Scuola di Specializzazione in Patologia Clinica e
Biochimica Clinica
BATTERI GRAM NEGATIVI EMERGENTI IN
FIBROSI CISTICA: INCIDENZA E
ANTIBIOTICO RESISTENZA IN PAZIENTI
IN CURA PRESSO IL CENTRO REGIONALE
DI GENOVA
RELATORE: Prof. G. Tripodi
RELATORE ESTERNO: Dott.ssa P. Morelli
CANDIDATA: Dott.ssa Gaia D’Amato
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Indice
1. INTRODUZIONE... 3 1.1. Fibrosi Cistica ... 3 1.2. Infezione polmonare in FC ... 8 1.3. Patogeni emergenti in FC ... 11 Achromobacter species ... 12 Stenotrophomonas maltophilia ... 14 Ralstonia species ... 17 Pandoraea species ... 17 Inquilinus limosus ... 19Altre specie batteriche gram negative ... 19
2. SCOPO ... 20
3. MATERIALI E METODI ... 21
3.1. Ceppi e campioni clinici ... 21
3.2. Identificazione dei ceppi ... 22
API 20NE ... 22
MALDI-TOF ... 23
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3.3. Determinazione della sensibilità agli antibiotici ... 25
SensititreTM ... 25
VITEK2CompactCard-AST ... 27
4. RISULTATI ... 28
4.1. Identificazione di specie e incidenza di batteri gram negativi non fermentanti ... 28
4.2. Pattern di sensibilità agli antimicrobici di batteri gram negativi non fermentanti ... 33
5. DISCUSSIONE... 36
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1. INTRODUZIONE
1.1. Fibrosi Cistica
La Fibrosi Cistica (FC) è la malattia genetica ad esito fatale più diffusa tra la popolazione caucasica. E’ una patologia multisistemica che coinvolge in modo esteso il processo secretorio di tutte le ghiandole, sia muco-secernenti sia sudoripare-esocrine sparse in tutto il corpo (1). Nella sua forma più grave questa patologia colpisce pancreas, polmoni, fegato e intestino provocando ostruzione dei dotti principali a causa della produzione di secrezioni molto viscose, tanto da essere chiamata in passato mucoviscidosi. Il danno pancreatico è precocissimo e porta a difficoltà di digestione e assimilazione dei grassi, perciò un tempo i bambini morivano per malnutrizione. Attualmente il problema a livello pancreatico è correggibile, mentre rimane ancora da risolvere il grave danno polmonare che si manifesta più o meno precocemente, ma che in ogni caso danneggia in modo progressivo e irreversibile il tessuto polmonare. Per questo motivo, ai nostri giorni, la causa principale di morte per FC è l’insufficienza respiratoria. Fino a pochi anni fa la malattia riguardava solo l’età pediatrica, mentre ora coinvolge anche il medico dell’adulto, sia per l’evoluzione delle strategie terapeutiche, che hanno migliorato nettamente
4 la prognosi, sia per il riconoscimento di forme più lievi che hanno esordio in età adulta o adolescenziale (2, 3).
La FC è una malattia monogenica e segue il normale schema di trasmissione autosomica recessiva, per cui si esplicita pienamente solo negli individui omozigoti, mentre in quelli eterozigoti non si manifesta alcun sintomo perché il gene mutato funziona al 50% e riesce a soddisfare il fabbisogno biologico. La sua incidenza è di 1:2000-1:3000 nati vivi nella popolazione di razza caucasica, mentre è più rara per quella africana e asiatica; nella razza caucasica si stima che almeno il 2-4% della popolazione sia portatore sano della malattia, per questo è frequente la possibilità di unione tra due eterozigoti che potrebbero generare un quarto dei figli malati e metà portatori sani. La causa principale della malattia è stata riscontrata nel difetto di un gene che è stato identificato e clonato nel 1989 grazie alla tecnica della “genetica inversa”, metodo utilizzato quando non si conosce la proteina alterata. Il gene codificante per il CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane-Conductance Regulator) è stato localizzato sul braccio lungo del cromosoma 7 (banda q31-32), è lungo 230 Kb ed è costituito da 27 esoni. Esso codifica per una proteina di membrana che ha come funzione principale, ma non unica, il trasporto ionico attivo essendo un canale transepiteliale per il cloro; quindi il difetto si ripercuote in un’anomala regolazione del trasporto epiteliale dello ione (1). Più propriamente si tratta di una glicoproteina appartenente alla super famiglia
5 degli ABC, ATP Binding Cassette Transporter, cui appartiene anche la glicoproteina P (Pgp) con la quale ha più del 70% d’omologia (4). La proteina CFTR è costituita da 1480 aminoacidi e la sua struttura è stata suddivisa in diverse regioni. Presenta, infatti, due domini transmembrana, TMD1 e TMD2, che formano il canale attraverso il quale passa il cloro; due domini intracellulari capaci di legare e idrolizzare l’ATP, chiamati NBF (Nucleotide Binding Fold); una regione intracellulare regolatrice (R) che separa i due domini proteici e che comprende alcuni siti di fosforilazione per le proteine chinasi A e C, indispensabili per il controllo dell’attività del canale in cooperazione con l’ATP (5). Infatti, nel normale epitelio il CFTR si localizza nella membrana plasmatica apicale delle cellule epiteliali; si apre quando la presenza di un agonista, ad esempio l’acetilcolina, induce un aumento della concentrazione di AMP ciclico che successivamente attiva la Proteina chinasi A (PKA), la quale fosforila in specifici residui amminoacidici di serina le regioni R e NBF. L’AMPc, quindi, funziona come regolatore nell’apertura e nella chiusura del canale ionico.
Oltre alla tipica funzione di canale per il cloro, il CFTR interviene anche nella regolazione di altri canali ionici, inibendo l’attività del canale per il sodio EnaC (Endothelial Natrium Channel) e attivando un altro canale al cloro detto ORCC (Outwardly Rectified Chloride Channels); è coinvolto in numerosi metabolismi cellulari come il processamento di altre
6 glicoproteine, la regolazione del pH degli organelli intracellulari, inoltre, sembra essere implicato nell’aumentata suscettibilità all’infezione bronchiale batterica e nell’esagerata e persistente risposta infiammatoria dell’ospite (6, 7, 8).
