Pagrindinių maisto alergenų ir laktozės tyrimai valgomuosiuose leduose Major food allergens and lactose analysis in ice cream Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Dovilė Stancevičienė

Pagrindinių maisto alergenų ir laktozės tyrimai valgomuosiuose

leduose

Major food allergens and lactose analysis in ice cream

Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Doc. dr. Arūnas Stankevičius Anatomijos ir fiziologijos katedra

DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas ,,Pagrindinių maisto alergenų ir laktozės tyrimai valgomuosiuose leduose“

 Yra atliktas mano pačios;

 Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

 Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

Dovilė Stancevičienė (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Dovilė Stancevičienė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

Doc. dr. A. Stankevičius

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE Prof. dr. J. Žymantienė

(aprobacijos data) (katedros vedėjos vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai: 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašai)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas)

TURINYS

1.1 Maisto alergijos samprata ... 9

1.2 Maisto alergenai ... 10

1.3 Alerginių ligų rizikos veiksniai ... 11

1.4 Sergamumas maisto alergijomis ... 14

1.4.1 Specifinių IgE tyrimų reikšmė diagnozuojant alergiją ... 14

1.4.2 Maisto alergijos kaip visuomenės sveikatos problema... 15

1.5 Alergenų ženklinimą reglamentuojantys teisės aktai ... 17

1.6 Maisto alergenų nustatymo metodai ... 20

2. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 21

2.1 Mėginių paruošimas ... 21

2.1.1 Mėginių paruošimas kazeino likučių nustatymui ... 21

2.1.2 Mėginių paruošimas sojos likučių nustatymui ... 22

2.1.3 Mėginių paruošimas žemės riešutų likučių nustatymui ... 22

2.1.4 Mėginių paruošimas laktozės nustatymui... 23

2.2 Alergenų nustatymas ... 24

2.2.1 Kazeino likučių nustatymas ... 24

2.2.2 Sojos likučių nustatymas ... 27

2.2.3 Žemės riešutų likučių nustatymas ... 30

2.3 Laktozės nustatymas ... 33

3. REZULTATAI ... 36

3.1 Kazeino likučių tyrimas sojos valgomuosiuose leduose ... 36

3.2 Laktozės likučių tyrimas. Kazeino ir laktozės priklausomybė ... 37

3.3 Sojos likučių nustatymas ryžių pieno valgomuosiuose leduose ... 38

3.4 Žemės riešutų likučių tyrimas ryžių pieno valgomuosiuose leduose ... 40

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 44

NAUDOTA LITERATŪRA ... 48

SANTRAUKA

Pagrindinių maisto alergenų ir laktozės tyrimai valgomuosiuose leduose Dovilė Stancevičienė

Magistro baigiamasis darbas

Darbo apimtis – 53 psl., 19 lentelių, 9 paveikslai, 4 priedai.

Maisto alergijos aktuali visuomenės problema. Kadangi veiksmingiausia priemonė išvengti alerginių reakcijų - visiškas nustatyto produkto nevartojimas, kuriame yra alergizuojančių medžiagų, tačiau dėl to nukenčia ne tik asmuo sergantis maisto alergija, bet ir suprastėja visos šeimos gyvenimo kokybė. Tačiau maisto industrija džiugina sparčiai plėsdama prekių asortimentą įvairiais maisto produktais, kuriuose įprastinės maisto medžiagos pakeičiamos įvairiomis alternatyvomis, tokiu būdu pagamina maisto produktą be nepageidaujamų maisto alergenų. Žinant, kad padidintos rizikos asmenų grupėms alergines reakcijas gali iššaukti net mažiausi aptinkami alergenų likučiai, būtinas griežtas alergenų valdymas maisto produktų gamybos procese. Taip bus užtikrinta deklaruojama informacija produktų etiketėse ir apsaugota žmonių, sergančių maisto alerginėmis ligomis, sveikata.

Atsižvelgiant į maisto alergijų aktualumą visuomenėje šio darbo tikslas – išbandyti ir įvertinti kiekybiškai imunofermentinės analizės metodą (IFA), kai kurioms alergijas sukeliančioms medžiagoms nustatyti ledų gamybos procese. Tyrimo metu nustatyta kazeino koncentracija eksperimentiniuose sojos valgomųjų ledų mišinio mėginiuose, į kuriuos pridėta pieniškų valgomųjų ledų mišinio įvairiomis koncentracijomis. Nustatytas ir laktozės kiekis bei įvertinta kiekio priklausomybė tarp kazeino ir laktozės. Ryžių pieno pagrindu pagamintuose valgomuosiuose leduose nustatytas žemės riešutų likučių kiekis esant skirtingoms žemės riešutų chalvos koncentracijoms, bei sojos likučių kiekis esant skirtingoms sojos ledų mišinio koncentracijoms.

Remiantis tyrimo rezultatais, atlikti teoriniai skaičiavimai, kurie gali būti naudingi gamyboje alergenų valdyme, labiau suprantant kiek svarbūs prevenciniai veiksmai, kokie minimalūs kito valgomųjų ledų mišinio likučių kiekiai gali turėti įtakos visai mišinio partijai ir būti aptinkami galutiniame produkte, bei būti nesaugūs padidintos rizikos vartotojų grupėms.

