2. Scopo della tesi
Le DC sono state usate per mettere appunto vaccini e terapie contro tumori e
malattie virali. Questo tipo di ricerca è limitata da problemi etici e per questo
sono stati utilizzati modelli animali su cui testare vaccini che potessero essere
usati per sviluppare rimedi contro le diverse malattie. Uno dei modelli studiati è il
virus dell’ immunodeficienza felina (FIV), che possiede molte somiglianze
morfologiche e funzionali con HIV. Molti studi sono stati fatti per capire quali
sono i comportamenti di FIV nei confronti delle cellule che fanno parte del
sistema immunitario felino, per poter capire meglio come HIV agisce nei
confronti del sistema immunitario umano. Con questa tesi abbiamo voluto portare
un contributo a questi studi, cercando di capire se le DC feline sono suscettibili
all’infezione con FIV, se trasmettono il virus alle cellule T e se la loro
funzionalità risulta alterata nel corso dell’infezione. Abbiamo messo a punto un
protocollo che ci ha permesso di sapere se le DC feline possono essere infettate
dal FIV. Le DC sono ottenute da monociti, ricavati dal sangue periferico dei gatti,
coltivate in presenza di una miscela di IL-4 e GM-CSF (Freer et al.,”2005). Le
cellule sono state infettate per mezzo di spinoculazione con 9500, 4750, e 2375
DI50 di FIV di due diversi clade: FIV-Pet clade A e FIV-M2 clade B. La
spinoculazione permette alle cellule di infettarsi in tempi più brevi, rispetto alle
condizioni normali e questo ci ha permesso di ottimizzare i tempi. Le cellule
infettate sono state analizzate con diversi test, per rilevare l’infettività a tempi
diversi dall’infezione (18, 24, 48, 96 ore). Per vedere se le DC si infettavano
abbiamo misurato la p25 nel supernatante con il test ELISA e abbiamo fatto lo
staining intracellulare con 1µg di DF10, un anticorpo monoclonale biotinilato
le DC si infettavano e che il clade A ha maggiore capacità infettante rispetto al B.
Per questo in tutti gli esperimenti successivi abbiamo utilizzato 4750 DI50 di
FIV-Pet per infettare le cellule. Da vari esperimenti è emerso che le DC spinoculate si
infettavano nelle prime 24 ore e l’infezione rimaneva costante fino a 48 ore, per
questo abbiamo ridotto i tempi di analisi e abbiamo visto che la produzione di
virus da parte delle DC comincia a 18 ore aumentava fino a 24 per poi rimanere
costante. Abbiamo inoltre trovato che le DC presentano sulla loro superficie il
CXCR4, un marcatore specifico per il FIV. Le DC sono capaci di infettare in
trans le cellule T e quindi possiamo dire che il virus da loro prodotto è infettante.
Per verificare con un altro approccio questa affermazione abbiamo titolato il virus
prodotto dalle DC sulla linea cellulare MBM ne abbiamo misurato la p25 con
ELISA a 18, 24, 48 ore. Abbiamo potuto osservare che a partire da 24 ore le
MBM venivano infettate da tale supernatante. Inoltre abbiamo voluto chiarire se
il virus alterava la capacità maturativa delle DC, le abbiamo perciò maturate con
20ng/ml di LPS oppure no e le abbiamo infettate e dopo due giorni abbiamo
analizzato al FACS i marcatori di maturità MHC di classe II il B7.1 (Freer et
al.,2005). Con questi esperimenti abbiamo potuto dimostrare che l’infezione con
FIV non altera la funzionalità delle DC. È stata rilevata la presenza di effetto
citopatico su DC infette colorate con cristal violetto e fotografate con camera