La proteina è espressa in modo non uniforme specificatamente dalle cellule epiteliali delle vie respiratorie, dell’intestino, tra cui ghiandole salivari, pancreas e vie biliari, del tratto genito-urinario e delle ghiandole sudoripare. Gli effetti della malattia si esprimono, infatti, in questi tessuti, ma sono diversi sia in termini di gravità sia d’età d’esordio. Ciò accade a causa delle diverse alterazioni nucleotidiche riscontrate in questa malattia genetica. Fino ad oggi, infatti, sono state identificate nel gene CFTR più di 1500 mutazioni, tra cui anche polimorfismi che, se presi in determinate combinazioni, causano la FC; le variazioni nucleotidiche si trovano lungo tutta la struttura del gene, cioè sia in zone codificanti che non, ma in alcune fasce la frequenza è più elevata: infatti, le variazioni genetiche si localizzano principalmente nei domini proteici essenziali al corretto funzionamento del canale. La mutazione più frequentemente rilevata è una delezione di tre paia di basi (CTT) nell’esone 10, che corrisponde alla perdita di un residuo di fenilalanina presente nel dominio NBD1 in posizione 508 (ΔF508).
Dal punto di vista clinico, la FC è caratterizzata dalla compromissione anatomo-funzionale cronica e ingravescente di più organi e apparati; la
7 broncopneumopatia cronica condiziona pesantemente la prognosi dei pazienti affetti da FC e su tale decorso è stato riconosciuto, fin dalle prime segnalazioni della malattia, il ruolo fondamentale delle infezioni batteriche (9). L’infezione cronica delle vie aeree che caratterizza questa malattia sembra essere conseguenza diretta del difetto biochimico di base: le secrezioni mucose dense del soggetto con FC presentano anormali proprietà di clearance (10) muco-ciliare e l’accumulo di muco denso e viscido, ostruendo le vie aeree, predispone il paziente FC ad infezioni polmonari croniche (11).
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1.2. Infezione polmonare in FC
L’infezione polmonare cronica è conseguente alla colonizzazione da parte di microrganismi opportunisti comunemente presenti nell’ambiente, la cui acquisizione e prevalenza è età-dipendente (fig.1).
Il primo patogeno che colonizza i bambini affetti da FC è lo
Staphylococcus aureus. Questo produce delle tossine, a e d, che inducono
danno alla parete bronchiale e formazione di ascessi. L’intensa risposta infiammatoria provocata distrugge parte del tessuto polmonare e mette le basi per la successiva colonizzazione da parte di Pseudomonas aeruginosa, presente nel 70-80% dei bambini dai 3 anni in su, prima con ceppi non
9 mucoidi, poi mucoidi (12). L’infezione da P. aeruginosa incide pesantemente sul decorso clinico e sulla prognosi dei soggetti affetti da FC. La prevalenza di questo microrganismo, il più frequente e pericoloso agente infettante le vie respiratorie, varia dal 9% in età prescolare al 32% a 10-15 anni e la maggior parte dei pazienti viene colonizzata cronicamente. L’importanza della colonizzazione da P. aeruginosa sta nel fatto che questo batterio pur essendo un patogeno opportunista, è difficile da eradicare a causa delle molteplici resistenze che presenta nei confronti di molte classi di antibiotici.
Quindi, nella maggior parte dei casi, nemmeno dopo intensiva terapia antibiotica si riesce a debellare questo microrganismo, che rimane l’agente principale del danno cronico polmonare e, quindi, della riduzione di vita del paziente. Si è visto che P. aeruginosa si deposita sulla superficie delle vie aeree e penetra all’interno delle zone di muco ipossico provocato dall’aumentato consumo epiteliale di ossigeno tipico della FC, dall’aumentato assorbimento del volume del liquido di superficie e dalla stasi del muco. Il microrganismo risponde a questo ambiente con un aumento della produzione di alginato, polimero di acido mannuronico. Questa molecola di natura polisaccaridica è il componente fondamentale della capsula prodotta da P. aeruginosa di tipo mucoide. L’alginato è inoltre un fattore di virulenza che permette una migliore aderenza all’epitelio ciliato, inibisce la fagocitosi, in quanto non permette
10 l’opsonizzazione da parte degli anticorpi, e non lascia facilmente passare gli antibiotici (13).
Haemophilus influenzae è spesso isolato da bambini d’età maggiore di un
anno, ma gli studi non permettono di stabilire una significativa relazione tra la presenza del batterio e la situazione patologica. Prove in vitro dimostrano che questo microrganismo aderisce molto bene agli epiteli del tratto respiratorio e che il lipopolisaccaride e le tossine da lui prodotte possono causare danni ai tessuti del tratto respiratorio (14).
Un altro importante batterio di cui è stato dimostrato un ruolo patogeno è
Burkholderia cepacia, microrganismo generalmente innocuo in soggetti
sani. Sembra che B. cepacia colonizzi il polmone del paziente con FC prevalentemente nel caso in cui siano presenti altri microrganismi, come P.
aeruginosa, e, quindi, in pazienti più grandi d’età. Infatti, l’alginato di P. aeruginosa dovrebbe essere in grado di legare radicali ossidativi creando
un ambiente protetto affinché B. cepacia si replichi e provochi un’infezione sovrapposta a quella cronica sostenuta dai ceppi mucoidi di P. aeruginosa (15). In ogni caso, l’isolamento di B. cepacia è stato associato in alcuni pazienti ad un rapido declino delle condizioni cliniche del malato (16). Oltre ai patogeni batterici sopra descritti, numerosi funghi filamentosi possono colonizzare le vie aeree di questi pazienti. La colonizzazione fungina in FC è facilitata dai frequenti e prolungati cicli di terapia antibiotica e dall’uso di corticosteroidi; tale colonizzazione, in alcuni
11 pazienti, può sfociare in una vera e propria infezione. Sebbene il ruolo di alcuni miceti sia ancora da chiarire sembra che la colonizzazione fungina agisca simultaneamente con la colonizzazione batterica.
Tra i funghi filamentosi Aspergillus fumigatus rappresenta la causa più frequente di colonizzazione delle vie aeree in FC.
1.3. Patogeni emergenti in FC
L’uso estensivo di antibiotici, mirato soprattutto al controllo delle colonizzazioni e delle infezioni croniche sostenute da P. aeruginosa, potrebbe essere una delle cause dell’espansione dell’eziologia microbica e quindi dell’incremento di nuovi isolamenti dal tratto respiratorio di pazienti con FC (17,18). Infatti, oltre ai microrganismi precedentemente descritti, ritenuti i principali responsabili della compromissione clinica nei pazienti FC, negli ultimi anni sono stati isolati sempre più frequentemente numerosi altri germi gram-negativi non comuni non fermentanti il glucosio (GNNFNC). Tuttavia il ruolo patogeno di questi ceppi emergenti è tutt’ora poco chiaro.