SUMMARY

Major food allergens and lactose analysis in ice cream Dovile Stanceviciene

Master’s Thesis

The volume of work – 53 pages, 19 tables, 9 pictures, 4 annexes.

Food allergies are relevant problem of society. Since the most effective means to prevent allergic reactions – complete remove the product from the diet, which contains allergenic substances, however that affected not only the person suffering from food allergies, but also deteriorates the whole family's quality of life. But the food industry is encouraging the rapidly expanding range of products with the usual nutrients are replaced by different alternatives, thus producing food without unwanted food allergens. Knowing that the allergic reactions for groups of high-risk can cause even the smallest detectable allergen residues requires strict control of allergens in the food production process. That will ensure the declared information of product labels and protect people with allergies, health.

According to the relevance of food allergies in the society the aim of this work paper - to try and quantified by ELISA method some allergies identify substances which cause ice-making process. The investigation established a concentration of casein in the experimental soy ice cream mixture samples containing added dairy ice cream mixture in varying concentrations. Identified amount of lactose and the estimated amount of correlation between the casein and lactose. In rice milk-based ice cream identified peanut residue levels at different peanut halva concentrations, and also soybean residue levels identified at different concentrations of soy ice cream mixture.

Based on the research results, perform the theoretical calculations, which can be useful in the production of allergen management, better understanding importance of preventive action, what residues of other ice cream mix can affect the whole mix of batch and be present in the final product, and be unsafe for high-risk groups of users.

SANTRUMPOS

CV (angl. coefficient of variation) - variacijos koeficientas. IFA - imunofermentinės analizės metodas.

IgE – imunoglobulinas E.

ISAAC (International Study on Asthma and Allergy in childhood) – tarptautinis tyrimas dėl astmos ir alergijų vaikystėje

MGS – mažas gimimo svoris.

PGR (angl. PCR; Polymerase chain reaction) – polimerazinė grandininė reakcija. ppm (angl. parts per million, 10-6) – matavimo vienetas, milijoninės dalys. PSO – pasaulio sveikatos organizacija.

ĮVADAS

Sparčiai kintanti mūsų gyvenamoji aplinka kartais ima kelti pavojų. Jei žmogus pradeda neįprastai reaguoti į įprastines medžiagas – išsivysto alerginės ligos [1]. Alerginės ligos yra vis didėjanti sveikatos problema, ypač tarp vaikų ir jaunų suaugusiųjų išsivysčiusiose, pramonės paveiktose šalyse. Šios problemos didėjimo priežastys vis dar neaiškios.

Lietuvoje tyrimų alerginių ligų dėsningumams nustatyti beveik nėra, o alergija maistui dažniausiai tyrinėjama asmens sveikatos aspektu (diagnostikos ir gydymo principai). Iš epidemiologinių tyrimų paminėtini: vaikų bronchų astmos, alerginio rinito ir atopinio dermatito simptomų paplitimo (2000, 2008 m.) bei Vilniaus 5-9 klasių moksleivių maisto alergijų (2008 m.) tyrimai [2-4], tačiau informacijos apie maisto alergenų ir jų simptomų paplitimą bei pasiskirstymą atskirose amžiaus grupėse Lietuvoje trūksta.

Labai svarbūs visi atliekami epidemiologiniai tyrimai, kurie padeda įvertinti ryšius tarp rizikos veiksnių ir maisto alergijų atsiradimo, taikyti profilaktikos priemones ar būdus palengvinti/sumažinti maisto alergijų sukeliantį diskomfortą sergantiems asmenims. Kadangi veiksmingiausia priemonė išvengti alerginių reakcijų - visiškas nustatyto produkto nevartojimas, kuriame yra alergizuojančių medžiagų, bet dėl to nukenčia ne tik asmuo sergantis maisto alergija, bet ir suprastėja visos šeimos gyvenimo kokybė. Tačiau maisto industrija džiugina sparčiai plėsdama prekių asortimentą – produktų, skirtų alergiškiems žmonėms, be tam tikro deklaruojamo alergeno sudėtyje, siūlomi įprastiniai maisto gaminiai, alergizuojančius ingredientus pakeičiant kitomis alternatyvomis. Atsižvelgiant į tai, kad padidintos rizikos asmenų grupėms alergines reakcijas gali iššaukti mažiausios alergenų koncentracijos, būtinas griežtas alergenų valdymas maisto produktų gamybos procese. Tokiu atveju bus užtikrinta deklaruojama informacija produktų etiketėse ir apsaugota žmonių, sergančių alerginėmis ligomis, sveikata. Platesnis tokių produktų pasirinkimas palengvina daugelio žmonių kasdienybę, padidinamas jų maisto racionas nesukeliant sveikatos sutrikimų.

Žmonėms, kuriems maisto produktai sukelia alergines reakcijas, dabar kur kas lengviau išsirinkti jų sveikatai nekenksmingą gaminį, nes pagal reglamentą dėl informacijos apie maistą tiekimo vartotojams, kuris visoje Europos Sąjungoje įsigaliojo nuo 2014 m. gruodžio 13 d., ant maisto produkto pakuotės turi būti išskirtos medžiagos, pasižyminčios alergizuojančiomis savybėmis [5].

