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CAPITOLO 2
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2. Scopo della Tesi
Le HSP (Heat Shock Protein) rappresentano una classe di proteine presente in tutti gli organismi viventi e sono protagoniste della risposta a stress termico. L’interesse per questa classe di proteine è notevolmente aumentato negli ultimi anni in seguito alla scoperta che le HSP sono coinvolte nella risposta immunitaria negli organismi superiori. Infatti numerosi studi effettuati sulle HSP in modelli animali hanno evidenziato una correlazione positiva tra l’espressione delle HSP e la risposta immunitaria nei confronti di cellule cancerogene e virali. Inoltre è stato dimostrato che le HSP possiedono una forte attività adiuvante in esperimenti effettuati su mammiferi (Kumaraguru et.al. 2003). In seguito a queste evidenze sperimentali la ricerca è stata indirizzata verso l’utilizzazione delle HSP per la cura di numerose malattie tra cui le più rilevanti sono rappresentate dalle patologie tumorali e le malattie virali.
La maggior parte degli studi a livello clinico sono stati fino ad ora effettuati con HSP di origine umana anche se è stato dimostrato che ci sono numerosi parallelisimi tra i meccanismi di resistenza a patogeni presenti nelle piante ed i sistemi di immunità innata degli animali per fronteggiare l’invasione di patogeni (Owens-Grillo et.al. 1996; Holt et.al. 2003). In questi studi è stato dimostrato che proteine HSP70 isolate da piante interagiscono con il complesso delle chaperonine umane e vice versa suggerendo che esiste una elevata conservazione della interazione proteina-proteina e del sistema chaperon tra il regno animale e vegetale. Vista quindi la notevole similarità tra le proteine HSP provenienti dai diversi regni e la dimostrazione che esse hanno la stessa funzione e che in ogni caso alcune HSP vegetali hanno funzione adiuvante in organismi eterologhi, è plausibile ipotizzare che le HSP vegetali possano essere utilizzate nell’industria farmaceutica per la preparazione di farmaci immunostimolanti. Gli esperimenti sull’utilizzazione di HSP vegetali per
31 applicazioni farmaceutiche è stato fino ad adesso limitato poiché non sono disponibili sul mercato proteine HSP purificate. Ciò può essere dovuto al fatto che non è stato ancora sviluppato un processo industriale in grado di estrarre e purificare le HSP dalla materia vegetale grezza a costi economicamente convenienti.
Presso Metapontum Agrobios, nel 2003 è stato iniziato un progetto che ha come obiettivo principale la purificazione di proteine HSP da piante sottoposte a shock termico e la verifica delle capacità immunostimolanti delle stesse. Inoltre per poter studiare in tempi più rapidi la funzione delle proteine HSP sono state utilizzate piante transgeniche che sovraesprimono il gene HSP70 isolato da Arabidopsis thaliana.
Lo scopo di questa tesi è di ottenere una pianta di tabacco (Nicotiana tabacum) trasformata con un costrutto genico costituito dal gene HSP70 di Arabidopsis
thaliana fuso trascrizionalmente con la sequenza del signal peptide della proteina
Calreticulina, una proteina che risiede nel reticolo endoplasmatico. È atteso che l’espressione di tale costrutto genico – sotto controllo di un promotore costitutivo – porterà a una proteina che verrà indirizzata al reticolo endoplasmatico per entrare nella via metabolica secretoria. L’obiettivo finale di un tale esperimento è di ottenere la secrezione della proteina HSP70 dalle radici di piante delle piante trasformate che, crescendo in mezzo idroponica, permetterebbe di purificare elevate quantità della proteina da un mezzo liquido di coltura. L’isolamento della proteina dal mezzo liquido dovrebbe risultare più semplice rispetto all’isolamento della proteina dai tessuti vegetali.
Diversi esempi di proteine espresse in piante trasformate e indirizzate verso specifici compartimenti cellulari sono riportati in letteratura. In uno studio del 1999, piante di tabacco transgeniche sono state utilizzate per ottenere la rizosecrezione di tre proteine ricombinanti: la SEAP (Secreted Alkaline Phophatase), la xilanasi batterica, e la GFP (Green Florescent Protein). Queste proteine, indotte ad un’espressione continua sotto
32 promotori costitutivi (CaMV 35 S e mas2’) sono state indirizzate nell’apoplasto. La GFP è stata direzionata verso la via di secrezione utilizzando il signal peptide della calreticulina di Nicotiana plumbaginifolia – una proteina abbondante del Reticolo Endoplasmico. La SEAP è stata avviata alla secrezione sotto controllo del proprio signal peptide, mentre la xilanasi batterica è stata fusa al signal peptide dell’inibitore delle proteasi II ER (Borisjuk et al.1999). Un altro studio più recente riporta l’ottenimento di proteine dal fluido di guttazione di piante di tabacco trasformate con SEAp e GFP. Anche in questo caso è stata verificata la fattibilità di utilizzare con successo questa tecnica non distruttiva per ottenere proteine ricombinanti dalle piante (Komarnytsky et al. 2000).
Nel corso del presente lavoro di tesi è stato verificata la possibilità di sovraesprimere l’HSP70 in piante transgeniche di tabacco e direzionare la proteina verso l’ER. Il gene HSP70 isolato da Arabidopsis è stato posto sotto il controllo trascrizionale del promotore CaMV35S e fuso con il signal peptide della Calreticulina di Nicotiana
plumbaginifolia che permette l’accumulo dell prodotto genico nell’ER e
successivamente negli spazi intercellulari.
Dato il tipo di lavoro svolto, basato sull’applicazione di molteplici metodologie, si è ritenuto opportuno, ove necessario, mettere direttamente alcuni dei risultati sperimentali nel capitolo dei Materiali e Metodi, ed altri risultati nel capitolo Risultati, onde rendere più agevole e scorrevole la lettura. Per quanto concerne l’applicazione di tecniche basate su Kit specifici, queste sono riportate in maniera estesa su una appendice di allegati, al fine di non appesantire eccessivamente il già abbastanza “robusto” capitolo Materiali e metodi.
