FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
VAIVA ILJEITAITĖ
OMEGA-3, OMEGA-6 IR OMEGA-9 RIEBALŲ RŪGŠČIŲ KOKYBINIS NUSTATYMAS IR SANTYKIO PALYGINIMAS KRAUJO RIEBALUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. Dr. Vidmantas Dirsė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof.dr. Vitalis Briedis
OMEGA-3, OMEGA-6 IR OMEGA-9 RIEBALŲ RŪGŠČIŲ KOKYBINIS NUSTATYMAS IR SANTYKIO PALYGINIMAS KRAUJO RIEBALUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. Dr. Vidmantas Dirsė
Recenzentas: Darbą atliko: Magistrantė
Vaiva Iljeitaitė
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1. Riebalų klasifikacija ir svarba ţmogaus organizmui ... 11
1.2. Riebalų rūgštys ... 13
1.2.1. Sočiosios riebalų rūgštys ... 14
1.2.2. Nesočiosios riebalų rūgštys ... 14
1.3. Nesočiųjų riebalų rūgščių įtaka ţmogui ... 16
1.3.1. Nesočiųjų riebalų rūgščių metabolizmas ... 17
1.4. Riebalų rūgščių šaltiniai ... 19
1.5. Nesočiųjų riebalų rūgščių santykis ... 20
1.6. Dujų chromatografijos pritaikymas siekiant nustatyti riebalų rūgščių santykį ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1. Tyrimo organizavimas ... 24
2.2. Tyrimo objektas ... 24
2.3. Tyrimo medţiagos ir prietaisai ... 25
2.4. Eksperimentinio tyrimo eiga ... 25
2.5. Eksperimentinio tyrimo metodai ... 25
2.6. Duomenų analizės metodai ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Riebalų rūgščių kokybinės sudėties nustatymas kraujo riebaluose dujų chromatografijos metodu ... 29
3.2. Riebalų rūgščių kiekio palyginimas kraujo riebaluose, remiantis chromatogramose uţfiksuotais RR smailių plotais ... 38
3.3. Riebalų rūgščių kiekinis palyginimas tarp skirtingų kraujo mėginių ... 41
4. IŠVADOS ... 43
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 44
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45
SANTRAUKA
OMEGA-3, OMEGA-6 IR OMEGA-9 RIEBALŲ RŪGŠČIŲ KOKYBINIS
NUSTATYMAS IR SANTYKIO PALYGINIMAS KRAUJO RIEBALUOSE
V. Iljeitaitės magistro baigiamasis darbas / mokslinis vadovas doc. dr. V. Dirsė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas: nustatyti omega-3, omega-6 ir omega-9 riebalų rūgštis bei palyginti jų santykį kraujo riebaluose.
Uţdaviniai: 1. Išanalizuoti šiuolaikinės instrumentinės analizės metodikas, naudojamas riebalų rūgščių santykio nustatymui ir palyginimui kraujo riebaluose. 2. Nustatyti riebalų rūgščių kokybinę sudėtį kraujo riebaluose. 3. Palyginti riebalų rūgščių santykį kraujo riebaluose.
Metodai: Tyrimo objektas – 23-ejų, 29-erių, 30-ties ir 56-erių metų amţiaus ţmonių, skirtingu dienų intervalu, surinkti septyni skirtingi kraujo mėginiai. Paruošti mėginiai ištirti dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu.
Rezultatai: Atlikus tyrimą nustatyta, jog tirtuose kraujo mėginiuose omega-3 polinesočiųjų riebalų rūgščių nėra. Aptikta viena omega-6 grupei priklausanti linolo polinesočioji riebalų rūgštis. Visuose kraujo mėginiuose identifikuota mononesočioji, omega-9 grupei priklausanti oleino rūgštis. Išanalizavus ir atlikus chromatogramose pateiktų smailių plotų dydţių palyginimą, nustatyta, jog kraujo mėginiuose dominuoja sočiosios riebalų rūgštys iš kurių daugiausia yra palmitino rūgšties.
Išvados: 1. Riebalų rūgštys, esančios kraujo riebaluose, buvo identifikuotos dujų chromatografijos metodu, naudojant masių spektrometrijos detektorių. Kiekinis riebalų rūgščių palyginimas kraujo riebaluose atliktas atsiţvelgiant į chromatogramose uţfiksuotus smailių plotų dydţius. 2. Tirtuose kraujo mėginiuose neidentifikuota nė viena omega-3 grupei priklausanti riebalų rūgštis. Omega-6 grupei priklausanti linolo rūgštis, identifikuota tik dviejų ţmonių kraujo mėginiuose, tačiau labai maţais kiekiais. Dėl šios prieţasties, santykio nustatyti tarp polinesočiųjų riebalų rūgščių negalima. 3. Atlikus RR kiekinį palyginimą atsiţvelgiant į chromatogramose uţfiksuotus smailių dydţių plotus, nustatyta, jog tirtuose kraujo mėginiuose dominuoja sočioji palmitino ir mononesočioji oleino riebalų rūgštis. Santykis tarp mononesočiųjų omega-9 ir sočiųjų riebalų rūgščių kraujo riebaluose yra ~ 1:2,5.
SUMMARY
FATTY ACIDS OMEGA-3, OMEGA-6 AND OMEGA-9 QUALITATIVE
DETERMINATION AND RATIO COMPARISON OF BLOOD FATS
Master thesis of V. Iljeitaitė / scientific supervisor: doc. Dr. V. Dirsė; Lithuanian university of health sciences, Faculty of pharmacy, Department of analytical and toxicological chemistry. – Kaunas.
Aim: to identify the omega-3, omega-9 and omega-9 fatty acids and compare the ratio of blood fats.
Tasks: 1. To analyze the modern instrumental analytical techniques used to identify the ratio of fatty acids and comparison of blood fat. 2. To identify the qualitative composition of fatty acids in the blood fat. 3. To compare the ratio of fatty acids of blood fat.
Methods: The object of investigation - 23 years old, 29 years old, 30 years old and 56 years old adult‘s, at different days apart, collected seven different blood samples. Prepared samples were investigated by the gas chromatography - mass spectrometry method.
Results: The investigation has shown that in the blood samples of omega-3 polyunsaturated fatty acids are absent. Detected only one omega-6 polyunsaturated linoleic fatty acid. At all blood samples was identified oleic acid of monounsaturated omega-9 group. After analysis and comparison of peaks areas sizes of chromatograms, was found that in the blood samples is dominating saturated fatty acids, most of which are palmitic acid.
Conclusions: 1. Fatty acids contained in blood fats were identified by gas chromatography using a mass spectrometry detector, further taking account into the retention time. Quantitative comparison of fatty acids in the blood fats made in view from the chromatograms recorded peaks areas values. 2. At the blood samples has been identified, no fatty acids belonging to the group of omega-3. Linoleic acid, belonging to the group of omega-6, identified only in two people's blood samples, but in very small quantities. Because of this, the ratio between two groups omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids is not available. 3. The quantitative comparison of fatty acids in view of the peaks areas sizes of chromatograms, was founded that in the tested blood samples is dominating saturated palmitic and monounsaturated oleic fatty acids. The ratio of monounsaturated omega-9 and saturated fatty acids in blood fats is ~ 1: 2.5.
PADĖKA
Uţ pagalbą, rengiant magistro baigiamąjį darbą, dėkoju darbo vadovui doc. Dr. Vidmantui Dirsei. Uţ patarimus ir pagalbą dirbant analitinėje laboratorijoje esu dėkinga Mindaugui Marksai. Taip pat, dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui, profesoriui Liudui Ivanauskui uţ pamokymus ir konsultacijas ruošiant magistro baigiamąjį darbą.
SANTRUMPOS
AR – Arachidono rūgštis
DHR – Dokozaheksaeno rūgštis DPR – Dokozapentaeno rūgštis DTL – Didelio tankio lipoproteinai EPR – Eikozapentaeno rūgštis LR – Linoleno rūgštis
MTL – Maţo tankio lipoproteinai PSO – Pasaulio sveikatos organizacija RR – Riebalų rūgštys
ĮVADAS
Daug metų yra viešai kalbama ir akcentuojama, jog kiekvieno ţmogaus sveikata didţiąja dalimi priklauso nuo gyvenimo būdo bei sveikos mitybos ypatumų. Deja, atliekami įvairūs tyrimai, kas kartą atskleidţia, jog ţmonės ne itin linkę rūpintis savo sveikata, o tai parodo vis didėjantis, lėtinėmis neinfekcinėmis ligomis sergančių ţmonių skaičius. Pasaulio sveikatos organizacija (PSO), mokslininkai, gydytojai, vaistininkai bei kiti sveikatos prieţiūros specialistai skatina ţmones imtis atitinkamų priemonių, kad situacija pasaulyje gerėtų. Vienas iš būdų, galintis prisidėti prie savijautos gerinimo – tinkamas riebalų rūgščių santykio uţtikrinimas organizme.
Kaip ţinia, riebalai yra vienas pagrindinių energijos šaltinių, kuris, lyginant su kitomis medţiagomis, turi didţiausią energetinę vertę. Kartu su riebalais, ţmogaus organizmas gauna sočiųjų, mononesočiųjų ir polinesočiųjų riebalų rūgščių. Polinesočiosios riebalų rūgštys dar yra vadinamos nepakeičiamosiomis riebalų rūgštimis, kadangi organizmas pats savaime jų nesintetina. Dėl šios prieţasties, būtent omega-3 ir omega-6 grupių rūgštis privaloma gauti iš aplinkos su maisto produktais ar maisto papildais. Mononesočiosios omega-9 grupei priklausančios riebalų rūgštys yra didesniu santykiu paplitusios įvairiuose maisto produktuose, todėl ir ţmonių organizme jų daţniausiai aptinkami kiek didesni kiekiai, lyginant su omega-3 ar omega-6 grupėmis. Svarbu ţinoti, jog teigiamą įtaką organizmui daro ne pavienės gaunamos riebalų rūgštys, o visas jų kompleksas, subalansuotas tinkamu santykiu.