Alegiškiems žmonėms skirti produktai turi būti kontroliuojami dėl alergenų atsitiktinio patekimo viso gamybos proceso metu. Kadangi valgomieji ledai be kazeino ir laktozės, žemės riešutų ir sojos baltymų likučių, yra gaminami Lietuvoje visai ES, tai kai kurių alergenų kontrolės užtikrinimas yra taikomas ir panaudojant kai kurių pavojingų, nepageidaujamų medžiagų

koncentracijos nustatymą imunofermentinės analizės metodu, kuris leidžia ledų gamyboje patikrinti alergizuojančias medžiagas ne tik kokybiškai, bet ir kiekybiškai, nustatant mažiausiais koncentracijas, kurios gali būti laikomos pavojingos alergiškiems žmonėms.

Nors įprastinių valgomųjų ledų pagrindinė sudedamoji dalis yra pienas ir jo produktai (dažniausiai karvės pienas), tačiau šiuo metu valgomieji ledai pagaminami pakeičiant pieną ir jo produktus kitomis alternatyvomis, tokiomis kaip ryžių pienu, soja. Valgomieji ledai taip pat be gliuteno, riešutų likučių. Šios gaminių linijos orientuotos į padidintos rizikos žmonių grupes. Deklaruojant šią informaciją ant gaminio pakuotės būtinas griežtas alergenų valdymas gamyboje bei pagamintų partijų tyrimai ieškomų alergenų atžvilgiu. Kai kurių alergenų identifikavimui gali būti naudojami ir imunologiniai metodai, kurie ne visada būna tinkamai išbandyti ir įvertinti gamybos įmonėje.

Atsižvelgiant į maisto alergijų aktualumą visuomenėje šio darbo tikslas – išbandyti ir įvertinti kiekybiškai imunofermentinės analizės metodą (IFA), kai kurioms alergijas sukeliančioms medžiagoms nustatyti, padidintoms rizikos žmonių grupėms ledų gamybos procese. Tyrimai buvo atliekami su 3 iš pagrindiniais maisto alergenų – kazeinu (karvės pienas), soja, žemės riešutais, kurie dėl sukeliamų alergijų dažnumo, įeina į alergenų „didįjį aštuonetą“.

Darbo tikslui pasiekti, norint teoriškai apskaičiuoti, koks alergeno kiekis yra pakankamas patekti į visą mišinio partiją, siekiant gaminiuose aptikti alergenų likučius buvo naudoti eksperimentiniai mėginiai su žinomomis alergenų koncentracijomis.

Darbo tikslui pasiekti buvo įvykdyti šie uždaviniai:

 Nustatytas kazeino likučių kiekis esant skirtingoms pieniškų ledų mišinio koncentracijoms valgomuosiuose sojos leduose.

 Nustatytas laktozės kiekis ir įvertinta kiekio priklausomybė tarp kazeino ir laktozės.

 Nustatytas žemės riešutų likučių kiekis esant skirtingoms žemės riešutų chalvos koncentracijoms ryžių pieno pagrindu pagamintuose valgomuosiuose leduose.

 Nustatytas sojos likučių kiekis esant skirtingoms sojos ledų mišinio koncentracijoms ryžių pieno pagrindu pagamintuose valgomuosiuose leduose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Maisto alergijos samprata

Alergija yra neįprasta/neadekvati reakcija į aplinkoje esančias medžiagas, kurios paprastai yra įprastos: maisto produktus, namų dulkes, naminių gyvūnėlių kailį, mikroskopinius grybus, augalų žiedadulkes, buitines chemines medžiagas, vaistus ir kt. Todėl labai svarbu pažinti alergiją, nes tai – visuomenės sveikatos problema [1].

Alergijos terminas laiko atžvilgiu šiek tiek pakito ir dar šis terminas yra tolygus padidėjusiam jautrumui; alergija, arba padidėjęs jautrumas, - tai sustiprėjęs imuninės sistemos atsakas į išorines antigenines ar alergines medžiagas [6].

Maisto produktai gali sukelti įvairiausių nepageidaujamų reakcijų – tai vadinama padidėjusiu jautrumu maistui. Viena iš šių nepageidaujamų reakcijų yra alergija maistui. Alergija maistui apibrėžiama kaip imuninis atsakas į tam tikrą maisto produktą [7]. Europos alergologų ir klinikinių imunologų akademijos (angl. European Academy of Allergology and Clinical Immunology, EAACI) siūlymu, 2001 m. priimta nauja alerginių ligų nomenklatūra. Pagal ją, alergija maistui priskiriama padidėjusiam jautrumui maisto produktams, ir gali būti imunoglobulino E (IgE) sukelta arba ne IgE sukelta alergija maistu; padidėjusiam jautrumui maisto produktams taip pat priskiriamas padidėjęs nealerginis jautrumas maistui (ankščiau - maisto netoleravimas) (1 pav.) [8-10]. Pagal Tarptautinę ligų klasifikaciją (TLK-10) alergijos maistui kodas T78 (žalingi padariniai, kitur neklasifikuojami): T78.0 – anafilaksinis šokas dėl žalingos reakcijos į maistą, T78.1 – kitos žalingos reakcijos į maistą, neklasifikuojamos kitur bei kiti pakodžiai [11].

