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2. SCOPO DELLA TESI
Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare se il lievito S. cerevisiae possa essere utilizzato come sistema genetico per lo studio del gene targeting e dell’integrazione random di un DNA omologo ad un gene cromosomale fiancheggiato dalle ITRs di AAV.
Abbiamo costruito un modello comparativo rispetto agli studi fatti sulle cellule di mammifero al fine di studiare se la presenza delle ITRs nel nostro costrutto potesse spostare gli equilibri tra gene targeting e random integration in un sistema come il lievito in cui la ricombinazione omologa è di per sé molto efficiente. La costruzione di questo sistema genetico è necessario come base per andare ad approfondire gli studi sui processi molecolari coinvolti nei diversi tipi di integrazione in quanto non sono stati ancora pienamente chiariti. Inoltre, la scelta del lievito è stata causata dal fatto che gli studi riportati in letteratura riguardo ai vettori basati sul virus adeno associato sono stati effettuati principalmente su cellule di mammifero non portando comunque a conclusioni effettive. Un sistema genetico più semplice basato sul lievito potrebbe facilitare lo studio specifico delle sequenze ITRs e chiarire i meccanismi in cui sono implicate.
Abbiamo quindi costruito un plasmide contenente una sequenza omologa ad un gene del lievito e un marker selezionabile. La nostra cassetta di omologia viene fiancheggiata dalle ITRs, questo vettore è stato trasformato nel lievito e in seguito a crescita su mezzo selettivo vengono valutate le frequenze di gene targeting e random integration.
30 Un secondo tipo di esperimenti vanno a valutare le frequenze d’integrazione del vettore co-trasformato con un altro plasmide contenente la sequenza per il gene virale REP, in quanto è nota in letteratura un’interazione tra la proteina e queste sequenze virali.
Successivamente vengono analizzati i DNA genomici di vari cloni che hanno subito random integration tramite la metodica del Southern Blot al fine di evidenziare la presenza del vettore integrato e capire se la presenza delle ITRs sia coinvolta anche nel processo di integrazione random e non soltanto nella ricombinazione sito specifica e se influenzi il numero di integrazioni del vettore. Come ulteriore indagine vengono anche analizzate la sequenze dei siti di integrazione al fine di valutare se esiste un sito di integrazione random preferenziale e se le ITRs vengono mantenute nella loro interezza, diversamente da ciò che si ritrova nelle cellule di mammifero. Questo lavoro di tesi si inserisce in un progetto più ampio in cui si vuole investigare se questo organismo modello può essere utile per aumentare le conoscenze sulla biologia di AAV per poter capire le reali potenzialità di questo virus per scopi terapeutici.