Riebalų rūgščių nauda ir ţala pasaulyje jau daug metų plačiai analizuojama. Yra pagrįstai moksliškai nustatyta, kad riebalų rūgštys, ypatingai nesočiosios, teigiamai veikia nervų sistemos veiklą, skatina odos audinių regeneraciją, stiprina imunitetą, padeda apsisaugoti nuo išorės veiksnių, maţina tikimybę susirgti onkologinėmis ligomis. Riebalų rūgštys dalyvauja beveik visuose ţmogaus fiziologiniuose procesuose.
Atliekant tyrimą, naudojamas dujų chromatografijos metodas, su masių spektrometrijos detektoriumi, kurio dėka, selektyviai, greitai ir tiksliai atliekama analizė, siekiant nustatyti kokios riebalų rūgštys dominuoja kraujyje ir kokiu santykiu jos yra pasiskirsčiusios. Tyrimo objektas – Lietuvoje gyvenančių, atsitiktine tvarka parinktų, įvairaus amţiaus ţmonių kraujo mėginiai. Tyrimo praktinė reikšmė – išsiaiškinus kokiu santykiu dominuoja riebalų rūgštys ţmonių kraujyje ir įvertinus, galimai santykį įtakojusius faktorius, pateikti rekomendacijas, kaip gautus rezultatus koreguoti. Deja, atliktas tyrimas parodė, jog santykis tarp polinesočiųjų omega-3 ir omega-6 riebalų rūgščių negali būti nustatytas dėl to, jog kraujo mėginiuose nebuvo identifikuota nė viena, omega-3 grupei priklausanti rūgštis, tačiau nustatyta, jog visuose kraujo mėginiuose dominuoja sočiosios riebalų rūgštys, iš kurių daugiausia yra palmitino rūgšties bei mononesočiųjų riebalų rūgščių grupei priklausanti – oleino
rūgštis. Nustatytas santykis tarp mononesočiųjų omega-9 ir sočiųjų riebalų rūgščių kraujo riebaluose yra ~ 1:2,5
Magistro baigiamojo darbo tikslas – nustatyti omega-3, omega-6 ir omega-9 riebalų rūgštis bei palyginti jų santykį kraujo riebaluose.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas - nustatyti omega-3, omega-6 ir omega-9 riebalų rūgštis bei palyginti jų santykį kraujo riebaluose.
Darbo uţdaviniai:
1. Išanalizuoti šiuolaikinės instrumentinės analizės metodikas, naudojamas riebalų rūgščių santykio nustatymui ir palyginimui kraujo riebaluose.
2. Nustatyti riebalų rūgščių kokybinę sudėtį kraujo riebaluose. 3. Palyginti riebalų rūgščių santykį kraujo riebaluose.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Riebalų klasifikacija ir svarba ţmogaus organizmui
Riebalai – organinės medţiagos, įeinančios į beveik visų ţmogaus organizmo ląstelių sudėtį. Tai vienos iš pagrindinių medţiagų, kurios reikalingos organizmo energijos apykaitos procesams vykti, todėl teigiama, jog tai medţiagos, teikiančios didţiausią energetinę vertę. Nustatyta, jog skylant 1 gramui riebalų – organizme susidaro ~ 9 kcal energijos, kai tuo tarpu, skaidant angliavandenius ar baltymus, išsiskiria ~ 4 kcal energijos. Riebalai dalyvauja įvairiuose organizmo termoreguliaciniuose procesuose, padeda įsisavinti riebaluose tirpius vitaminus: A, E, D, K. Taip pat, riebalų svarbą apibrėţia tai, kad jie yra kai kurių bioaktyvių medţiagų sintezės pradininkai. [1]
Vertinant riebalų sudėtį chemiškai – tai medţiagos sudarytos iš glicerolio ir riebalų rūgščių (RR). Analizuojant fizikines savybes, visų riebalų skonis, kvapas, struktūra, energetinė vertė, maistingumo rodikliai, lydymosi temperatūra ir kiti individualūs kriterijai, priklauso tik nuo riebaluose esančių riebalų rūgščių rūšių ir sudėties, jų vietos molekulėje bei rūgščių tarpusavio santykio. [1;3] Riebalų kiekis įvairiuose produktuose gali būti labai skirtingas (1 pav.). Jei maisto produktuose vyrauja sočiųjų riebalų rūgščių skaičius, tai vadinama sočiaisiais riebalais, o nesočiaisiais riebalais vadinami produktai, kuriuose dominuoja nesočiosios riebalų rūgštys. [2] Didėjant nesočiųjų riebalų rūgščių koncentracijai, tiesiogiai didėja ir riebalų nesotumo laipsnis. To pasekoje, didėja tikimybė riebalams sugesti, nes atsiranda palankios sąlygos vykti oksidacijai ir kitiems biocheminiams procesams. Analogiškai vertinant, riebalai, kuriuose dominuoja sočiosios riebalų rūgštys, yra atsparesni ir oksiduojasi gerokai lėčiau. Šiam procesui pagrindinę įtaką daro riebalų rūgščių kiekis, grandinės ilgis ir pačių rūgščių nesotumo laipsnis. [3]
Bendrai, visa riebalų, kaip organinių junginių grupė, atsiţvelgiant į cheminę sandarą, poveikį ţmogaus organizmui bei kitus rodiklius, yra skirstoma į tris pagrindines grupes (2 pav.): transformuotus riebalus, sočiuosius riebalus ir nesočiuosius riebalus. Transformuoti riebalai – savo chemine struktūra yra pakitę riebalai. Daţniausiai tokios junginių formos susidaro pramonėje, siekiant sukietinti riebalus. Pastarieji, labai daţnai naudojami maisto pramonėje, konditerijoje, pusgaminiuose ir įvairiuose gatavuose maisto produktuose. Vertinant šios grupės riebalų poveikį ţmogaus organizmui – tai vieni pavojingiausių riebalų. Transformuoti riebalai, anot mokslininkų išvadų, skatina širdies ir kraujagyslių sistemos ligų atsiradimą, neigiamai veikia maţo tankio lipoproteinų (MTL) ir didelio tankio lipoproteinų (DTL) santykį, skatina kraujagyslių uţkalkėjimo procesus, didina kraujo klampumą bei daro neigiamą įtaką kraujagyslių elastingumui. [6;11]
Sotieji riebalai – taip pat uţima ne maţą dalį kiekvieno ţmogaus maisto racione (1 pav.). Daţniausiai, tai gyvulinės kilmės riebalai, kurių gausu paukštienoje, mėsoje, pieno produktuose ir kitur. Vertinant sočiųjų RR įtaką, daromą ţmonių sveikatai, gydytojai ir kiti sveikatos prieţiūros
specialistai pataria vengti produktų, kuriuose gausu sočiųjų RR. Yra įrodyta, jog būtent sotieji riebalai didina riziką susirgti II tipo cukriniu diabetu, didina kraujagyslių uţakimo riziką, skatina širdies ir kraujagyslių sistemos ligų vystymąsi. [7]
1 pav. Riebalų rūgščių kiekis gramais, 100-ame gramų augalinių aliejų
Nesotieji riebalai, gyvulinės kilmės maisto produktuose, sutinkami dvigubai rečiau, lyginant su sočiaisiais. Nesočiųjų RR kur kas daugiau aptinkama augalinės kilmės maisto produktuose (pav. 1), tačiau jie pasiskirstę santykinai maţais kiekiais. Kadangi, didţioji dalis šių riebalų yra nepakeičiamieji, labai svarbu uţtikrinti nuolatinį nesočiųjų RR patekimą į organizmą ir optimalų santykį jame. Nesotieji riebalai daţniausiai yra augalinės kilmės, bet nemaţi jų santykiai dominuoja ir gyvulinės kilmės produktuose, pavyzdţiui, ţuvų taukuose. Jie būtini vitaminų pasisavinimui ir apsaugai nuo oksidacinės paţaidos. Taip pat, ţmonės, kurie suvartoja didesnį kiekį nesočiųjų riebalų – linkę rečiau sirgti vėţinėmis bei širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis. [41]
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Sočiosios RR Mononesočiosios RR Polinesočiosios RR R ie b al ų r ū gšči ų k ie ki s g/10 0g
2 pav. Riebalų klasifikacija
Apţvelgus statistinius duomenis ir įvertinus Lietuvos gyventojų maitinimosi principus bei mitybos ypatumus, galima teigti, jog esame viena iš daugelio tautų, kurios gyventojai daugiausiai suvartoja maisto produktų, kuriuose gausu riebalų, ypač sočiųjų riebalų rūgščių. [10; 32]. Svarbus pastebėjimas yra tai, jog tiek Lietuvoje, tiek daugelyje kitų pasaulio šalių, ligų skaičius, kurį galimai įtakoja ir didina sočiųjų riebalų kiekis organizme, didėja. Kad to išvengti, reikėtų atidţiau priţiūrėti mitybos racioną, vartoti daugiau augalinės, ir maţinti gyvulinės kilmės maisto produktų suvartojimą.
1.2. Riebalų rūgštys
Riebalų rūgštys įgavo tokį pavadinimą todėl, jog pirmiausia jos buvo išskirtos iš riebalų. Vertinant chemiškai – tai linijinės formos, be būdingų atšakų karboksi rūgštys, turinčios būdingą alifatinę grandinę (pav. 3). Būtent pastaroji ir apsprendţia rūgščių sotumo parametrus ir nesotumo laipsnį. Riebalų rūgštyse esantis anglies atomų grandinės skaičius, beveik visada yra lyginis.
3 pav. Bendra riebalų rūgščių formulė [44]
Riebalų klasifikacija Sotieji riebalai Sočiosios riebalų rūgštys Nesotieji riebalai Mononesotieji riebalai Omega-9 riebalų rūgštys Polinesotieji riebalai Omega-6 riebalų rūgštys Omega-3 riebalų rūgštys Transformuoti riebalai
Atsiţvelgiant į sotumo laipsnį, riebalų rūgštys klasifikuojamos į dvi pagrindines grupes: sočiosios riebalų rūgštys (4 pav.) ir nesočiosios riebalų rūgštys (5 pav.). Pastarosios atitinkamai dar yra klasifikuojamos į mononesočiąsias ir polinesočiąsias riebalų rūgštis.