Tra questi patogeni emergenti sono annoverati membri del genere
Ralstonia, Pandoraea ed i cosiddetti Burkholderia cepacia-like,
microrganismi opportunisti che possono essere confusi con i membri del B.
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Achromobacter species
Gli Alcaligenes, recentemente rinominati Achromobacter, sono una famiglia di batteri gram negativi, non fermentanti, ossidasi positivi, indolo negativi, mobili grazie alla presenza di flagelli peritrichi (19). Di questa famiglia fanno parte differenti specie suddivise in due gruppi principali a seconda della capacità o meno di utilizzare gli zuccheri. Si riconoscono dunque le specie asaccarolitiche come Alcaligenes faecalis, Achromobacter
piechaudii, Achromobacter xylosoxidans subspecies denitrificans (AXD)
(in passato Alcaligenes xylosoxidans subspecies denitrificans) e quelle saccarolitiche come l’Achromobacter xylosoxidans subspecies xylosoxidans (AXX) (20) (in passato Alcaligenes xylosoxidans subspecies xylosoxidans). Gli Achromobacter sono germi che crescono lentamente in coltura e per essere classificati correttamente richiedono terreni selettivi di crescita ed ulteriori prove biochimiche specifiche.
Sono batteri descritti come particolarmente antibiotico resistenti (21, 22). Sono ampiamente distribuiti in natura, ma raramente sono patogeni opportunisti. Gli Achromobacter spp. ed in particolare Achromobacter
xylosoxidans sono frequentemente osservati nella popolazione FC (23).
Studi di prevalenza variano notevolmente con i singoli centri FC riportando tassi che vanno dal 3 al 30% (24, 25).
Sebbene l’infezione con A. xylosoxidans nei pazienti FC sia frequentemente transiente, può verificarsi un’infezione cronica per diversi
13 anni ed è generalmente dovuta alla persistenza dello stesso ceppo (26, 27, 28). Può inoltre spesso accadere che A. xylosoxidans venga erroneamente identificato come Bcc o P. aeruginosa (29).
Tuttora risulta però incerto il ruolo dell’infezione cronica da A.
xylosoxidans circa la morbilità e mortalità in pazienti affetti da FC. Uno
studio condotto da Tan, Conway e coll. (30) sembrerebbe escludere che l’infezione cronica delle vie aeree da A. xylosoxidans abbia un ruolo negativo nell’andamento clinico della malattia. Analogamente Moissenet e coll. segnalano che su un totale di 8 pazienti FC pediatrici, cronicamente affetti da A. xylosoxidans, solo uno ha mostrato un deterioramento clinico imputabile a questo germe. Questo paziente però, era cronicamente colonizzato anche da P. aeruginosa (31). Ma la letteratura scientifica in merito è esigua ed alcune evidenze cliniche sembrerebbero discostarsi da questa tesi.
Alcuni studi hanno tentato di approfondire le caratteristiche dell’infezione da A. xylosoxidans nei pazienti FC; da questi sembrerebbe emergere che, nei pazienti già cronicamente colonizzati da P. aeruginosa, l’A.
xylosoxidans non ricopra un ruolo primario nell’evoluzione peggiorativa
del quadro polmonare e che l’infezione cronica da A. xylosoxidans si instauri preferenzialmente in pazienti con una situazione clinica e funzionale respiratoria già particolarmente compromessa.
14 Il ruolo dell’A. xylosoxidans appare invece evidente nei pazienti cronicamente colonizzati solo da tale germe in quanto si nota che la funzionalità respiratoria in questi pazienti sembra peggiorare sensibilmente nel periodo successivo all’esordio dell’infezione cronica e in alcuni casi, il deterioramento clinico conseguente rende necessario anche il ricovero ospedaliero.
Stenotrophomonas maltophilia
La S. maltophilia è un bacillo gram negativo non sporigeno, non-fermentante, ossidasi-negativo, mobile per la presenza di alcuni flagelli polari ed aerobio obbligato.
E’ un microrganismo multiresistente, isolato sempre con maggiore frequenza tra i pazienti con FC; questo germe è anche un importante patogeno nosocomiale per pazienti non affetti da FC, soprattutto tra i soggetti immunocompromessi. La S. maltophilia è un germe diffuso sia nell'ambiente ospedaliero che nell'ambiente domestico dei pazienti; in particolare la sua presenza viene rilevata in associazione con l'acqua ed i sistemi idrici, compresi gli apparecchi per la terapia aerosolica che non vengono accuratamente asciugati dopo l'uso. Le prime segnalazioni del germe in pazienti con FC risalgono agli anni ‘70, cui sono seguite sporadiche segnalazioni fino agli ultimi anni in cui l'isolamento del germe è diventato molto frequente.
15 La prevalenza della S. maltophilia è progressivamente incrementata fino a valori del 15-30% in alcuni centri europei e del 10% in centri americani (32, 33).
Gli studi effettuati fino ad ora non hanno evidenziato una correlazione tra la presenza del germe e l'età dei soggetti infetti, mentre sembra emergere un'associazione tra nuove infezioni, l'uso protratto di antibiotici, chinolonici in particolare, e precedenti ricoveri ospedalieri, soprattutto nell'anno precedente l'isolamento del germe. Non ci sarebbe al momento un'evidenza di passaggio dell'infezione da paziente a paziente. L'isolamento del germe sembra avere una maggiore incidenza in soggetti con funzionalità polmonare leggermente più compromessa. L'isolamento concomitante di P. aeruginosa e di S. maltophilia è un evento decisamente comune.
Il significato clinico dell'infezione da S. maltophilia non è ancora chiarito. Alcuni studi hanno dimostrato la capacità del germe di aderire alle cellule dell'apparato respiratorio e di invadere le cellule stesse in vitro; altri hanno documentato una capacità di indurre una risposta infiammatoria, ma inferiore rispetto a quella dello P. aeruginosa o della B. cepacia (34). L'infezione da S. maltophilia è spesso un evento transitorio, con incidenza piuttosto bassa di infezioni protratte (isolamenti ripetuti per più di un anno). Solo uno studio del 1998 aveva evidenziato un’associazione significativa tra l'isolamento del germe, un declino nella funzionalità
16 respiratoria e, nei soggetti con malattia polmonare più avanzata, una maggiore mortalità a due e forse cinque anni; studi successivi non sono stati però in grado di confermare questi dati.