1 pav. Padidėjusio jautrumo maisto produktams skirstymas pagal alerginių ligų nomenklatūrą.

IgE sukeltos reakcijos, kitaip vadinamos greitojo tipo, metu susidaro specifiniai IgE antikūnai maisto alergenams, o klinikiniai simptomai dažniausiai pasireiškia per 2 val. Lėtojo tipo, t.y.

nedalyvaujant IgE, dalyvauja kitų klasių specifiniai imunoglobulinai, imuniniai kompleksai ar ląstelės, o klinikiniai simptomai pasireiškia per 24 -72 val. [7, 12].

Nepageidaujamos reakcijos į maistą taip pat gali būti toksinės. Jas sukelia maiste atsiradusios įvairios kenksmingos medžiagos, patekusios jį ruošiant, maisto priedai, teršalai [13].

1.2 Maisto alergenai

Alergiją sukelia įvairios medžiagos, kurios yra vadinamos alergenais. Alergenas – tai antigenas, sukeliantis alerginę reakciją. Daugelis alergenų yra baltymai, dažniausiai su šoninėmis angliavandenių grandinėmis. Baltymo alergiškumas (gebėjimas sukelti alergines reakcijas) priklauso nuo epitopų skaičiaus (alergeno dalių, sąveikaujančių su specifiniais antikūnais ar T limfocitais). Alergenai gali būti visos medžiagos, esančios žmogaus aplinkoje, išskyrus fizinius veiksnius (šaltį, karštį, drėgmę ir t.t.). Bet kuris maisto produktas gali sukelti alergiją, ir šiuo metu žinoma daugiau nei 120 įvairiausių tokių maisto produktų [14].

Alergenai skirstomi į dvi grupes: infekcinius ir neinfekcinius. Maisto alergenai priklauso neinfekciniams ir gali įjautrinti organizmą, patekę per virškinamąjį traktą, odą, įkvėpus alergenų, kurie kryžmiškai reaguoja su tam tikrais augaliniais alergenais. Manoma, kad ir ore esantys alergenai, patekę į burną ar nosiaryklę, nuryjami gali įjautrinti organizmą bei sukelti alerginį uždegimą virškinamajame trakte [15, 16].

Maisto alergenais vadinamos medžiagos, kurios: 1) sąveikauja su IgE antikūnais; 2) sukelia alerginę reakciją; 3) sukelia alerginę sensibilizaciją.

Maisto alergenai skirstomi į pirmosios ir antrosios klasės alergenus. Pirmosios klasės alergenai yra vandenyje tirpūs glikoproteinai, kurie yra atsparūs karščiui, rūgščių ir proteazių poveikiui. Būdingiausi pirmosios klasės alergenai – karvės pieno baltymai, vištos kiaušinio baltymas, žemės riešutų, žuvies baltymai, kai kurie obuolių, javų alergenai. Dauguma antrosios klasės alergenų yra neatsparūs karščiui augalinės kilmės baltymai. Juos sunku išgryninti, todėl iš šių alergenų sunku pagaminti standartizuotus kokybiškus ekstraktus diagnostiniams mėginiams. Antrosios klasės alergenams būdingos kryžminės reakcijos su įkvepiamais alergenais. Šiai klasei būdingiausi alergenai - bananai, kiviai, avokadai, vyšnios, morkos, salierai, bulvės. Kai kurių pirmosios ir antrosios klasės maisto alergenų struktūra yra nustatyta, pagrindiniai alergenai identifikuoti, išgryninti ir koduoti. Rekombinantinių alergenų atradimas žada geresnę in vivo ir in vitro alergijos maistui diagnostiką bei gydymą [13].

Maisto alergenai gali būti gyvulinės arba augalinės kilmės, ir jie būdingi tam tikrai geografinei zonai. Svarbiausieji maisto alergenai yra: pienas, kiaušiniai, grūdiniai, turintys gliuteno, riešutai, soja, žuvis, mėsa, vėžiagyviai, uogos, vaisiai, daržovės, prieskoniai ir kt. [16]. JAV 8 maisto produktai sukelia 90 proc. visų alergijų maistui, dėl to jie dažnai vadinami „didžiuoju

aštuonetu“ – tai pienas, kiaušiniai, žemės riešutai, kiti riešutai, grūdiniai, žuvis, vėžiagyviai, soja [17-19].

Daugeliui mokslinių tyrimų centrų Europoje, taip pat ir Vilniaus universitetui, vykdant ES finansuojamą projektą „EuroPrevall“ (angl. The Prevalence, Costs, and Basis of Food Allergy

across Europe), kuriuo siekiama ištirti sąveikas tarp maisto patekimo į organizmą, jo metabolizmo,

imuninės sistemos veiklos, genetinio fondo ir socioekonominių veiksnių bei nustatyti esminius rizikos veiksnius maisto sukeltoms ligoms bei alergijoms atsirasti ir sudaryti rizikos veiksnių bendrą duomenų bazę, yra sukurta „InformAll“ duomenų bazė. Joje sukaupta informacija apie daugelį maisto produktų, galinčių sukelti alergiją, taip pat sukeliamos alergijos klinikines charakteristikas (pvz.: simptomai, diagnostika) bei alergenų biochemines savybes [16]. Čia maisto produktai klasifikuojami į grupes: pienas ir kiaušiniai, vaisiai, daržovės, žuvis, riešutai, grūdiniai, ankštiniai, prieskoniai ir žolelės, vėžiagyviai, kiti.