1.2.1. Sočiosios riebalų rūgštys
Vetinant chemiškai, sočiosios RR savo struktūroje neturi dvigubųjų ryšių, kadangi kiekvienas anglies atomas grandinėje yra maksimaliai prisijungęs vandenilio atomų skaičių. Šios rūšies RR yra tiesios grandinės struktūros, todėl RR yra glaudţiai tarpusavy susijungusios ir susiglaudusios viena su kita. Atsiţvelgiant į tai, nustatyta, jog būtent ši RR savybė suteikia kietos konsistencijos išlaikymą sotiesiems riebalams net ir kambario temperatūroje.
4 pav. Sočioji (palmitino) riebalų rūgštis [54]
Sočiosios RR beveik visada turi lyginį anglies atomų skaičių grandinėje, kuris gali varijuoti nuo 12 iki 18 anglies atomų. Iš daugybės sočiųjų riebalų rūgščių, labiausiai paplitusi ir didţiausiais kiekiais aptinkama yra palmitino (C16H32O2) ir stearino (C18H36O2) riebalų rūgštys. [43]
1.2.2. Nesočiosios riebalų rūgštys
Nesočiųjų riebalų rūgščių anglies atomų gradinėje, kai kurie anglies atomai neturi šalia vandenilio, todėl yra tarpusavyje susijungę dvigubaisiais ryšiais (π) (5 pav.). Jei pastarųjų grandinėje yra didesnis skaičius, dvigubos jungtys vienos nuo kitų yra atskirtos metileno grupe, todėl tokios jungtys negali būti konjuguotos. Dvigubųjų jungčių nesočiosiose riebalų rūgštyse gali būti suskaičiuojama nuo vienos iki kelių ar net keliolikos. [8]
5 pav. Nesočioji (oleino) riebalų rūgštis [54]
Kadangi nesočiosiose riebalų rūgštyse dominuoja dvigubieji ryšiai, atitinkamai pačių rūgščių struktūra yra lenktos formos. Šios rūšies RR visada būdinga cis formos konfigūracija. [8;16] Įrodyta, jog šios rūšies rūgštys, chemiškai vertinant, negali tampriai tarpusavyje susiglausti, todėl daţniausiai jos būna skystos konsistencijos. Akivaizdu, jog didţiojoje dalyje aliejų dominuoja nesočiosios riebalų rūgštys.
1.2.2.1. Mononesočiosios riebalų rūgštys
Mononesočiųjų RR grupei priskiriamos rūgštys, kurios anglies atomų grandinėje turi vieną dvigubąją jungtį. Analizuojant ir atsiţvelgiant į cheminę šių rūgščių sandarą bei struktūrą, nustatyta, jog kambario temperatūroje mononesočiosios RR išlaiko skystą konsistenciją. Mononesočiųjų RR grupei priskiriamos omega-9 RR, iš kurių labiausiai paplitusi yra oleino (C18H34O2) rūgštis. Priešingai
nei omega-3 ir omega-6 polinesočiosios (nepakeičiamosios) RR, omega-9 yra dalinai sintetinamos ţmogaus organizme iš neprisotintų riebalų, tačiau rekomenduojama, kad būtų papildomai gaunamos iš aplinkos su maistu ar maisto papildais. [45]
1.2.2.2. Polinesočiosios riebalų rūgštys
Polinesočiosioms riebalų rūgštims būdingos dvi ar daugiau dvigubos jungtys cheminėje struktūroje. Įprastinėmis fizinėmis sąlygomis, polinesočiųjų riebalų rūgščių sudėtyje turintys produktai yra skystos konsistencijos ir tokį stabilumą išlaiko šaldomi. Šiai RR grupei priskiriamos tokios rūgštys, kaip: linolo (C18:2), arachidono (AR) (C20:4), eikozapentaeno (EPR) (C20:5), dokozaheksaeno (DHR) (C22:6) (6 pav.) ir t.t.. Omega – 3 ir omega – 6 dvi pagrindinės grupės, savo sudėtyje turinčios nemaţą kiekį polinesočiųjų riebalų rūgščių. Skaičiai (n-3 ir n-6) nurodo, prie kurio anglies atomo yra pirmoji dviguba jungtis. Anglies atomai pradedami skaičiuoti nuo metilo grupės. [46]
6 pav. Polinesočioji (dokozaheksaeno) riebalų rūgštis [54]
Omega – 3 ir omega – 6 RR dar vadinamos „nepakeičiamosiomis riebalų rūgštimis―. Toks terminas nusistovėjo, kuomet buvo išsiaiškinta, jog šių rūšių RR ţmogaus organizmas pats nesintetina, o sunaudoja tiek, kiek gauna iš aplinkos. Šios riebalų rūgštys yra būtinos kiekvieno ţmogaus organizmui, nes turi didelę reikšmę fiziologinių procesų raidoje. [11;14;15]
1.3. Nesočiųjų riebalų rūgščių įtaka ţmogui
Kadangi, polinesočųjų riebalų rūgščių organizmas nesintetina – svarbu uţtikrinti nuolatinį tinkamą šių medţiagų patekimą į ţmogaus organizmą su maistu ar maisto papildais. Yra moksliškai įrodyta, jog polinesočiosios riebalų rūgštys turi teigiamą įtaką medţiagų apykaitai (ląsteliniame lygmenyje), taip pat, teigiamai veikia įvairius reguliacinius procesus vykstančius ląstelėse. [25] Jos yra būtinos kaip komponentinės medţiagos neuronuose, todėl turi teigiamos įtakos vystantis ţmogaus emocinei ir intelektinei brandai. [26;31] Polinesočiosios riebalų rūgštys taip pat dalyvauja reguliuojant cholesterolio kiekį ţmogaus organizme. Šis poveikis aiškinamas tuo, jog į organizmą patekusios polinesočiosios riebalų rūgštys virsta eikozanoidais – biologiškai aktyviomis medţiagomis, kurios ir apsprendţia tokį poveikį. [17;20;22] Tuo pačiu principu vyksta ir uţdegiminių procesų maţėjimas organizme. Be šių funkcijų, polinesočiosios riebalų rūgštys yra svarbios tuo, jog daro teigiamą įtaką smegenų darbui, aktyvumui bei smegenų membranų funkcijoms. [25;31] Didina organizmo atsparumą išoriniams veiksniams, turi teigiamos įtakos odos funkcionavimui bei odos sluoksnių regeneracijai. [11] Bene daugiausiai tyrimų yra atlikta stebint ir siekiant nustatyti, kaip polinesočiosios riebalų rūgštys įtakoja širdies ir kraujagyslių sistemos veiklą. Po ilgų mokslinių tyrimų – pasauliniu mastu pripaţinta, jog polinesočiosios riebalų rūgštys padeda reguliuoti ir normalizuoti kraujospūdį (ypatingai, senyvo amţiaus ţmonių tarpe), maţina trombocitų agregaciją, kas turi teigiamos įtakos kraujo klampumui bei krešumui. [41;25]
Kiek maţiau akcentuojama, bet ne maţiau svarbi polinesočiųjų riebalų rūgščių svarbos ir pritaikymo sritis – pediatrija. Pripaţinta, kad tiek omega-3, tiek omega-6 yra vienodai svarbios visuose vaikų raidos ir vystymosi etapuose. [15;18;19] Polinesočiosios RR ypatingai svarbios dar tuomet, kai tik pradeda vystytis vaisiaus nervų sistema, taip pat šios medţiagos turi teigiamą įtaką kūdikio
smegenų formavimuisi ir normaliam funkcionavimui. [26] Mokslininkai yra nustatę, jog neišnešioti ir maţo svorio kūdikiai daţniau gimsta tuomet, kai motinos organizme yra maţa polinesočiųjų RR koncentracija. Būtent šios medţiagos padeda palaikyti normalų būsimos mamos kraujospūdį, ko pasekoje, vaisius yra geriau aprūpinamas krauju ir dėl to daţniausiai išvengiama priešlaikinio gimdymo rizikos. [18;19]
Mononesočiųjų RR omega-9 poveikis ţmogaus organizmui, kolkas yra maţiausiai ištirtas. Atliktų mokslinių tyrimų metu nustatyta, jog omega-9 RR neturi įtakos cholesterolio kiekio kraujyje reguliavimui, tačiau padeda apsisaugoti nuo cholesterino nusėdimo ant kraujagyslių sienelių. Dėl šios prieţasties, maţėja rizika susirgti ateroskleroze, įvairaus pobūdţio trombozėmis bei kitomis širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis. [47;48] Moksliškai įrodyta, jog viena iš labiausiai paplitusių omega-9 grupei priklausančių RR – oleino rūgštis, turi teigiamos įtakos onkologinių susirgimų prevencijoje. Nustatyta, jog būtent oleino rūgštis, turį teigiamos įtakos stabdant vėţinių ląstelių dauginimąsi bei blokuojant vieną iš aktyvių krūties vėţio genų. [48;49]
Omega-9 RR trūkumas organizme gali pasireikšti įvairiomis formomis. Daugeliu atvejų jaučiamas silpnumas, nuovargis, supratėjusi atmintis, nusilpęs imunitetas. Plaukų slinkimas, sutrikęs virškinimas, išsausėjusi oda, burnos, akių ir makšties gleivinės sausėjimas – taip pat vieni iš simptomų, įspėjančių apie mononesočiųjų RR trūkumą organizme.
1.3.1. Nesočiųjų riebalų rūgščių metabolizmas
Daugelyje maisto papildų, įskaitant ir ţuvų taukus, omega rūgštys yra pateikiamos trigliceridų forma. Pastarieji junginiai yra atsparūs vandeniui ir jame netirpsta, dėl to omega rūgščių pasisavinimas uţtrunka kiek ilgiau, o kai kuriais atvejais, reikalingos RR nusėda virškinamąjame trakte.