Caratteristica preoccupante di S. maltophilia è l’elevato livello di resistenza a molti degli antibiotici comunemente impiegati nella pratica clinica (35). Tra gli antibiotici più attivi emerge sicuramente il trimetoprim/sulfametossazolo, con dati di suscettibilità > al 95% (36). La S. maltophilia è un germe la cui incidenza annuale di nuovi isolamenti appare in lieve costante incremento nei pazienti affetti da FC; l'infezione appare essere sostanzialmente di tipo intermittente, mentre sono rari i casi di colonizzazione cronica. Non è dimostrato un ruolo patogenetico del batterio nel determinare un declino nella funzionalità polmonare né a breve né a lungo termine; nessun incremento nella mortalità è stato fino ad ora documentato. Rimane quindi da chiarire l'eventuale utilità di un trattamento diretto contro la S. maltophilia, anche nei casi a maggiore persistenza, vista la mancanza di dati a supporto di un effetto negativo anche in questi soggetti. Data la frequente concomitanza d'infezione con P. aeruginosa, appare ragionevole orientare la scelta della terapia antimicrobica contro questo germe in caso di presenza concomitante e peggioramento clinico del paziente.
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Ralstonia species
Attualmente cinque specie fanno parte del genere Ralstonia, tra di esse quelle conosciute per causare infezioni nell’uomo, incluse infezioni in pazienti FC, sono R. pickettii, R. mannitolilytica e R. insidiosa (37).
La frequenza e l’impatto clinico delle infezioni da Ralstonia spp. in pazienti FC non è stata studiata sistematicamente (38). Nel loro studio Burns e coll. (39) su un totale di 559 pazienti FC trovarono R. pickettii solamente in due di essi.
Un ulteriore studio condotto nel 2002 da Coenye identificò 38 individui infettati da Ralstonia spp. tra diverse centinaia di pazienti FC negli Stati Uniti (40). Tuttavia non è nota nessuna prova di ceppi condivisi che indichi una trasmissione tra pazienti, ma l’analisi genotipica ha indicato un’infezione cronica in alcuni di essi.
Pandoraea species
I microrganismi appartenenti al genere Pandoraea spp. sono bacilli gram negativi non fermentanti, aerobi, descritti per la prima volta nel 2000 da Coenye et al. (41). Inizialmente il genere Pandoraea comprendeva cinque specie batteriche (Pandoraea apista, Pandoraea pulmonicola, Pandoraea
pnomenusa, Pandoraea sputorum e Pandoraea norimbergensis). Dopo di
18 il loro specifico nominativo (Pandoraea thiooxidans, Pandoraea
oxalativorans, Pandoraea faecigallinarum e Pandoraea veracti) (42, 43).
Sono batteri ubiquitari nell’ambiente, si riscontrano nel suolo, nel mare e nell’acqua potabile (44, 45).
Nell’uomo, i microrganismi del genere Pandoraea spp. sono prevalentemente isolati dai pazienti FC nei quali possono causare colonizzazione cronica dei polmoni (46, 47). Tuttavia si hanno poche conoscenze riguardo il ruolo patogeno che questi microrganismi svolgono nei soggetti FC.
Diverse specie di Pandoraea sono state riscontrate nei pazienti FC; in Danimarca nel 2003 P. apista fu responsabile di un’epidemia in sei pazienti FC (48); più recentemente in Spagna, P. sputorum fu un agente di colonizzazione cronica dei polmoni in pazienti FC (49). Oltre alla colonizzazione polmonare, sono state segnalate anche infezioni invasive dovute a questa specie per lo più in pazienti non FC (50, 51); tuttavia un caso di batteriemia dovuta a Pandoraea spp. è stata descritta in un paziente FC (52).
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Inquilinus limosus
Inquilinus limosus, altro patogeno emergente in FC, normalmente presente
nell’ambiente (suolo), rappresenta una delle specie multi-resistente in grado di causare infezioni gravi e colonizzazioni croniche. Il primo isolamento è stato descritto nel 1999 in un paziente FC trapiantato di polmone (53). Negli ultimi anni l’isolamento di questo patogeno è stato descritto in diversi pazienti FC adolescenti e adulti.
Ad oggi sono stati descritti 8 casi clinici in Germania , 1 caso negli USA, casi in Francia, 1 caso nel Regno Unito e 1 caso in Italia (54).
Altre specie batteriche gram negative
Numerose altre specie batteriche di gram negativi non fermentanti sono state isolate da campioni delle vie aeree di pazienti affetti da FC, fra di esse troviamo specie che raramente sono associate ad infezioni umane, quali
Bordetella species (B.bronchiseptica/parapertussis), Rhizobium radiobacter, Chryseobacterium (C. meningosepticum, C. indologenes, C. gleum), Ochrobactrum species, Sphingomonas species e Xanthomonas species.
Sebbene la colonizzazione da parte di patogeni inusuali non abbia ancora un ruolo clinico chiaro, una conoscenza più approfondita della loro diffusione e una maggior caratterizzazione, può aiutare a far luce su questa problematica e agevolare il trattamento di questi pazienti.
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2. SCOPO
Nell’ultima decade l’insorgenza nei pazienti FC di batteri gram negativi non fermentanti “inusuali” è in forte crescita. La corretta identificazione di queste peculiari specie e le scarse conoscenze riguardo al loro ruolo patogeno nel decorso della malattia rappresenta una sfida per il Laboratorio di Microbiologia della FC.
Al fine di implementare le conoscenze riguardanti i batteri gram negativi non fermentanti “inusuali” emergenti in FC, nel Laboratorio di microbiologia della FC dell’Ospedale Gaslini di Genova, tra il 2010 e il 2016, si sono caratterizzati, mediante identificazione di specie e antibiotico-resistenza, 330 ceppi isolati da 3089 campioni delle vie aeree di 250 pazienti afferenti al Centro di Cura FC di Genova.
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3. MATERIALI E METODI
3.1. Ceppi e campioni clinici
Nel periodo compreso tra l’1 gennaio 2010 e il 31 dicembre 2016 presso il Centro Regionale per la FC dell’Istituto “Giannina Gaslini” di Genova, sono stati collezionati 330 batteri gram-negativi non fermentanti il glucosio non comuni (GNNF-NC) isolati dai campioni delle vie aeree (espettorati, tamponi e aspirati faringei, tamponi nasali e broncolavaggi) di pazienti FC in follow-up presso il Centro di Cura.
