.3 (9,01±0,17%), norvegiškuose Nr.4 (8,74±0,19%). Likusiuose žuvų taukuose buvo užfiksuotos ne didesnės nei 3% koncentracijos: islandiškuose Nr.3 (2,56±0,21%), o norvegiškuose Nr.1 (1,81±0,16%). Apibendrinant galima daryti išvadą, jog visuose tiriamuosiuose žuvų taukuose yra aptikta atitinkamai nuo 1- 94,26 % omega-9 RR. Didžiausios omega-9 koncentracijos aptiktos lietuviškuose Nr.2 ir islandiškuose Nr.3 žuvų taukuose.
Antroje tyrimo dalyje analizavau būtent svarbiausios omega-9 RR – oleino rūgštes kiekį. Gauti tyrimo rezultatai pateikti % lyginant su BRRK 5 lentelėje.
5 lentelė. Oleino rūgšties koncentracijos % lyginant su BRRK Tiriamieji žuvų taukai Oleino rūgštis
Norvegiški Nr.1 - Lietuviški Nr.2 - Islandiški Nr.3 - Norvegiški Nr.4 - Islandiški Nr.5 95,37 1.81 2.57 8.74 9 94.16 0 20 40 60 80 100 120 Norvegiški Nr.1 Islandiški Nr.3 Norvegiški Nr.4 Islandiški Nr.5 Lietuviški Nr.2 Koncentracija, %
Oleino rūgštis buvo aptikta tik vienos rūšies papilduose - islandiškuose Nr.5. Šios riebalų rūgšties koncentracija siekė (95,37±2,4%), kituose žuvų taukuose oleino rūgšties nebuvo nustatyta.
Didelis kiekis oleino rūgšties turi stiprų priešuždegiminį ir antitrombozinį poveikį [40], kadangi mažina trombocitų agregaciją, bei pasižymi antiaterogeniniu poveikiu, nes mažina mažo tankio lipoproteinų kocentraciją ir didina didelio tankio lipoproteinų kocentraciją [12]. Apibendrinant tyrimo rezultatus, bendras mononesočiųjų RR kiekis neatspindi oleino rūgšties kiekio, todėl svarbus atskiras oleino RR įvertinimas. Remiantis gautais rezultatais vieninteliai žuvų taukai galintys praturtinti mitybą oleino rūgštimi – islandiški Nr.5.