Riebalų rūgštys patekusios į organizmą trigliceridų forma yra absorbuojamos plonojoje ţarnoje iš kurios patenka į kraują ir transportuojamos į įvairius kūno audinius bei organus, tame tarpe į smegenis, tinklainę bei širdį. Vykstant metabolizmui, (pav. 7) RR veikiamos kofermento Acil-CoA, β-oksidacijos proceso metu, išskiria energiją ATP (adenozintrifosfto) (C10H16N5O13P3) forma, kuri yra naudojama įvairiems procesas organizme vykti. Vykstant esterifikacijos procesui, RR skyla į fosfolipidus ir cholesterolio esterius bei išlieka nepakitusios trigliceridų forma. Susidarę cholesterolio esteriai ir trigliceridai, fermentinės hidrolizės proceso metu skyla, išlaisvindami RR, kurios toliau dalyvauja metabolizmo procese. Metabolizmo metu susidarę fosfolipidai yra reikšmingi formuojantis biologinių membranų struktūros vientisumui. [53]
7 pav. Riebalų rūgščių metabolizmas
Polinesočiosios riebalų rūgštys gali būti gaunamos iš mitybos šaltinių, nes ţmogaus organizmo fermentinė sistema, negali šių rūgščių pati pasigaminti. Iš omega-3 ir omega-6 polinesočiųjų RR organizme sintetinami eikozanoidai. Tai biologiškai aktyvios medţiagos, kurioms priskiriami prostaglandinai, tromboksanai ir leukotrienai. Visos šios medţiagos turi panašų poveikį kaip hormonai. Eikozanoidai atlieka svarbias funkcijas, dalyvaudami uţdegiminėse organizmo reakcijose. Eikozanoidai organizme egzituoja labai trumpą laiką, todėl svarbu yra uţtikrinti nuolatinį RR metabolizmą, jog sintetintųsi ir eikozanoidai, kadangi jų trūkumas organizme itin greitai pasireiškia. [53]
Vykstant RR metabolizmui (pav.8), išsotinimo ir elongacijos procesų metu, linolo rūgštis metabolizuojama iki arachidono rūgšties (omega-6 RR grupė), o α-linoleno rūgštis metabolizuojama iki ilgos grandinės produktų – EPR ir DHR riebalų rūgščių (omega-3 RR grupė). Linolo rūgštis organizme paplitusi kaip ląstelių ir audinių membranų sudedamoji dalis. α-linoleno rūgštis organizme aptinkama itin maţais kiekiais nes neturi polinkio kauptis, o pagrinde naudojama β-oksidacijos procesui vykti. Ţmogaus organizme α-linoleno rūgštis gali būti išsotinama ir prailginama iki eikozapentaeno (EPR) ir dokozaheksaeno (DHR) RR rūgščių, bet tik tada, kai omega-6 ir omega-3 santykis yra maţas. Daroma prielaida, jog atliekant RR rūgščių analizę, ţmogaus organizme įmanoma aptikti gana nemaţą įvairovę riebalų rūgščių, net ir egzituojančių itin maţais kiekiais. [53]
8 pav. Polinesočiųjų RR omega-6 ir omega-3 metabolizmo etapai
Maisto papildų rinkoje, konkurenciją ţuvų taukams kelia krilių aliejus. Pastarasis yra RR, ypatingai omega-3, jūrinės kilmės šaltinis. Omega riebalų rūgštys krilių aliejuje yra pateikiamos fosfolipidų forma, o pastarieji vertinami kaip ląstelių membranų struktūrinis pagrindas. Daroma prielaida, jog fosfolipidų forma pateiktos RR yra greičiau ir efektyviau įsisavinamos organizme, lyginant su trigliceridų formos RR. Toks skirtumas grindţiamas metabolizmo eigos principais bei atsiţvelgiant į vykstančių reakcijų visumą.
1.4. Riebalų rūgščių šaltiniai
Gydytojų, vaistininkų bei kitų sveikatos prieţiūros specialistų nuomone, kasmet ţmonių, sergančių įvairiomis lėtinėmis, širdies ir kraujagyslių sistemos, nervų sistemos ir kitomis ligomis, skaičius didėja. Taip pat pastebėta, kad besiskundţiančiųjų įvairiais negalavimais ir trumpalaikiais sveikatos sutrikimais pacientų amţius jaunėja. [27;29;31]
Mononesočiosios RR organizme yra sintetinamos, tačiau nedideliais kiekiais, todėl rekomenduojama papildomai jų gauti iš aplinkos. Polinesočiosios riebalų rūgštys, į ţmogaus organizmą patenka su maistu arba maisto papildais. Siekiant organizme palaikyti kuo optimalesnį RR balansą – ypatingai svarbu vartoti kuo įvairesnius maisto produktus. Vertinant omega-3 RR šaltinius, kiekvienas ţmogus į
savo mitybos racioną turėtų įtraukti riebią ţuvį (daugiausia polinesočiųjų riebalų rūgščių aptinkama lašišose, skumbrėse, sardinėse, silkėse), ţuvų taukus, riešutus (daugiausia polinesočiųjų riebalų rūgščių aptinkama anakardţių, migdolų, graikiniuose bei karijų riešutuose), ţalias lapines darţoves, moliūgų sėklas, rapsų, kanapių bei linų sėmenų aliejus, įvairius grūdus. [40] Būtent įvardytuose produktuose yra nustatyta daugiausia omega-3 riebalų rūgščių.
Vertinant RR omega-6 egzistavimą maisto produktuose, mokslininkai yra nustatę, kad daugiausia būtent šios rūšies riebalų rūgščių aptinkama kviečių gemaluose, įvairiuose riešutuose, moliūgų bei kitose sėklose, alyvuogių, sezamų, kanapių, kukurūzų, saulėgrąţų, raktaţolių bei agurklių aliejuose. [31] Nors paplitimas ganėtinai gausus, tačiau tiek polinesočiosios, tiek mononesočiosios RR rūgštys aptinkamos labai maţais kiekiais. Pagrindinė išeitis šiuo atveju – papildyti mitybą maisto papildais, kuriuose gausu polinesočiųjų omega-3, omega-6 ir mononesočiųjų omega-9 riebalų rūgščių.
Vaistinėse maisto papildų pasiūla, kuriuose būtų gausu polinesočiųjų riebalų rūgščių, tikrai didelė. Kiekvienas vartotojas, įvertinęs savo asmeninius poreikius gali išsirinkti sau tinkamiausią variantą - pradedant maisto papildo farmacine forma (daţniausiai vaistinėse yra parduodami ţuvų taukai tiek skysta, tiek kapsuliuota forma), baigiant maisto papildo chemine sudėtimi bei RR kiekiu ir santykiu jame. Jei pacientui pačiam sunku įvertinti savo mitybos įpročius bei nustatyti galimą RR poreikį organizmui, taip pat išsiaiškinti vartojimo bei dozavimo principus – visada šiuo klausimu gali kreiptis į gydytoją ar vaistininką.
1.5. Nesočiųjų riebalų rūgščių santykis
Kiekvieno ţmogaus organizmui itin svarbu, ne tik gauti reikiamą kiekį nesočiųjų riebalų rūgščių, bet ir palaikyti tinkamą omega-3, omega-6 bei omega-9 RR santykį. Net ir sveikai maitinantis bei gaunant pakankamą kiekį omega-3 rūgščių, svarbu nepamiršti, jog teigiamą įtaką gerai savijautai lemia būtent omega-3 ir omega-6 balansas organizme. [40;41]
Remiantis PSO bei kitų šaltinių duomenimis, įprastai ţmonės suvartoja netinkamą kiekį RR ir iškreipia jų santykį organizme. Vertinant sočiųjų riebalų rūgščių suvartojimą, rekomenduojama, jog pastarosios neviršytų 8-10% visų per parą suvartojamų riebalų rūgščių kiekio. Omega-9 RR rekomenduojama gauti papildomai iš aplinkos, netik naudojant organizme pagamintus ir esančius atsargų resursus.
Atsiţvelgiant į situaciją, sveikatos prieţiūros specialistai yra sunerimę dėl 3 ir omega-6 santykio. Atliekamų tyrimų metu kaskart nustatoma, jog santykio rodiklis daţnai siekia net 10:1-20:1 (didesnis kiekis omega-6 RR) ribą. [25;28;30] Nerimą kelia tai, jog abiejų šių riebalų rūgščių grupių metabolizmui reikalingi tie patys fermentai, todėl tarp jų atsiranda natūrali konkurencija – per didelis
omega-6 rūgščių kiekis trukdo organizmui įsisavinti ir tinkamai metabolizuoti omega-3 riebalų rūgštis. PSO ir sveikatos prieţiūros specialistai yra numatę optimaliausią santykį, kurio rekomenduoja laikytis, t.y. – 1 (omega-3):2 (omega-6). [41] Mokslininkų padarytos išvados suteikia prielaidą, kad maksimalus RR santykio nuokrypis yra 1:5.
1.6. Dujų chromatografijos pritaikymas siekiant nustatyti riebalų
rūgščių santykį
Pagrindinis šio darbo tikslas – nustatyti riebalų rūgščių omega-3, omega-6 ir omega-9 santykį kraujo riebaluose. Tokiam tikslui įgyvendinti ir optimaliems rezultatams pasiekti, buvo pasirinkta naudoti dujų chromatografijos metodą. Lyginant su kitais metodais – dujų chromatografija turi kelis pranašumus. Vienas jų – gebėjimas atskirti ir analizuoti junginius, kurie garuoja nesuskildami, be to, analizė pasiţymi dideliu selektyvumu, greitu atlikimu bei ypatingu tikslumu. [33]
Dujų chromatografija – metodas tinkamas analizuoti lakius organinės kilmės junginius, įvairias dujas, organinių ir neorganinių junginių mišinius, medţiagas turinčias tiek aukštas, tiek ţemas virimo temperatūras, daugiakomponenčius įvairios kilmės mišinius. [33] Paties metodo pagrindinis veikimo principas – išsklaidyti bandinį į smulkesnius, atskirus komponentus ir juos išanalizuoti. Esminis šio metodo skirtumas lyginant su kitais yra tas, jog analizės metu kaip eliuentas yra naudojamos dujos ir taikomas temperatūrinis gradientas. [33] Dujų chromatografija yra plataus pritaikomumo metodas, nes skirstymo procesas vyksta molekuliniame lygmenyje, todėl remiantis šiuo metodu galima atskirti bei analizuoti tiek mikromolekulinius, tiek makromolekulinius junginius. [34] Svarbu paminėti tai, jog naudojant dujų chromatografijos metodą, galima medţiagas identifikuoti ne tik kokybiškai, bet ir kiekiškai. [33]
Pagrindinės dalys, sudarančios dujų chromatografą (9 pav.), yra prie sistemos pajungtos dujos (daţniausiai analizei naudojamos helio ar azoto dujos), kurios nuolatos yra tiekiamos į sistemą. Jų dėka, sistemoje vyksta nuolatinis analizuojamojo bandinio transportas, kurio pasekoje vyksta adsorbcijos procesai, padedantys analizuoti mėginį.