I campioni sono stati esaminati presso la Sezione Microbiologia FC dei Laboratori Centrali di Analisi dell’Istituto “Giannina Gaslini” di Genova, e precisamente sono stati trattati in accordo con le Linee Guida per la diagnostica di campioni microbiologici della FC stabilite dal Gruppo Professionale di Microbiologia della Società Italiana di Fibrosi Cistica. In breve, tali campioni sono stati seminati in Columbia Agar + colistina e Acido nalidixico (BD), Agar Cioccolato (BD), Mannitol Salt Agar (BD), Mac Conkey Agar (BD), Sabouraud destrosio agar con cloramfenicolo e gentamicina (BD) e Burkholderia Cepacia Selective Agar (bioMérieux); i campioni di espettorato sono stati prima fluidificati per 15min a 35°C, con l’uso di pari volume di Sputasol (Oxoid) e, in seguito, sono stati seminati 20µl in ciascuna piastra. Per tutti gli altri materiali è stata effettuata una
22 semina diretta. Dopo la semina, Mannitol Salt Agar (BD), Mac Conkey Agar (BD), Sabouraud destrosio agar con cloramfenicolo e gentamicina (BD) e Burkholderia Cepacia Selective Agar (bioMérieux) sono stati incubati per 48h a 35°C, mentre Columbia Agar + colistina e Acido nalidixico (BD) e Agar Cioccolato (BD) sono stati incubati per 48h a 35°C in atmosfera arricchita del 5% di CO2 prima dell’osservazione di una eventuale crescita batterica.
3.2. Identificazione dei ceppi
I batteri gram-negativi non comuni non fermentanti isolati sono stati opportunamente catalogati e crioconservati a -80°C in vials contenenti 800µl di Tryptic Soy Broth e 200µl di glicerolo. Prima dell’esecuzione delle varie metodiche di identificazione, tutti i ceppi sono stati coltivati
overnight a 35°C in Agar Sangue (BD).
API 20NE
Il test è stato eseguito seguendo le indicazioni fornite dalla casa produttrice (bioMérieux). La lettura dei test è avvenuta dopo 24/48 ore di incubazione a 30°C; il bionumero ottenuto dalla lettura delle reazioni biochimiche è stato utilizzato per identificare il ceppo mediante il software APILAB (bioMérieux).
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MALDI-TOF
L’identificazione mediante MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) è stata eseguita utilizzando uno spettrometro VitekMS (bioMérieux). Brevemente: ogni spotting è stato preparato mediante deposito sull’apposito strip di una porzione di colonia e fissato mediante 1µl di soluzione matrice (Acetonitrile 28%). Per le colonie difficili si è proceduto ad un pre-trattamento con 0.5µl di soluzione di Acido formico al 28.9%.
L’identificazione è stata ottenuta comparando lo spettro del microrganismo da identificare con quelli contenuti in un database di riferimento, mediante software dedicato (bioMérieux) (55, 56). I risultati sono stati considerati
Fig. 2 Gallerie API20NE per l’identificazione biochimica di batteri gram negativi non fermentanti.
24 accettabili quando l’intervallo di confidenza era maggiore del 90% per il primo spot e il secondo spot era concorde con il primo.
Per ogni gruppo di acquisizione nell’alloggiamento target è stato utilizzato
Escherichia coli ATCC 8739 per calibrare lo spettrometro di massa.
VITEK2 Compact Card ID
Per l’identificazione fenotipica con sistema automatizzato è stato utilizzato il sistema Vitek2 Compact con le card per microrganismi gram-negativi. I risultati sono stati considerati accettabili quando l’intervallo di confidenza era maggiore del 90%.
Fig. 3 Vitek MS strip. Supporto per lo spotting delle colonie da identificare con Maldi-tof.
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3.3. Determinazione della sensibilità agli
antibiotici
Prima dell’esecuzione del saggio della sensibilità agli antibiotici, tutti i ceppi sono stati coltivati overnight a 35°C in Agar Sangue (BD).
Sensititre
TMIl test è stato eseguito secondo le indicazioni del manufatto. Brevemente, 3-5 colonie di isolati sono state prelevate dalla piastra di agar fresco primario ed emulsionate nelle provette di vetro con acqua sterile (5ml) fino ad arrivare ad una concentrazione pari a 0.5 MF misurata con nefelometro Sensititre. Quindi 20µl di tale sospensione sono stati trasferiti in 11 ml di Brodo Mueller-Hinton Sensititre. Le micro piastre ITGNEGF (gram negativi) sono state inoculate mediante inoculatore Sensi AIM (fig. 4). La lettura delle piastre è stata fatta, con il visualizzatore manuale Sensi Vizion (fig. 5), dopo 24h di incubazione a 37°C. Per la valutazione dei valori di MIC sono stati utilizzati i criteri interpretativi del sistema Eucast (www.eucast.org/clinical_breakpoints/).
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Fig. 5 Visualizzatore Sensititre Vizion. Sistema di lettura/interpretazione semi-automatica di antibiogrammi in micro piastra.
Fig. 4 Inoculatore Sensititre AIM. Sistema automatico si semina di micropiastre per l’allestimento di antibiogramma in brodo.
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VITEK2 Compact Card-AST
Il test è stato eseguito utilizzando le card AST-N202 e seguendo le indicazioni fornite dalla casa produttrice (bioMérieux); la determinazione della sensibilità agli antibiotici (amikacina, ceftazidime, ciprofloxacina, colistina, levofloxacina, meropenem, minociclina, piperacillina/tazobactam e trimethoprim/sulfametossazolo) è stata effettuata automaticamente dal Vitek2 Compact (fig. 6) nell’arco delle 18h di durata massima del test. Come controllo è stato utilizzato il ceppo ATCC 25922 di Escherichia coli. Per la valutazione dei valori di MIC sono stati utilizzati i criteri interpretativi del sistema Eucast (www.eucast.org/clinical_breakpoints/).
Fig. 6 Strumento Vitek2 Compact. Sistema automatizzato per l’identificazione biochimica di specie e l’esecuzione di antibiogrammi.
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4. RISULTATI
Durante il periodo 2010/2016 sono stati analizzati 3089 campioni delle vie aeree di 250 pazienti affetti da FC seguiti annualmente presso il Centro di Cura Regionale dell’Istituto “Giannina Gaslini” di Genova.
4.1. Identificazione di specie e incidenza di batteri
gram negativi non fermentanti
Per la valutazione e l’identificazione dei GNNFNC sono state considerate le colonie cresciute, dopo 48-72h di incubazione a 37°C, su Mac Conkey Agar (McK) e Burkholderia Cepacia Selective Agar (BCSA); in tabella 1 sono riportate le crescite per ciascuna specie isolata su questi terreni di coltura.
GNNFNC Crescita su
McK agar
Crescita su BCSA
Achromobacter Positiva Positiva*
Stenotrophomonas Positiva Positiva*
Chryseobacterium Negativa Positiva
Sphingobacterium Negativa Positiva
Ochrobactrum Positiva Positiva Altri (B.cepacia like) Negativa Positiva
(*) Ceppi resistenti alla Colistina
Tabella 1. Crescita dei GNNFNC su terreni di coltura selettivi, Mac Conkey Agar (MCK) e Burkholderia Cepacia Selective Agar (BCSA).