Maisto apdorojimo būdas taip pat turi įtakos alerginio maisto produktų savybėms. Verdamos daržovės ir vaisiai dažnai praranda alergizuojančiąsias savybes, tačiau dauguma žuvies, mėsos, vėžiagyvių, kiaušinių, grūdų alergenų yra atsparūs temperatūros poveikiui. Pavyzdžiui, skrudinti žemės riešutai stipriau alergizuoja nei virti. Tai galėtų paaiškinti kodėl JAV, kur beveik kiekvienas vaikas iki 2 metų valgo žemės riešutų sviestą, plačiai paplitusi alergija žemės riešutams. Tačiau Kinijoje alergija žemės riešutams yra reta, nors turi panašų kontaktą su šiais riešutais, tik jie maistui vartojami virti [13].

Maisto alergenai gali sukelti ir pseudoalergines reakcijas. Dažniausiai tokias reakcijas sukelia maisto produktai, turintys daug: 1) histamino (švieži produktai – pomidorai, špinatai, vėžiagyviai, lašiša, apelsinai; apdoroti maisto produktai – fermentiniai sūriai, kiauliena, konservuotas tunas, dešrelės, alus); 2) tiramino ir feniletilamino (šokoladas, raudonasis vynas, konservuota žuvis, fermentinis sūris); 3) histaminą atpalaiduojančių produktų (braškės, kiaušinio baltymas, kiauliena, cinamonas, šokoladas, ananasas, papaja, ankštiniai [6].

Prieskoniai ir žolelės, ypač naudojami švieži sezono metu, taip pat gali turėti alergenų, pvz.: anyžių sėklos, česnakas, garstyčios. Paprastai jie vartojami nors ir nedideliais kiekiais, tačiau gali sukelti gyvybei pavojingas būkles. Dažnai virimas ar kepimas gali padėti išvengti reakcijos [16].

1.3 Alerginių ligų rizikos veiksniai

Šiuo metu yra identifikuojama daugybė maisto alergijos rizikos veiksnių, tačiau dar nemažai jų vertinami prieštaringai. Gyvenimo būdas turi didelę įtaką alergijos vystymuisi, nes atlikti duomenys rodo, kad besivystančiose šalyse alergija yra kur kas dažnesnė tarp žmonių, gyvenančių geresnėmis socialinėmis sąlygomis, pvz., alergija mažiau paplitusi tarp Jungtinės Karalystės

gyvenančių vaikų, migravusių iš Vakarų Indijos, negu tarp jų brolių ir seserų, gimusių Anglijoje [20]. Todėl manoma, kad aplinkos sąlygos didžiausią įtaką turi ankstyvojoje vaikystėje.

Moksliniais tyrimais pagrįsta, kad vienas iš pagrindinių rizikos veiksnių, lemiančių alerginių ligų išsivystymą, yra paveldimumas [4, 21-23]. Tiriant alergiškus vaikus Vilniaus mieste, buvo išaiškinta, kad šeimose, kuriose buvo alergija sergančių šeimos narių, vaikų, sergančių vienokia ar kitokia maisto alergija, buvo 2 kartus daugiau negu šeimose, kuriose nėra tokių asmenų [2]. Danijoje buvo atliktas tyrimas su dvyniais, ir jo nustatyta, kad taro monozigotinių dvynių, net 85,0 proc., porų sirgo viena ar kita liga, lyginant su 21,1 proc., dizigotinių dvynių [24]. Tačiau vien genetinis polinkis sirgti alerginėmis ligomis negalėjo daryti įtakos taip sparčiai didėjančiam alerginių ligų paplitimui. Manoma, kad per pastaruosius keturis dešimtmečius nuolat didėjančiam dažniausių vaikų alergijų paplitimui didžiausios įtakos turėjo genetinių ir aplinkos veiksnių tarpusavio sąveika [4, 25-27].

Yra žinoma, kad pastaraisiais dešimtmečiais labai padidėjo antibiotikų vartojimas, gydant vaikų viršutinių kvėpavimo takų infekcijas. Daugelis autorių mano, kad antibiotikai sukelia žarnyno mikrofloros pokyčius, sudaro palankias sąlygas dominuoti Staphylococcus aureus ir koliforminėms bakterijoms, kurios gali skatinti alerginių ligų išsivystymą. Taip pat vyrauja nuomonė, kad kaime vartojamas natūralus, termiškai neapdorotas pienas, turintis daugiau bakterijų, o ypač Lactobacillus, pasižymi apsauginiu poveikiu alerginėms ligoms. Įrodyta, kad prebiotikų skyrimas sergantiems atopiniu dermatitu vaikams pagerina ligos eigą [28].