Injektoriaus (daţniausiai su kaitinimo elementu), paskirtis – įvesti analizuojamąjį mėginį į sistemą. [33;37] Chromatografinė kolonėlė yra uţpildyta polimerine medţiaga, kuri ir yra atsakinga uţ medţiagų tarpusavio atsiskyrimą. [37] Detektoriaus paskirtis – uţfiksuoti ir identifikuoti analizuojamojo mėginio sudedamąsias dalis, kurios gaunamos iš kolonėlės. [33] Paskutinioji sistemos grandis – kompiuteris, kurio pagrindinė funkcija – kaupti duomenis, uţtikrinti ir kontroliuoti sėkmingą dujų chromatografo darbą bei uţrašyti gautą tiriamojo mėginio chromatogramą. [33;34;36;37]
8 pav. Dujų chromatografo schema [35; 36]
Vertinant detektorių įvairovę, kurie gali būti taikomi dujų chromatografijoje, pasirinkimas gana platus. Daţnai taikomi liepsnos jonizacijos, šiluminio laidumo, foto-jonizacijos, elektronų laidumo, infraraudonasis bei kiti detektoriai. [34] Atliekant riebalų rūgščių omega-3, omega-6 ir omega-9 kokybinę analizę bei vertinant santykį kraujo riebaluose, naudoti buvo pasirinktas dujų chromatografas, turintis masių spektrometrinį detektorių. Šio detektoriaus skirtumas lyginant su kitais, slypi veikimo mechanizme ir principe. Naudojant masių spektrometrinį detektorių, analizuojamojo mėginio molekulės yra atakuojamos elektronais. Kitaip tariant – vyksta jonizacijos procesas. Susidarę jonų fragmentai, patenka į tam tikrą magnetinį lauką, kuriame išsiskirsto pagal masės bei krūvio santykį. [35;37] Detektoriuje uţfiksuotas elektrinis signalas yra tiesiogiai perduodamas į kompiuterį, kuris pagal gautus signalus, pateikia analizuojamojo mėginio grafinę išraišką – chromatogramą. [37] Junginiai identifikuojami, pirmiausia, išmatuojant tiriamųjų medţiagų spektrus, o paskui palyginant juos su kompiuterio programoje esančiose bibliotekose uţfiksuotais skirtingų junginių masių spektrais. [37]
Dujų chromatografijos metodas naudojant spektrometrijos detektorių, yra palankiausias, siekiant nustatyti įvairių mišinių sudedamąsias dalis. Ne išimtis yra ir kraujas. Šis metodas darbe buvo parinktas todėl, jog kraujas yra daugiakomponentinės sudėties medţiaga, kurią analizuojant dujų chromatografijos - masių spektrometrijos metodu, riebiosios rūgštys yra identifikuojamos itin tiksliai. Papildomas privalumas siekiant įgyvendinti uţdavinius - reikalingas labai maţas paruoštų mėginių kiekis (~1μl) padavimui į sistemą, kurie esant aukštai temperatūrai (~250 C) yra tiriami bei analizuojami.
Riebalų rūgščių nustatymo ir santykio palyginimą kraujo riebaluose galima atlikti dujų chromatografijos metodu naudojant ir kitus detektorius. Taikant liepsnos jonizacijos detektorių, analizei atlikti papildomai reikalingi standartiniai tirpalai, gautiems rezultatams uţtikrinti. Masių spektrometrijos detektorius šiuo atveju yra pranašesnis, nes analizei atlikti standartiniai tirpalai nėra naudojami. Atlikti analizę, taip pat galima ir dujų chromatografijos metodu, taikant infraraudonųjų spindulių (IR) spektroskopiją. Šis metodas pasiţymi greitu atlikimu ir paprastumu, bet tuo pačiu ir jautrumo stoka, ypač tuomet, kai RR izomerų tiriamąjame mėginyje tėra maţiau nei 5%. Taikant šį metodą pastebėta, jog gaunami rezultatai įprastai būna kelis kartus didesni, tadėl metodo taikymas analizėje atmestas dėl galimos rezultatų paklaidos ir netikslumo. [34;51]
2.
TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo organizavimas
Tyrimas buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Medicinos akademijoje, Farmacijos fakultete, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje. Tyrimai buvo atliekami 2014-2016 metais.
Pradedant organizuoti tyrimo eigą, pirmiausia buvo surinkta įvairaus pobūdţio literatūra, atitinkanti magistrinio baigiamojo darbo temą. Išanalizavus literatūrą – buvo suformuotas darbo tikslas ir uţdaviniai, numatytas tyrimo eigos planas, tyrimo atlikimui parinktas metodas - dujų chromatografija.
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas, kuris buvo naudojamas ruošiant magistrinį baigiamąjį darbą – keturių skirtingų ţmonių, septyni kraujo mėginiai, kurie buvo panaudoti chromatografinėje analizėje, nustatant riebalų rūgštis.
Kraujas buvo parinktas atsitiktine tvarka, atkreipiant dėmesį į ţmonių amţių ir lytį. Kraujo mėginiai priklausė 23-ejų metų moteriai, 29-erių metų vyrui, 30-ties metų moteriai ir 56-erių metų amţiaus vyrui (1 lentelė).
1 lentelė. Mėginių reikšmės
Mėginio numeris Lytis Amţius Nr.1 Moteris 23 m. Nr.2 Moteris 23 m. Nr.3 Moteris 23 m. Nr.4 Vyras 29 m. Nr.5 Moteris 30 m. Nr.6 Vyras 56 m. Nr.7 Vyras 56 m.
2.3. Tyrimo medţiagos ir prietaisai
Darbe naudotų medţiagų sąrašas: Chloroformas („Sigma – Aldrich―, Steinheim, Vokietija); Metanolis („Sigma – Aldrich―, Steinheim, Vokietija); Azoto dujos („Gaschema―, Lietuva);
Boro trifluoridas (metanolinis 14% tirpalas) („Sigma – Aldrich―, Steinheim, Vokietija); Heksanas („Sigma – Aldrich―, Steinheim, Vokietija);
Helio dujos („AGA GAS―, Lietuva).
Darbe naudota aparatūra ir prietaisai:
Automatinės pipetės „Eppendorf― (Hamburgas, Vokietija); Centrifuga „Centurion Scientific― (Didţioji Britanija);
Horizoltalus purtytuvas „ELPAN laboratory shaker type 358 S― (Lenkija); Vandens vonelė „Heidolph― (Vokietija);
Vandens gryninimo sistema „MILIPORE― (Darmstadt, Vokietija); Dujų chromatografas „SHIMADZU GCMS-QP2010 Ultra― (Japonija).
2.4. Eksperimentinio tyrimo eiga
Tyrimo eiga buvo vykdoma sekančia eile: Mėginių paėmimas; Mėginių paruošimas; Riebalų ekstrakcija;
Riebalų rūgščių metilesterių paruošimas; Chromatografinė analizė.
2.5. Eksperimentinio tyrimo metodai
Riebalų rūgščių kiekis kraujo riebaluose buvo nustatinėjamas dujų chromatografijos metodu, naudojant masių spektrometrijos detektorių. Riebalų rūgščių nustatymo kraujo riebaluose analizės
mėginiai buvo ruošiami pagal LST EN ISO 12966-2:2011, o paruoštų mėginių analizė atlikta dujų chromatografu „Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra―.
1. Mėginių paėmimas. Turimi kraujo mėginiai buvo sandariai uţdaryti ir laikomi šaldytuve ~ 2 – 8 C temperatūroje, specialiuose kraujo mėginiams skirtuose mėgintuvėliuose. Kiekvieną kartą, prieš atliekant ekperimentus, mėginiai buvo išimami, atšildomi iki kambario temperatūros. Prieš imant kraują analizei, kiekvieną kartą isitikinta, jog mėginys būtų paimamas be kraujyje susidariusių krešulių – tai įtakoja tikslesnius analizės rezultatus. Mėginiai analizei imami tiksliai atmatavus reikiamą tūrį automatine pipete.
2. Mėginio paruošimas ir riebalų ekstrakcija. Paimamas tiksliai automatine pipete atmatuotas reikiamas kraujo tūris – 300 μl. Kraujyje egzistuoja trijų skirtingų rūšių lipidai: maţo tankio lipoproteinai (MTL), didelio tankio lipoproteinai (DTL) ir trigliceridai. Pastarieji būtent sudaryti iš glicerolio ir riebalų rūgščių bei yra reikalingi analizei atlikti, todėl svarbu trigliceridus išektrahuoti iš kraujo. Kraujas mėgintuvėlyje uţpilamas ir ektrahuojamas 600 μl chloroformo ir metanolio mišiniu, kuris buvo pagamintas santykiu 1:2. Paruoštas tirpalas yra intensyviai purtomas ~5 minutes. Gerai sukračius, į tą patį mėgintuvėlį pilama papildomai 250 μl chloroformo ir 250 μl metanolio, kad riebalai pilnai išsiekstrahuotų. Gautas tirpalas vėl yra intensyviai purtomas ~5 minutes ir centrifuguojamas lygiai 5 minutes, esant 400 aps./min. Centrifugavimas atliekamas tolygiam atskyrimui uţtikrinti ir geresniems ekstrakcijos rezultatams pasiekti. Išėmus mėginį iš centrifugos, atsargiai paimamas vandeninis sluoksnis. Pastarasis yra papildomai uţpilamas 300 μl chloroformo tirpalu, siekiant, kad organiniai sluoksniai tarpusavyje susijungtų. Gautą tirpalą gerai supurčius, mėginys yra visiškai sausai išgarinamas nedidelėje azoto srovėje.