29
Fig. 8 Crescita di diverse colonie di GNNFNC su terreno Burkholderia Cepacia Selective agar (BCSA) dopo 48h di incubazione a 37°C.
Fig. 7 Colonie di Achromobacter xylosoxidans su Mac Conkey Agar dopo 48h di incubazione a 37°C.
30 Tra i batteri gram negativi non fermentanti non comuni, isolati in tali campioni, le specie riscontrate maggiormente sono state S. maltophilia e A.
xylosoxidans con un’incidenza rispettivamente del 4,5% e del 3,7%. Altri
generi come Chryseobcterium spp., Ochrobactrum spp. e
Sphingobacterium spp. sono invece meno rappresentati, riportando
incidenze che variano dall’1% allo 0,4 %.
Da questi campioni sono emersi inoltre altri microrganismi quali
Pandoraea spp., Bordetella spp. e Rhizobium spp. aventi tuttavia incidenza
del tutto trascurabile.
In figura 9 e in tabella 2 sono riportati i risultati inerenti le identificazioni eseguite sui batteri gram negativi non fermentanti isolati.
Fig. 9 Batteri gram-negativi non fermentanti isolati dai pazienti FC. Chryseobacterium spp. 10% Achromobacter spp. 35% Bordetella spp. <1% Ochrobactrum spp. 4% Pandoraea spp. <1% Pseudomonas spp. (*) 5% Rhizobium spp. <1 % Sphingobacterium spp. 4% Stenotrophomonas spp. 42%
31 I risultati evidenziati in figura sono riferiti al totale dei campioni positivi per l’isolamento di batteri gram-negativi non fermentanti.
In tabella 2 sono indicate le specie identificate e il confronto fra i sistemi identificativi adottati: sistemi convenzionali biochimici come API 20NE e Vitek2 Compact e sistemi che utilizzano la spettrometria di massa come Maldi-Tof. Genere Specie N. isolati Metodo utilizzato API20NE Vitek2 Compact MSVitek (Maldi-Tof) Achromobacter xylosoxidans 115 90 115 0 (*) Chryseobacterium indologenes 31 0(**) 31 31 meningosepticum 1 0(**) 0 1 Ochrobactrum anthropi 13 0(**) 13 13 Pseudomonas(***) fluorescens 11 9 11 11 putida 4 4 4 4 Sphingobacterium multivorum 5 5 4 5 spiritivorum 7 5 7 7 Stenotrophomonas maltophilia 140 140 140 140 Rhizobium radiobacter 1 0 0 1 Pandoraea sputorum 1 0 0 1 Bordetella bronchiseptica 1 1 0 1 Totale 330 254 325 215
(*) mancata discriminazione fra specie denitrificans e xylosoxidans a causa di tracciati proteici troppo simili, con risultati di identificazione divisi al 50% tra le due specie. (**) Identificazione accettabile solo a livello di genere.
(***) Pseudomonas spp. diverse da P. aeruginosa
Tabella 2. Identificazione di specie dei gram negativi non fermentanti isolati in questo studio.
32
Fig. 10 Identificazione di Achromobacter specie con MS Vitek Maldi-Tof.
Profilo della spettrometria di massa e relativa interpretazione: impossibilità di discriminare fra le specie xylosoxidans (valore di confidenza 50%) e denitrificans (valore di confidenza 50%).
33
4.2. Pattern di sensibilità agli antimicrobici di
batteri gram negativi non fermentanti
Secondo il sistema interpretativo EUCAST, non esistono valori di breakpoint clinici legati alle specie identificate in questo studio che possano essere utilizzati per valutare i valori di MIC, per cui si è deciso di utilizzare i valori di farmaco-cinetica e farmaco-dinamica (Pk/Pd) degli agenti antimicrobici testati.
(http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/when_there_are_no_breakpoin ts/).
I risultati degli antibiogrammi, riportati come MIC50 e MIC90, ottenuti per ciascuna specie sono stati riassunti nelle tabelle (Tab. 3-7) sottostanti.
A. Xylosoxidans (115 ceppi) MIC50 R-I-S (EUCAST) MIC90 R-I-S (EUCAST)
Amikacina* >16 (IE) >16 (IE)
Cefepime 16 R >32 R
Ceftazidime 8 I 128 R
Ciprofloxacina 2 R 8 R
Colistina* 4 (IE) 64 (IE)
Meropenem 1 S 32 R
Minociclina* 16 (IE) 96 (IE)
Piperacillina/Tazobactam <=2 S 128 R
Trimetoprim/Sulfametoxazolo* <=0,5 (IE) >4 (IE)
(*) IE= Nessun criterio interpretativo disponibile secondo Eucast 2017. Tabella 3. Valori di MIC50 e MIC90
Risultati dei test di sensibilità su ceppi (n°115) di A. xylosoxidans. L’interpretazione R/S è basata sulle tabelle Pk/Pd (Eucast 2017).
34 S. maltophilia (140 ceppi) MIC50 R-I-S (EUCAST) MIC90 R-I-S (EUCAST) Ceftazidime 8 I 128 R Ciprofloxacina 1,5 R >2 R
Colistina* 1 (IE) 8 (IE)
Levofloxacina <=1 S >2 R
Minociclina* 1 (IE) 4 (IE)
Piperacillina/Tazobactam 32 R >256 R
Trimetoprim/Sulfametoxazolo** <=0,5 S 2 S
(*) IE= Nessun criterio interpretativo disponibile secondo Eucast 2017.
(**) Valori di breakpoint di riferimento per S. maltophilia EUCAST 2017 (≤4 S; >4 R). Tabella 4. Valori di MIC50 e MIC90
Risultati dei test di sensibilità su ceppi (n°140) di S. maltophilia. L’interpretazione R/S è basata sulle tabelle Pk/Pd (Eucast 2017).
Chryseobacterium spp. (32 ceppi) MIC50 R-I-S (EUCAST) MIC90 R-I-S (EUCAST)
Amikacina* >16 (IE) >16 (IE)
Ceftazidime 2 S 8 I
Ciprofloxacina 0,5 I 1 R
Colistina* >8 (IE) >256 (IE)
Levofloxacina <=1 S <=1 S
Meropenem 16 R >32 R
Minociclina* 1 (IE) 3 (IE)
Piperacillina/Tazobactam 8 I 16 I
Trimetoprim/Sulfametoxazolo* <=0,5 (IE) 1 (IE)
(*) IE= Nessun criterio interpretativo disponibile secondo Eucast 2017. Tabella 5. Valori di MIC50 e MIC90
Risultati dei test di sensibilità su ceppi (n°32) di Chryseobacterium spp. L’interpretazione R/S è basata sulle tabelle Pk/Pd (Eucast 2017).