Tyrimų rezultatai įrodo, kad natūralus maitinimas per pirmuosius šešis mėnesius gali apsaugoti nuo daugelio alerginių ligų išsivystymo. Tai lemia ilgųjų grandinių riebiosios rūgštys, dalyvaujančios slopinant uždegiminį procesą, ir motinos piene esantis imunoglobulinas A (IgA), padedantis kovoti su infekcijomis [4, 23]. Vaikų alergija karvės pienui, kuri buvo ypač dažna XX a. pirmajame ketvirtyje dėl ypač dažno vaikų maitinimo karvės pieno mišinukais, šiuo metu ženkliai mažėja, kadangi populiarėja natūralus maitinimas. Vaikai, kurie bent 3 mėnesius buvo natūraliai maitinti, rečiau sirgo atopiniu dermatitu būdami vienų metų amžiaus [3].

2007 metais Kanadoje buvo atliekamas mokslinis tyrimas norint nustatyti mažo gimimo svorio (MGS) įtaką maisto alergijoms išvystyti. Buvo remtasi faktu, kad prieš laiką gimusieji arba MGS naujagimiai turi padidėjusį žarnų pralaidumą. Tačiau tyrimo hipotezė buvo atmesta, kadangi iš daugiau nei 13000 MGS naujagimių, kurie buvo stebėti nuo 1995 iki 2002 m., tik 4,23 proc. išsivystė alergija maistui. Buvo paskelbta išvada, kad nei nėštumo trukmė, nei kūdikio gimimo svoris nėra rizikos veiksniai maisto alergijoms išsivystyti [29].

Buvusioje Rytų Vokietijoje skirtinguose miestuose tirti 5 - 14 metų amžiaus vaikai. Nustatyta, kad per septynerius metus (1992-1999) žymiai padaugėjo vaikų, įsijautrinusių bent vienam iš pagrindinių kvepiamųjų alergenų, taip pat padidėjo įsijautrinimo lygis, dėl kurio galėjo prasidėti

vienos ar kitos ligos klinikinis pasireiškimas. Nustatyta, kad padidėjo bronchų astmos, alerginio rinito ir atopinio dermatito paplitimas, o ypač tarp vaikų, kurie gimė po Vokietijos sujungimo. Manoma, kad būtent šie vaikai ankstyvoje vaikystėje buvo labiausiai paveikti vakarietiško gyvenimo būdo [30]. 1997 m. ištyrus 10163 5-7 metų amžiaus vaikus, paaiškėjo, kad mieste gyvenantys vaikai žymiai dažniau sirgo bronchų astma, alerginiu rinitu ir atopiniu dermatitu ar nurodė jiems būdingus simptomus negu kaime gyvenantys bendraamžiai. Manoma, kad malkų naudojimas patalpoms šildyti ir maistui ruošti, dažnesnis kontaktas su įvairiomis bakterijomis, kur kas retesnis antibiotikų vartojimas turėjo įtakos rečiau sirgti alerginėmis ligomis [31, 32].

Norėdami įvertinti ar pirminė profilaktika naujagimystės laikotarpiu gali apsaugoti nuo įsijautrinimo maistui ir buitiniams alergenams bei bronchų astmos išsivystymo, S. H. Arshadas su kolegomis [33] tyrinėjo alergiškų mamų vaikus, turinčius didelę riziką sirgti bronchų astma. Ištyrus tiriamosios ir kontrolinės grupių vaikus (8 metų amžiaus), išvadose pateikta, kad griežtas alergenų vengimas kūdikystėje didelės rizikos vaikams sumažina pavojų įsijautrinimui ir gali apsaugoti nuo bronchų astmos išsivystymo [34].

Honkonge ir Kinijoje atlikus I ir III ISAAC tyrimus (1995 ir 2002 m.), paaiškėjo, kad kontinentinėje Kinijoje gimę vaikai bronchų astma sirgo kur kas rečiau negu gimė Honkonge [35]. Manoma, kad kontinentinėje Kinijoje yra žemesnis pragyvenimo lygis, todėl vaikai ankstyvoje vaikystėje rečiau susiduria su dažniausiais alergenais, kurie gali lemti vienos ar kitos alerginės ligos išsivystymą [36].

Turkijoje 1992-2002 m. tirti 6-14 metų amžiaus vaikai. Per paskutiniuosius penkerius tyrimo metus labai sumažėjo atopinio dermatito, bronchų astmos ir alerginio rinito paplitimas. Tyrėjų nuomone, tam įtakos turėjo per paskutiniuosius dešimtį metų šalyje pagerėjusi oro ir maisto kokybė, padidėjęs žaliųjų plotų kiekis bei sumažėjęs pasyvus rūkymas tarp vaikų [37].

Švedijoje, ištyrus apie 130000 1952-1981 m. gimusių šauktinių, paaiškėjo, kad per paskutiniuosius tris dešimtmečius bronchų astmos, alerginio rinito ir atopinio dermatito paplitimas nuolat didėjo tarp kaime, ir tarp mieste gyvenančių žmonių, tačiau kaime gimę ir augę vyrai rečiau sirgo minėtomis ligomis negu miestiečiai. Tyrėjų nuomone, minėtam ligų paplitimui turėjo įtakos ne tik sparti pramonės plėtra, bet ir esminiai struktūriniai pokyčiai kaime [38].