3. Derivatizacija, riebalų rūgščių metilesterių paruošimas. Prieš atliekant RR analizę dujų chromatografu, pirmiausia riebalų rūgštis reikia paversti į maţos molekulinės masės nepolinius junginius - metilesterius. Hidrolizės proceso metu, trigliceridai skyla į glicerolį ir riebalų rūgštis. [52] Derivatizacija atliekama į išgarintą sausą likutį įpilant 400 μl boro trifluorido (BF3) (12% metanolyje) tirpalo ir 400 μl heksano. (10 pav.) Boro trifluoridas (BF3) – daţniausiai naudojamas riebalų rūgščių transmetilinimui, nes geba transmetilinti didţiąją dalį lipidų klasių. [52] Derivatizacijos proceso metu, glicerolio fragmentas pakeičiamas kitu alkoholiu, vyksta esterifikacijos procesas. Gautas mišinys 40 minučių šildomas vandens vonelėje, 75 C laipsnių temperatūros vandenyje, kad būtų išgarinti mėginiuose esantys tirpiklių likučiai. Praėjus numatytam šildymo laikui, mėginys atvėsinamas iki kambario temperatūros ir į bandinį pilama 500 μl distiliuoto vandens. Minimalus vandens kiekis padeda uţtikrinti, jog reakcija neįvyktų iki pabaigos, transmetilinant riebalų rūgščių esterius grįţtamuoju keliu iki laisvųjų riebalų rūgščių. Paruoštas mišinys ~10 minučių yra intensyviai purtomas, o galiausiai centrifuguojamas lygiai 5 minutes, esant 400 aps./min. Išėmus mėginį iš centrifugos – labai atsargiai nuimamas viršutinis sluoksnis (heksanas) ir perkeliamas į atskirą
mėgintuvėlį. Likęs mėginys dar kartą papildomai ekstrahuojamas 400 μl heksano tirpalu, truputį lengvai papurtomas ir centrifuguojamas dar 5 minutes, esant 400 aps./min. Mėginį išėmus iš centrifugos, lygiai taip pat atsargiai, viršutinis sluoksnis (heksanas) paimamas, perkeliamas ir sujungiamas su atskirame mėgintuvėlyje jau esančiu heksanu. Mėgintuvėlis lengvai supurtomas, kad organiniai sluoksniai susijungtų tarpusavyje. Gautas mėginys sausai išgarinamas nedidelėje azoto srovėje. Po išgarinimo, sausas likutis, papildomai uţpilamas 30 μl heksano tirpalu. Gautas galutinis ekstraktas analizuojamas dujų chromatografu „Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra―.
9 Pav. Riebalų rūgščių metilesterių susidarymas
4. Chromatografinė analizė. Chromatografinės analizės veikimo principas pagrįstas sorbcijos procesu dinaminėje aplinkoje, t.y. per kolonėlę, kuri yra pripildyta nejudančio sorbento, leidţiamas dujų srautas. [33] Mišinio sudedamosios dalys, pasiţymi skirtinga sulaikymo trukme: pirmiausia fiksuojami silpniausiai absorbuojami komponentai, o tik vėliau absorbuojami stipriau. Kaip dujos nešėjos, dėl saugumo, buvo pasirinktos helio dujos. Tiriamuose mėginiuose riebalų rūgštims identifikuoti, buvo naudojama BPx70 kolonėlė, 30 metrų ilgio, 0,25 mm vidinio skersmens su 0,25μl filtru. Kolonėlė vienu galu pritvirtinta prie injektoriaus, kitu – prie detektoriaus. Pastarasis fiksuoja ištekančio srauto sudėties kitimus ir perduoda duomenų registravimo sistemai. Smailė esanti chromatogramoje rodo tiriamojo komponento ištekėjimą iš kolonėlės. Vadinasi, kiek chromatogramoje yra uţfiksuota smailių, tiek komponentų buvo identifikuota mišinyje. Kiekvienos smailės aukštis ir plotas nurodo komponentinių medţiagų kiekį.
2 lentelė. Chromatografinės analizės sąlygos
2.6. Duomenų analizės metodai
Atlikus chromatografinę analizę, remiantis chromatogramose uţfiksuotais smailių plotais ir RR sulaikymo laikais, naudojant „Microsoft Corporation Excell 2007― programą, sudarytos diagramos, apskaičiuoti nuokrypių dydţiai. Kiekinio nustatymo eksperimentai kartoti tris kartus, o rezultatai išreikšti vidurkių ± standartine išraiška. Rezultatai pateikti remiantis p<0,05 statistiniu patikimumu.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Riebalų rūgščių kokybinės sudėties nustatymas kraujo riebaluose dujų
chromatografijos metodu
Kokybinė riebalų rūgščių sudėtis kraujo riebaluose buvo atliekama dujų chromatografijos metodu, naudojant masių spektrometrijos detektorių. Šis metodas pasiţymi dideliu atrankumu bei tikslumu, didele sparta. Tai vienas plačiausiai naudojamų analizės metodų, kuomet reikia greitai ir tiksliai įvertinti įvairios sudėties mišinių ar junginių sudėtis tiek kokybiškai, tiek kiekiškai. Kraujas – daugiakomponentinė medţiaga, todėl dujų chromatografijos metodas yra tinkamiausias, siekiant paruoštuose mėginiuose išskirti bei išanalizuoti esančias RR.
Viso, tyrime dalyvavo septyni kraujo mėginiai: Nr.1, Nr.2, Nr.3, Nr.4, Nr.5, Nr.6, Nr.7. Trys iš jų (Nr.1, Nr.2, Nr.3) priklausė 23 metų amţiaus moteriai. Mėginiai paimti skirtingų dienų intervale, tarp ėminių paliekant trijų dienų skirtumą. Moteris nevartoja maisto papildų, galinčių fiktyviai įtakoti RR pokytį ar koncentraciją organizme. Laikotarpyje, tarp kraujo mėginių ėmimo, nebuvo keičiami mitybos įpročiai ar koreguojamas maisto racionas.
Mėginiai Nr.4 ir Nr.5, buvo dviejų skirtingų ţmonių kraujas. Mėginys Nr.4 priklausė 29-erių metų vyrui, Nr.5 – 30-ties metų amţiaus moteriai. Atliktos chromatografinės analizės metu, buvo išsiaiškinta kokios RR dominuoja tokio amţiaus ţmonių kraujyje. Pagal chromatogramose uţfiksuotų RR smailių plotus, tarpusavyje palyginti identifikuotų medţiagų kiekiai, nustatyta ar lytis turi kokią nors įtaką RR pasiskirtymui.
Kraujo mėginiai Nr. 6 ir Nr.7 – priklausė 56-erių metų vyrui. Bandiniai buvo imami skirtingomis dienomis, paliekant tarp ėminių trijų dienų laiko intervalą. Laikotarpyje, kuomet mėginiai nebuvo imami analizei, gyvenimo būdo ir mitybos principai nebuvo koreguoti, maisto papildai, galintys turėti įtakos rezultatų tikslumui vartoti taip pat nebuvo.
Iš kiekvieno paimto kraujo mėginio, buvo pagaminta po tris bandinius skirtus analizei atlikti (n=3). Toks ţingsnis įtakoja gauti tikslesnius tyrimo rezultatus.
Įvykdţius ekperimentinę dalį ir išanalizavus gautose chromatogramose pateiktus rezultatus, buvo atliktas palyginimas, siekiant nustatyti identifikuotų RR skirtumus ir sutapimus tarp skirtingų kraujo mėginių. Pagal chromatogramose pateiktus smailių plotų dydţius – sudarytos diagramos. Pastarosios atspindi RR kiekius esančius kraujo mėginiuose. Remiantis chromatogramų ir gautų diagramų duomenimis - įvertinta kokios RR ir kokiu santykiu dominuoja ţmonių kraujyje, lyginant dvi amţiaus grupes, t.y. ţmonių iki 50-ties ir virš 50-ties metų.
11 pav. Mėginio Nr. 1 chromatograma. 1 - palmitino rūgštis, 2 - oleino rūgštis, 3 – palmitino rūgšties izomeras, 4 – tetrakozano rūgštis, 5 – stearino rūgštis, 6 – linolo rūgštis
Pirmąjame paveikslėlyje yra pavaizduota mėginio Nr.1 chromatograma (pav. 11), kuri atspindi pirmosios dienos, kuomet buvo paimtas kraujas ir tirtas mėginys, gauti duomenys. Tyrimo metu nustatyta, jog kraujo riebaluose esti penkios skirtingos riebalų rūgštys: heksadekano (palmitino) rūgštis, 9-oktadekano (oleino) rūgštis, 9,12-oktadekadieno (linolo) rūgštis, tetrakozano bei oktadekano (stearino) rūgštis. Atlikus analizę, akivaizdu, kad kraujo mėginyje dominuoja sočiosios riebalų rūgštys, tačiau yra aptikta ir viena mononesočioji – oleino rūgštis, priklausanti omega-9 RR grupei bei polinesočioji, priklausanti omega-6 RR grupei – linolo rūgštis.
Paėmus to paties asmens kraują (mėginys Nr.2) lygiai po trijų dienų ir atlikus tyrimą, didelių ar esminių pakitimų chromatogramoje (12 pav.) nepastebėta. Tris dienas mitybos reţimas buvo įprastas, maisto papildai, galintys įtakoti rezultatus – vartoti nebuvo. Dominuojančių RR kiekis išliko nepakitęs - buvo identifikuotos palmitino, oleino, linolo, stearino riebalų rūgštys. Chromatografas kraujo mėginyje uţfiksavo vieną neţymų pokytį – neidentifikavo tetrakozano sočiosios riebalų rūgšties, tačiau uţfiksavo 22-trikozeno sočiąją rūgštį. Manoma, kad toks pokytis, galėjo atsirasti dėl suvartotų maisto produktų įtakos.