35 O. anthropi (13 ceppi) MIC50 R-I-S (EUCAST) MIC90 R-I-S (EUCAST)
Amikacina* 16 (IE) >16 (IE)
Ceftazidime >128 R >256 R
Ciprofloxacina 0,25 S 2 R
Colistina* 8 (IE) >8 (IE)
Levofloxacina 1 I >4 R
Meropenem 0,5 S 0,5 S
Minociclina* 0,25 (IE) 1 (IE)
Piperacillina/Tazobactam >128 R >256 R Trimetoprim/Sulfametoxazolo* <=0,5 (IE) >4 (IE)
(*) IE= Nessun criterio interpretativo disponibile secondo Eucast 2017. Tabella 6. Valori di MIC50 e MIC90
Risultati dei test di sensibilità su ceppi (n°13) di O. anthropi. L’interpretazione R/S è basata sulle tabelle Pk/Pd (Eucast 2017).
Sphingobacterium spp. (12 ceppi) MIC50 R-I-S (EUCAST) MIC90 R-I-S (EUCAST)
Amikacina* >16 (IE) >16 (IE)
Ceftazidime 4 S 4 S
Ciprofloxacina 0,5 I 0,5 I
Colistina* >8 (IE) >8 (IE)
Levofloxacina <=1 S <=1 S
Meropenem 2 S 4 I
Minociclina* 0,125 (IE) 0,125 (IE)
Piperacillina/Tazobactam 32 R 32 R
Trimetoprim/Sulfametoxazolo* <=0,5 (IE) <=0,5 (IE)
(*) IE= Nessun criterio interpretativo disponibile secondo Eucast 2017. Tabella 7. Valori di MIC50 e MIC90
Risultati dei test di sensibilità su ceppi (n°12) di Sphingobacterium spp. L’interpretazione R/S è basata sulle tabelle Pk/Pd (Eucast 2017).
36
5. DISCUSSIONE
L’infezione polmonare in FC è caratterizzata da patogeni peculiari, fra cui
P. aeruginosa rappresenta il principale patogeno causa di maggior
morbilità e mortalità. Tuttavia in questa ultima decade numerosi studi (57, 58) hanno mostrato che altri batteri gram negativi, in particolare A.
xylosoxidans e S. maltophilia possono avere un’ importanza clinica in FC.
Diversamente per altri batteri non fermentanti che risultano emergenti nei campioni FC, quali Ralstonia e i cosiddetti “Burkholderia cepacia-like”, non è stato ancora dimostrato un vero ruolo patogeno.
Quindi in questo studio sono stati analizzati batteri GNNFNC allo scopo di ampliare le conoscenze sulle loro caratteristiche così da permettere una migliore comprensione sulla ricaduta clinica e sulle possibilità terapeutiche in pazienti colonizzati da tali microrganismi.
Presso il Centro di cura Regionale FC di Genova sono stati analizzati 3089 campioni fra il 2010-2016, da essi sono stati isolati 115 (3.7%) A.
xylosoxidans e 140 (4.5%) S. maltophilia. I dati presenti in letteratura
mostrano una variabilità sull’incidenza di questi gram negativi nei diversi centri FC. In America il report della CF foundation riporta 4.4% per A.
37 microrganismi in FC riportano dati contrastanti. In particolare un lavoro di Lambiase et al (2011) riporta dei valori di incidenza più alti: A.
xylosoxidans circa 7% mentre S. maltophilia 19% circa (59). Diversamente
un altro studio italiano del 2009 riporta un incidenza più bassa di A.
xylosoxidans 3%, mentre per S. maltophilia tra il 7-11% (60). In fine il
centro FC di Roma La Sapienza descrive una situazione analoga alla nostra: A. xylosoxidans 3%, S.maltophilia 5.8% (61).
Questa importante variabilità potrebbe essere riconducibile ad una errata identificazione e/o ad un mancato isolamento di questi patogeni: spesso in questi pazienti la co-infezione con P. aeruginosa con fenotipo cronico può mascherare la presenza di altri isolati, in particolare su Mac Conkey Agar le colonie mucoidi possono rendere impossibile l’isolamento di altre specie. Oltre alle difficoltà di isolamento spesso anche i sistemi identificativi utilizzati possono dare una misidentificazione di questi batteri, portando ad una sottostima dell’incidenza di alcune specie del gruppo GNNFNC.
A tal riguardo nel nostro studio abbiamo valutato e comparato l’efficacia di tre sistemi identificativi: API 20NE, VITEK2 Compact e MSVitek (Maldi-Tof). Tutti i sistemi identificano S. maltophilia con ottime percentuali di identificazione (99.9%), mentre per A. xylosoxidans sia il sistema API 20NE che MSVitek (Maldi-Tof) presentano delle problematiche: il primo in circa il 20% degli isolati porta ad una mancata identificazione con profili
38 inaccettabili, mentre il secondo sistema, pur portando nel 100% degli isolati ad una corretta identificazione del genere Achromobacter , non riesce a discriminare fra le due specie xylosoxidans e denitrificans. In letteratura altri studi hanno comparato l’identificazione di specie con sistemi biochimici e di spettrometria di massa e i risultati pubblicati sono in linea con quelli riportati nel nostro studio. In particolare il sistema Maldi-Tof è risultato essere il sistema identificativo più accurato, tuttavia permane un problema legato ai profili presenti nel database di riferimento, in quanto lacune in alcuni profili proteici possono portare ad una mancata o errata identificazione di specie. Questa problematica è insorta nel nostro studio durante l’identificazione di batteri quali Pandoraea sputorum e Bordetella
bronchiseptica che sono state identificate esclusivamente con spettrometria
di massa dopo aggiornamento del database presente nel software dedicato. Per quanto riguarda gli altri microrganismi emergenti studiati, i dati di incidenza che sono molto bassi (intorno all’1%) sono in linea con altri lavori pubblicati da altri centri FC italiani. In particolare due studi di Lambiase e collaboratori riportano un numero di isolamenti di microrganismi come Sphingobacterium e Cryseobacterium con specie (spiritivorum, multivorum e indologenes e meningosepticum
rispettivamente) del tutto analoghe alle nostre (62, 63).