Alerginių ligų paplitimo skirtumai tarp kaimo bei miesto vaikų tirti ir Lietuvoje. Vilniaus universiteto mokslininkai, naudodami ISAAC tyrimo klausimynus, 1998-1999 m. tyrė Utenos miesto ir rajono 6-7 ir 13-14 metų amžiaus vaikus. Paaiškėjo, kad 6–7 metų amžiaus kaime gyvenantys vaikai žymiai rečiau nurodė bronchų astmai, alerginiam rinitui ar atopiniam dermatitui būdingus simptomus negu bendraamžiai, gyvenantys mieste. Vyresniųjų moksleivių grupėje reikšmingų alerginių ligų paplitimo skirtumų tarp kaimo ir miesto gyventojų nenustatyta [39].

1.4 Sergamumas maisto alergijomis

Pastaraisiais dešimtmečiais pastebimai didėja sergamumas maisto alergijomis. Tyrimai, atlikti buvusiose Rytų ir Vakarų Vokietijoje, parodė, kad yra nemažai skirtumų tarp Vakarų Europos ir Rytų Europos, ypač pokomunistinių jos šalių, gyventojų sergamumo alerginėmis ligomis. Senosiose Europos Sąjungos šalyse jos vargina apie 35 proc. žmonių. Manoma, kad taip yra dėl sterilios žmonių supančios aplinkos ir oro užterštumo. Vartojama vis naujų maisto produktų, medikamentų, pramonėje ir aplinkoje naudojama vis daugiau cheminių medžiagų. Tokiomis sąlygomis atsiranda naujų alergenų, be to, kinta jau žinomi [2, 40].

Remiantis apklausos duomenimis, nuo 5 iki 35 proc. suaugusiųjų mano, jog jie ar jų vaikai kenčia nuo alergijos maistui, tačiau atliktų tyrimų duomenimis, maistui alergiški 6-8 proc. mažų vaikų (iki 3 metų), 3-5 proc. vyresnių vaikų ir 1,5-3 proc. suaugusiųjų. Pažymėtina, kad alergija maistui dažniau nustatoma žmonėms, sergantiems kitomis atopinėmis ligomis: alergija maistui diagnozuojama 33-40 proc. vaikų ir jaunuolių, sergančių vidutinio sunkumo ir sunkiu atopiniu dermatitu, ir apie 6-17 proc. vaikų, sergančių astma [13, 41, 42].

JAV maisto alergija serga 6-8 proc. vaikų iki 4 metų amžiaus ir apie 3-4 proc. suaugusiųjų – tai daugiau nei 12 mln. gyventojų, arba vienas iš 25 [18, 43, 44]. Tarp vaikų šioje šalyje alergijos maistui paplitimas per 1997-2007 m. išaugo 18 proc. [45].

R. J. Rona’os ir kitų mokslininkų [46] atliktos metaanalizės duomenimis (apžvelgta per 900 publikacijų alergijos maistui paplitimo tema nuo 1990 m.), nustatyta, kad kuriam nors maistui alergiškų yra 2-4 proc. žmonių, tačiau atsižvelgiama į regioną, pasirinktus tyrimo metodus, maisto alergijų paplitimas gali varijuoti tarp 3-35 proc.

Kad apskritai alergijos simptomai kur kas labiau paplitę Vakarų Europoje, net ir neužterštuose kaimiškuose rajonuose, negu buvusiose socialistinėse šalyse Vidurio ir Rytų Europoje bei Suomijoje, įskaitant pramoninius Lenkijos, Estijos bei Rusijos miestus, patvirtino ISAAC studijų rezultatai [47]. Prancūzijos miesto (Tulūzos) mokyklose atlikto tyrimo duomenimis, vaikų sergamumas alergija maistui buvo lygus 6,7 proc. [48]. O Vilniuje atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad maisto alergijos paplitimas tarp moksleivių buvo beveik dvigubai didesnis - 12,8 proc. [2].

Maisto alergijų paplitimas priklauso ir nuo šalies gyventojų valgymo įpročių: alergija sojos baltymams dažnesnė Japonijoje, žemės riešutams – JAV ir Didžiojoje Britanijoje, alergija žuvies baltymams – Skandinavijos šalyse ir Ispanijoje, citrusiniams vaisiams – Izraelyje ir Ispanijoje, lęšiams – Ispanijoje, sraigėms – Italijoje ir Ispanijoje, atogrąžų vaisiams – Pietryčių Azijos šalyse [13].

1.4.1 Specifinių IgE tyrimų reikšmė diagnozuojant alergiją

Kraujotakoje cirkuliuojantys IgE antikūnai gyvuoja trumpai – jų pusinės eliminacijos laikas tik 2,5 dienos. Todėl cirkuliuojančių IgE matavimas (bendrų ir specifinių) atspindi tik naujai

pasigaminusius IgE, taigi parodo tik šiuo metu esantį imuninį aktyvumą. Tai gali būti viena iš priežasčių, kodėl kartais ne visai sutampa odos dūrio tyrimo ir IgE matavimo in vitro rezultatai.

Priešingai nei tyrimai in vitro, odos testai priklauso ne tik nuo IgE antikūnų, bet dar ir nuo putliųjų ląstelių būklės, kraujagyslių bei nervinio jautrumo bei odos būklės, vartojamų vaistų. Odos testai nėra kiekybiniai, todėl sunku palyginti įvairiose vietose ir skirtingu laiku atliktų tyrimų rezultatus.