12 pav. Mėginio Nr.2 chromatograma. 1 – palmitino rūgštis, 2 – oleino rūgštis, 3 – palmitino rūgšties izomeras, 4 – stearino rūgštis, 5 – trikozeno rūgštis, 6 – linolo rūgštis
Praėjus dar lygiai trims dienoms, buvo paimtas trečiasis kraujo mėginys (mėginys Nr.3) iš to paties ţmogaus. Atlikus chromatografinę analizę (13 pav.), nustatyta, jog kraujyje dominuojančių RR kiekiai ir santykis lyginant su dviem pirmaisiais mėginiais – identiškai sutampa. Uţfiksuotos keturios tos pačios riebiosios rūgštys (palmitino, oleino, linolo, stearino), tačiau nenustatyta pirmuose dviejuose mėginiuose buvusios tetrakozano ir 22-trikozeno sočiosios RR. Daroma prielaida, jog šį pokytį galėjo įtakoti suvartoti maisto produktai ar kitos iš aplinkos gautos medţiagos. Trečiąjame mėginyje uţfiksuota oktatriokontano sočioji riebalų rūgštis.
2010-aisiais metais, Italijoje, mokslininkų komanda vykdė tyrimą, kurio esmė buvo ištirti kokios RR ir kokiu santykiu dominuoja skirtingų amţiaus grupių ţmonių tarpe. Tyrimas buvo atliekamas beveik identiškomis sąlygomis, dujų chromatografijos metodu. Analizės rezultatai atskleidė, jog vienoje ţmonių grupėje, kurios amţius svyravo nuo 21-erių iki 40-ties metų dominuoja polinesočiosios riebalų rūgštys, tokios kaip linoleno (LA), α-linoleno (ALA), arachidono (AA), eikozapentaeno (EPA), dokozapentaeno (DPA), dokozaheksaeno (DHA). Sočiosios riebalų rūgštys aptiktos dvi: palmitino ir stearino, viena mononesočioji – oleino riebalų rūgštis ir omega-7 grupei priklausanti palmitolio RR. Lyginant santykį tarp omega-3 ir omega-6 riebalų rūgščių, gautas rezultatas ~1:7. Toks santykis šiek tiek viršija sveikatos prieţiūros specialistų ir mokslininkų rekomenduojamą optimaliausią polinesočiųjų RR santykio normą. [38]
Lyginant gautus rezultatus tarpusavyje, italų komandos atlikti tyrimai yra išsamesni, lyginant kokybinį RR nustatymą. Akivaizdu, jog omega-3 ir omega-6 RR santykis yra išsikreipęs, tačiau tyrime
dalyvavusių ţmonių kraujyje aptikta gerokai platesnė sudėtis omega rūgščių, [38] nei kad mėginiuose Nr.1, Nr.2, ir Nr.3, nors tiriamųjų amţiaus kategorija ta pati. Daroma prielaida, jog tokį ţenklų skirtumą galėjo įtakoti gyvenimo būdo ypatumai bei mitybos įpročiai. Identiškas sutapimas pastebėtas, lyginant abiejų tyrimų rezultatuose uţfiksuotas sočiąsias ir mononesočiąsias RR – nustatytos palmitino, oleino ir stearino RR.
13 pav. Mėginio Nr.3 chromatograma. 1 – palmitino rūgštis, 2 – oleino rūgštis, 3 – palmitino rūgšties izomeras, 4 – oktatriokontano rūgštis, 5 – stearino rūgštis, 6 – linolo rūgštis
Mėginių Nr.1, Nr.2 ir Nr.3 gautų rezultatų duomenimis, omega-3 RR nustatytos nebuvo. Visų mėginių gautas chromatogramas palyginus tarpusavyje (pav. 14), akivaizdu, kad kraujyje tėra viena polinesočioji riebalų rūgštis, priklausanti omega-6 grupei – linolo RR. Gavus tokius rezultatus, santykio tarp omega-3 ir omega-6 RR grupių nustatyti neįmanoma.
3 lentelė. Riebalų rūgščių sulaikymo laikai
Riebalų rūgšties pavadinimas Sulaikymo laikas (min.)
Palmitino rūgštis 11.133 Oleino rūgštis 13.497 Linolo rūgštis 23.991 Stearino rūgštis 22.397 Tetrakozano rūgštis 21.050 Trikozeno rūgštis 22.948 Oktatriokontano rūgštis 21.056
Kraujyje daugiausiai identifikuotos sočiosios riebalų rūgštys, visų trijų mėginių tyrimo metu, išliko nepakitusios. Palmitino, stearino, tetrakozano bei oleino RR lyginant chromatogramose uţfiksuotus smailių plotus bei sulaikymo laiką (3 lentelė) analizės atlikimo metu nepakito nei kokybiškai, nei kiekiškai.
14 pav. Mėginių Nr.1, Nr.2 ir Nr.3 chromatogramų palyginimas. 1 – palmitino rūgštis, 2 – oleino rūgštis, 3 – palmitino rūgšties izomeras, 4 – tetrakozano rūgštis, 5 – stearino rūgštis, 6 – linolo
rūgštis
Analizuojant riebalų rūgščių aptikimą amţiaus grupėje iki 50-ties metų, buvo paimtas kraujo mėginys (Nr.4) iš 29-erių metų vyro. Atlikus chromatografinę analizę, nustatyta, kokios RR yra tiriamąjame kraujo mėginyje (pav. 15). Paaiškėjo, jog iš nustatytų trijų RR, viena yra sočioji – palmitino RR. Tai pagrindinė sočioji riebalų rūgštis, esanti ţmogaus riebaluose, bei gausiausiai paplitusi gyvūnuose, augaluose bei mikroorganizmuose. Kasdieniniame mitybos racione, jos gausu įvairiuose produktuose – mėsoje, sūriuose, svieste bei kituose pieno produktuose. Vertinant nesočiąsias riebalų rūgštis, identifikuota viena mononesočioji riebalų rūgštis, oleino, priklausanti omega-9 RR grupei. Taip pat, nustatyta linolo rūgštis, priskiriama omega-6 RR grupei.
Siekiant išsiaiškinti ar egzistuoja tarp riebalų rūgščių skirtumai, lyginant beveik to paties amţiaus vyrų ir moterų kraujo mėginius, tyrimui buvo paimtas 30-ties metų amţiaus moters kraujo mėginys (Nr.5). Tiriamąjame mėginyje nustatytos viso labo dvi skirtingos riebalų rūgštys (pav. 16), t.y. sočioji – palmitino RR ir mononesočioji – oleino RR, priklausanti omega-9 grupei. Kadangi polinesočiųjų riebalų rūgščių kraujyje nenustatyta, likusių dviejų rūgščių (palmitino ir oleino RR) kiekiai, lyginant chromatogramas (pav. 15 ir pav. 16) tarpusavyje, identiškai sutampa.
15 pav. Mėginio Nr.4 chromatograma. 1 – palmitino rūgštis, 2 – oleino rūgštis, 3 – palmitino rūgšties izomeras, 4 – linolo rūgštis
16 pav. Mėginio Nr.5 chromatograma. 1 – palmitino rūgštis, 2 – oleino rūgštis, 3 – palmitino rūgšties izomeras
Siekiant nustatyti, kokios riebalų rūgštys ir kokiais kiekiais aptinkamos kraujyje, ţmonių grupėje virš 50-ties metų, buvo paimtas kraujo mėginys (Nr.6) iš 56-erių metų vyro. Lygiai po trijų dienų, buvo paimtas dar vienas kraujo mėginys (Nr.7), radikaliai nekeičiant mitybos ypatumų, gyvensenos principų ir nevartojant jokių maisto papildų, galinčių vienaip ar kitaip įtakoti tyrimo rezultatus. Remiantis gautų chromatogramų duomenimis, paaiškėjo, jog pirmąjame mėginyje (17 pav.) uţfiksuotos trys riebiosios rūgštys: dvi iš jų yra sočiosios - stearino ir palmitino RR bei viena mononesošioji, priklausanti omega-9 grupei - oleino RR.
17 pav. Mėginio Nr. 6 chromatograma. 1 – palmitino rūgštis, 2 – oleino rūgštis, 3 – palmitino rūgšties izomeras, 4 – stearino rūgštis
Tirtame mėginyje, kuris buvo paimtas po trijų dienų ir atlikus chromatografinę analizę, bei palyginus rezultatus (pav. 18), paaiškėjo, jog riebalų rūgščių sudėtis ir kiekiai išliko kone identiški. Mėginyje aptiktos dvi, pagal sulaikymo laiką bei smailių plotą sutampančios RR, t.y. sočioji – palmitino RR ir mononesočioji, omega-9 grupei priklausanti – oleino RR. Skirtumas išryškėjo tame, jog šį kartą chromatografas neuţfiksavo mėginyje Nr.6 buvusios stearino RR. Daroma prielaida, jog tokį skirtumą galėjo nulemti iš aplinkos su maistu, gėrimais ar kitais būdais patekusios medţiagos.