O. anthropi rimane un microrganismo opportunista poco descritto in
39 a Sphingobacterium e Cryseobacterium spp. dimostra una bassissima incidenza tra i nostri pazienti.
La crescita su terreno selettivo per B. cepacia complex (BCSA agar) di questi ultimi patogeni emergenti descritti crea un’ulteriore difficoltà tecnica per il laboratorio di microbiologia della FC, in quanto aumenta il rischio di una misidentificazione di tali patogeni con B. cepacia che rappresenta invece un patogeno importantissimo per i pazienti FC. Nel nostro laboratorio le tecniche utilizzate hanno mostrato che sia il sistema automatico Vitek2 Compact che il Maldi-Toff sono in grado di portare ad un’ottima identificazione di queste ultime specie con un intervallo di confidenza del 99.9% .
Questi GNNFNC oltre a rappresentare una problematica ancora legata all’identificazione di specie, sono inoltre caratterizzati da un pattern di resistenze antimicrobiche che rende la terapia antibiotica una vera sfida per il clinico.
La conoscenza dei profili di antibiotico-suscettibilità può aiutare il clinico a creare protocolli terapeutici mirati per pazienti colonizzati da questi patogeni. A tale scopo nel nostro studio abbiamo anche valutato il pattern di sensibilità di questi microrganismi alle maggiori classi di antibiotici utilizzati nel trattamento dei pazienti FC.
Ad oggi l’interpretazione degli antibiogrammi di batteri GNNFNC rappresenta una difficoltà, in quanto i criteri interpretativi definiti da
40 EUCAST non prevedono dei breakpoint correlati a queste specie. In questo studio abbiamo quindi deciso di utilizzare come breakpoint i valori di Pk/Pd definiti da EUCAST 2017.
In letteratura si descrive A. xylosoxidans come generalmente sensibile all’imipenem, al meropenem, alla piperacillina-tazobactam, al ceftazidime, al cloramfenicolo, alla minociclina, al trimetoprim-sulfametossazolo e invece resistente alle penicilline, al cefotaxime, al ceftriaxone, all’aztreonam e agli aminoglicosidi. La sensibilità ai fluorochinolonici variabile. Nello studio condotto dal gruppo de La Sapienza di Roma, è emersa una resistenza agli aminoglicosidi e alla ciprofloxacina, mentre ceftazidime e imipenem sembrano essere le molecole più attive su questo germe. Anche nel nostro studio i carbapenemi e i betalattamici risultano i più efficaci, anche se i nostri ceppi risultano più sensibili alla piperacillina/tazobactam che al ceftazidime. Secondo la definizione, data dalla CF foudation, di ceppo multi resistente (MDR), per cui un ceppo è definito MDR se mostra resistenza agli agenti di due o più delle maggiori classi di antibiotici, il 90% dei ceppi di A. xylosoxidans analizzati in questo studio risulta essere MDR.
S. malthophilia è resistente a differenti classi di antimicrobici.
All’espressione di diversi meccanismi di resistenza, sia innati che acquisiti, è da attribuire la resistenza agli antibiotici betalattamici, ai chinoloni, ai carbapenemi, alle cefalosporine, anche se alcuni ceppi sono sensibili al
41 ceftazidime. Levofloxacina e trimetoprim/sulfametossazolo sono i farmaci più efficaci. Anche nel nostro lavoro queste due molecole risultano essere le più efficaci su S. maltophilia, anche se solo il trimetoprim/sulfametossazolo risulta attivo sul 90% dei ceppi. Quest’ultima molecola infatti rappresenta il farmaco di scelta nel trattamento delle infezioni da S. malthophilia, e ad oggi è l’unico antibiotico per cui sono disponibili i breakpoint EUCAST. La percentuale di ceppi MDR è elevata anche per questo patogeno il cui trattamento può risultare quindi difficile. In presenza di ceppi MDR, come indicato da Eucast, è sempre consigliabile utilizzare associazioni di farmaci.
Per quanto riguardo Chryseobacterium e Sphingobacterium gli antibiotici più attivi risultano essere i fluorochinoloni (ciprofloxacina e levofloxacina) e il trimetoprim/sulfametoxazolo, mentre non sembrano avere nessuna attività gli aminoglicosidi, nello specifico amikacina. Ceppi di
Chryseobacterium spp. inoltre risultano resistenti ai carbapenemi
(meropenem 100% R). I nostri risultati sono in accordo con i dati emersi negli studi di Lambiase et al. su Chryseobacterium e Sphingobacterium. Come già emerso dal programma di sorveglianza antimicrobica “Sentry” entrambe le specie sono rappresentate da una elevata percentuale di ceppi MDR che rappresentano una complicanza nel trattamento delle riacutizzazioni polmonari in pazienti colonizzati da questi batteri.
42 Infine Ochrobactrum anthropi è generalmente sensibile agli aminoglicosidi, ai chinoloni e al cotrimoxazolo; viceversa è resistente ai beta-lattamici tranne che ai carbapenemi. Nel nostro studio infatti i ceppi analizzati risultano sensibili al meropenem.
In conclusione questo studio conferma la forte variabilità all’interno della complessità dei campioni FC di questi microrganismi, di cui non sono ancora chiari la rilevanza clinica e il ruolo nel deterioramento polmonare. Si conferma la caratteristica di multi resistenza per la maggioranza di questi batteri, fattore che ha importanti ricadute sul trattamento antimicrobico del paziente colonizzato. Risulta quindi evidente la necessità di avvalersi di metodiche e tecnologie idonee che consentano un costante monitoraggio e studio delle resistenze di questi GNNFNC per definirne il vero ruolo patogeno in pazienti FC.
43
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RINGRAZIAMENTI
Arrivata finalmente in fondo, desidero ringraziare tutti quelli che mi hanno permesso di raggiungere questo obiettivo.
Inizio col ringraziare il Prof. Tripodi che mi ha dato la possibilità di svolgere il mio tirocinio formativo presso i Laboratori Centrali di Analisi dell’Istituto “Giannina Gaslini” di Genova.
Un enorme grazie va alla Dott.ssa Patrizia Morelli per l’immenso aiuto che mi ha dato nella stesura di questa tesi e per tutto il tempo che mi ha dedicato.
Grazie di cuore a tutto il personale del Laboratorio di Analisi dell’Istituto “Giannina Gaslini” per i preziosi insegnamenti e per avermi sempre fatto sentire come a casa.
Un grazie particolare va alla mia famiglia per essermi stata accanto e avermi permesso di portare a termine tutto ciò.
Infine grazie a Simone che più di tutti mi ha sostenuta, senza il quale, oggi probabilmente non sarei qui a scrivere queste pagine.
Gaia