Lyginant su kitų mokslininkų atliktais tyrimais, Italijoje gyvenančių ţmonių kraujo mėginiuose, atsiţvelgiant į tiriamųjų amţių (grupėje 41 – 60 metų), nustatyta didesnė įvairovė RR. Mėginiuose aptikta sočiosios palmitino ir stearino RR, palmitolio RR priklausanti omega-7 grupei, mononesočioji oleino RR, priklausanti omega-9 riebalų rūgščių grupei. Lyginant skirtumus, Italijoje atlikto tyrimo metu, kraujo mėginiuose buvo identifikuotos ir polinesočiosios riebalų rūgštys, kurios nebuvo uţfiksuotos vykdant mėginių Nr.6 ir Nr.7 tyrimą. Uţsienyje atlikto tyrimo metu, nustatytos dvi polinesočiosios riebalų rūgštys, priklausančios omega-6 grupei, t.y. LA ir AA ir keturios polinesočiosios RR, priklausančios omega-3 grupei, t.y. ALA, EPA, DPA ir DHA. [38] Nustatytas skirtumas grindţiamas tuo, jog asmuo, kurio kraujo mėginiai buvo tiriami (Nr. 6 ir Nr.7) – nevartoja maisto papildų, kurie papildo organizmą nepakeičiamosiomis RR, maitinasi įprastais maisto priduktais, kurie būdingi daugeliui Lietuvoje gyvenančių ţmonių. Tuo tarpu Italijoje atlikto tyrimo metu, ţmonių maisto racionas buvo atidţiai išanalizuotas, ko pasekoje paaiškėjo, jog didţioji dalis tiriamųjų bent du kartus per savaitę valgo riebią ţuvį, vartoja daugiau augalinės nei gyvūninės kilmės maisto produktų, kuriuose gausu polinesočiųjų riebalų rūgščių. Be to, tyrime dalyvavę ţmonės, su
maisto papildais, per dieną suvartodavo ~2-3g EPA ir DHA RR, kurios buvo kombinuotos santykiu 2:1. [38]
18 pav. Mėginio Nr. 7 chromatograma. 1 – palmitino rūgštis, 2 – oleino rūgštis, 3 – palmitino rūgšties izomeras
Atlikus chromatografinę analizę su skirtingų ţmonių kraujo mėginiais, gautos chromatogramos buvo palygintos tarpusavyje (pav. 19), siekiant išsiaiškinti kokios riebalų rūgštys dominuoja bandiniuose, taip pat, palyginti, ar amţius turi įtaką riebalų rūgščių sudėties kitimui organizme. Atlikus analizę, nustatyta, jog polinesočiųjų omega-3 RR nėra uţfiksuota nė viename mėginyje, polinesočioji RR omega-6 rasta tik viena, linolo, tačiau tik dviejų skirtingų ţmonių kraujo mėginiuose (Nr.2 ir Nr.4).
Visuose kraujo mėginiuose dominuoja daţniausiai sutinkama ir labiausiai paplitusi sočioji palmitino RR. Ši rūgštis gausiai randama gyvūnų ir augalų riebalų gliceridų sudėtyje. Šios rūgšties kiekis, beveik identiškai sutampa, lyginant mėginių Nr.2, Nr.4, Nr.5, ir Nr.6 chromatogramų smailes tarpusavyje (pav. 18) bei dujų chromatografijos metu uţfiksuotus sulaikymo laikus (4 lentelė). Išanalizavus chromatogramas, taip pat tapo akivaizdu, jog tuose pačiuose mėginiuose identiškai sutampa ir dominuoja mononesočioji oleino riebalų rūgštis, priklausanti omega-9 RR grupei. Pastaroji riebalų rūgštis yra labiausiai paplitusi iš mononesočiųjų RR tarpo. [40] Oleino rūgšties gausu augaliniuose aliejuose – riešutų, rapsų, saulėgrąţų, vynuogių sėklų, šaltalankių bei sezamų aliejuose. [39]
4 lentelė. Palmitino ir oleino RR sulaikymo laikas
Riebalų rūgšties pavadinimas Sulaikymo laikas (min.)
Palmitino rūgštis 11.144
Oleino rūgštis 13.508
19 pav. Mėginių Nr.2, Nr.4, Nr.5, Nr.6 chromatogramų palyginimas. 1 – palmitino rūgštis, 2 – oleino rūgštis, 3 – palmitino rūgšties izomeras, 4 – stearino rūgštis, 5 – trikozeno rūgštis, 6 –
linolo rūgštis
Įvairių šalių mokslininkai ir tyrėjai, daug metų dirbo, siekdami išsiaiškinti kokios riebalų rūgštys dominuoja ţmonių kraujo riebaluose, kaip kinta jų santykis priklausomai nuo amţiaus, mitybos raciono, maisto papildų vartojimo bei kitų veiksnių, analizavo riebalų rūgščių savybes, santykius, įtaką ir poreikį organizmui. [40; 41] Apţvelgus mėginių Nr.1, Nr.2, Nr.3, Nr.4, Nr.5, Nr.6 ir Nr.7 rezultatus, ir palyginus su kitų mokslininkų atliktais darbais, akivaizu, jog ţmonių kraujyje dominuoja ir didţiausią kiekį uţima sočiosios riebalų rūgštys. Toks rezultatas įtakoja cholesterolio kiekio organizme didėjimą, širdies ir kraujagyslių bei nervų sistemos ligų paplitimą, kitus sveikatos sutrikimus.
Atlikto tyrimo metu, nepavyko palyginti polinesočiųjų omega-3 ir omega-6 RR santykio, kadangi kraujo mėginiuose nėra identifikuotų omega-3 grupei priklausančių RR. Analizuojant gautus rezultatus, pastebėta, jog polinesočiųjų ir mononesočiųjų (omega-9) riebalų rūgščių aptinkama ţenkliai maţiau, nei sočiųjų RR.
3.2. Riebalų rūgščių kiekio palyginimas kraujo riebaluose, remiantis
chromatogramose uţfiksuotais RR smailių plotais
Atlikus chromatografinę analizę, buvo ne tik identifikuotos riebalų rūgštys esančios kraujo mėginiuose, bet ir palygintas riebalų rūgščių kiekis. Palyginimas atliktas remiantis chromatogramose uţfiksuotų riebalų rūgščių smailių uţimamų plotų dydţiais. Pagal juos, buvo atliekami ir kiti palyginimai, analizuojant kaip svyruoja RR kiekis lyginant dvi amţiaus grupes: suaugusių ţmonių iki 50-ties ir virš 50-ties metų.
20 pav. Mėginio Nr.2 kiekinė sudėtis (n=3)
Mėginys Nr.2 priklausė 23-ejų metų moteriai, kuriame chromatografinės analizės metu buvo nustatytos penkios skirtingos riebalų rūgštys. Atlikus kiekinį palyginimą (pav. 20) nustatyta, jog daugiausia kraujyje yra sočiosios palmitino rūgšties (9826582±244780), beveik per pusę maţesnis kiekis stearino (5161375±266350) RR. Polinesočiosios linolo (4991810±265390) RR nustatyta beveik 50% maţiau, nei palmitino RR, dar maţesnis kiekis uţfiksuotas mononesočiosios, omega-9 grupei priklausančios oleino (3774000±259320) RR. Chromatografinės analizės metu paaiškėjo, jog kraujo mėginyje Nr.1 maţiausias kiekis aptiktas sočiosios tetrakozano (2860983±268270) RR. Įvertinus RR kiekius statistiškai (p<0,05) nustatyta, kad palmitino rūgšties kiekis statistiškai reikšmingai skiriasi lyginant su oleino, linolo, stearino ir tetrakozano rūgštimis.
0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000
Palmitino RR Oleino RR Linolo RR Stearino RR Tetrakozano RR
Sm ail ės p lo to d yd is
21 pav. Mėginio Nr.4 kiekinė sudėtis (n=3)
Kraujo mėginyje, kuris priklausė 29-erių metų vyrui (mėginys Nr.4), nustatytos trys skirtingos riebalų rūgštys (pav. 21). Palyginus rezultatus nustatyta, jog kraujyje dominuoja ir diţiausiu kiekiu pasiţymi polinesočioji, omega-6 grupei priklausanti linolo (3831752±109198) riebalų rūgštis. Kiek maţiau nustatyta sočiosios palmitino (2568486±107270) RR ir visai nedidelis kiekis mononesočiosios oleino (844726±108167) RR. Daroma prielaida, jog tokį rezultatą nulėmė mitybos racionas. Panašu, jog asmuo vartoja daugiau augalinės, nei gyvulinės kilmės maisto produktų, kurie ir įtakojo tokį skirtumą organizme. Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad linolo rūgšties kiekis statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi lyginant su oleino ir palmitino rūgštimis, oleino rūgšties kiekis statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi lyginant su palmitino rūgšties kiekiu.
22 pav. Mėginio Nr.5 kiekinė sudėtis (n=3)
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000
Palmitino RR Oleino RR Linolo RR
Smailės p lo to d yd is 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 Palmitino RR Oleino RR Smailės p lo to d yd is
Kraujo mėginys Nr. 5, priklausė 30-ties metų moteriai. Atlikus analizę ir palyginus gautus rezultatus kiekiškai (pav. 22), paaiškėjo, jog kraujo riebaluose ganėtinai daug yra sočiosios palmitino (9380199±212240) RR ir beveik dvigubai maţiau mononesočiosios oleino (4208517±212178) RR, priklausančios mononesočiųjų riebalų rūgščių omega-9 grupei. Nustatytas statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas tarp identifikuotų rūgščių kiekio kraujo mėginyje. Mėginyje neidentifikuota nė viena polinesočioji riebalų rūgštis.
Paskutinysis, kiekiškai nagrinėtas kraujo mėginys buvo Nr. 6, kuris priklausė 56-erių metų vyrui. Atlikus chromatogramose pateiktų rezultatų išvadų apibendrinimą (pav. 23), pastebėta, jog kraujo riebaluose egzistuoja gana nemaţas palmitino (2712604±625405) sočiosios riebalų rūgšties kiekis. Ţenkliai maţiau identifikuota mononesočiosios oleino (1108125±626311) omega-9 grupei priklausančios RR ir lyginant su pastarąja – gerokai maţiau sočiosios stearino (4153195±629160) riebalų rūgšties. Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad stearino rūgšties kiekis statistiškai reikšmingai (p<0,05) skiriasi lyginant su palmitino ir oleino rūgščių kiekiais. Taip pat, nustatytas statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas tarp oleino ir palmitino rūgščių kiekių.
Atlikus riebalų rūgščių kiekio palyginimą kraujo riebaluose, remiantis chromatogramose uţfiksuotais RR smailių plotų dydţiais, daroma išvada, jos visuose kraujo mėginiuose didţiausiu kiekiu pasiţymi sočioji palmitino RR. Šios rūgšties kiekis visuose tirtuose mėginiuose uţfiksuotas didţiausias. Kiek maţesni kiekiai uţfiksuoti, mononesočiosios, omega-9 grupei priklausančios oleino rūgšties.
23 pav. Mėginio Nr.6 kiekinė sudėtis (n=3)
0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000
Palmitino RR Oleino RR Stearino RR
Smail ės p lo to d yd is