Dažniausiai neužtenka nustatyti tik bendrų IgE koncentraciją, reikia išsiaiškinti tiksliai, koks arba kokie alergenai sukelia alerginę reakciją ir pageidautina – kokio stiprumo reakciją sukelia kiekvienas iš šių alergenų. Tam matuojami alergenams specifiški IgE. Pasitaiko atvejų, kai bendrų IgE kiekis mažas (normalus), o alergenams specifiškų IgE randamos kliniškai reikšmingos koncentracijos. Pagal gautą endogeninio IgE kiekį (kU/l) specifiniam alergenui išskiriamos klasės ir vertinimas (1 lentelė) [49].

1 lentelė. Pagal gautą endogeninio IgE kiekį (kU/l) specifiniam alergenui išskiriamos klasės ir vertinimas [49].

Klasė kIU/l Vertinimas

0 <0,35 Neigiama reakcija, nerasta specifinių antikūnų.

I 0,35-0,7 Labai silpna reakcija, sensibilizacijos atveju dažniausiai nebūna jokių klinikinių požymių.

II 0,7-3,5 Silpna reakcija, sensibilizacija su klinikiniais požymiais galima viršutiniame šios klasės lygyje.

III 3,5-17,5 Aiški antikūnų detekcija, dažniausiai su klinikiniais požymiais.

IV 17,5-50 Teigiama reakcija, stipri antikūnų detekcija, beveik visada su klinikiniais požymiais. V 50-100 Labai stipriai teigiama reakcija, aukšta antikūnų koncentracija.

VI 100 ir > Labai stipriai teigiama reakcija, ypač aukštas antikūnų titras.

1.4.2 Maisto alergijos kaip visuomenės sveikatos problema

Alerginės ligos yra vis didėjanti sveikatos problema. Apie alergijas kalbama ir svarbiausiame Europos sveikatos politikos dokumente „Sveikata visiems XXI amžiuje“. Jos tampa labai svarbia sveikatos problema. Jų, kartu su neužkrečiamosiomis ligomis stebėsenai siūloma formuoti rodiklius, o 8-uoju tikslu siekiama mažinti neužkrečiamąsias ligas: iki 2020 m. visame regione iki mažiausio įmanomo lygio turi būti sumažintas sergamumas, negalia ir priešlaikinės mirtys dėl pagrindinių lėtinių ligų [50].

Daugumai vaikų ir suaugusiųjų bent kartą gyvenime ar dažniau kyla tam tikrų nepageidaujamų reakcijų į maistą [13]. Vaikai, sergantys alergija maistui, nuo 2 iki 4 kartų dažniau serga astma ir kitomis alergijomis. 27 proc. sergančiųjų skundžiasi dėl egzemos ar kitos odos

alergijos (palyginti su nesergančiais – 8 proc.), daugiau kaip 30 proc. sergančiųjų taip pat skundžiasi dėl kvėpavimo sistemos alergijos (tarp nesergančiųjų – 9 proc.) [19]. JAV 2003-2006 m. dėl maisto alergijų buvo apie 317 000 vizitų ir skubių iškvietimų, o 2004-2006 m. – 150-200 mirčių per metus [45].

Kadangi nustatyto maisto produkto nevartojimas yra pats pagrindinis ir veiksmingiausias alergijos maistui gydymas, tai lemia pacientų gyvenimo kokybę, taip pat ir jų šeimas, draugus, kitus asmenis, pvz., vaikų mokytojus [15].

Visame pasaulyje kalbama apie itin didelę ekonominę alerginių ligų žalą. Alergija įtraukia visą visuomenę, kadangi skaičiuojamos išlaidos, tokios kaip pinigai sveikatos paslaugoms, hospitalizavimui, medikamentams, bei išlaidos – už prarastas dienas mokykloje, tėvų praleistos darbo valandos. Australijos mokslininkai atliko tyrimą, kurio tikslas buvo paskaičiuoti, kiek valstybei kainuoja karvės pieno netoleruojantys pacientai. Tyrimo metu 6 mėnesius stebėta 6150 kūdikių, įvertinant visas išlaidas. Šios šalies sveikatos biudžetui tai kainavo 6,5 mln. Australijos dolerių (skaičiuota 2006-2007 m. kainomis). Daugiausiai išlaidų pareikalavo specialaus maitinimo organizavimas klinikose (62 proc.), bei vizitai pas specialistus (28 proc.) [51]. JAV mokslininkų paskaičiavimais, alerginis rinitas, kuris vargina apie 10-25 proc. populiacijos, 2002 m. valstybei ir jos gyventojams kainavo 4,863 mlrd. dolerių [52]. Tai viena iš daugelio svarių priežasčių, kodėl šių ligų gydymas ir prevencija yra vienas pagrindinių šiuolaikinės visuomenės sveikatos, mokslo ir medicinos bendruomenės iššūkių [53].

Finansinė ir socialinė šios problemos kaina vis didėja, tačiau dauguma šiuolaikinių mokslinių tyrimų yra skirti galimų sprendimo būdų paieškai – kaip palengvinti alergijos sergančių pacientų gyvenimą [54]. Turinčių alergijas maistui pacientų nukenčia gyvenimo kokybė, alergiški žmonės turi priprasti prie papildomo diskomforto, kadangi nuolatos turi kontroliuoti tai, ką valgo, todėl iškyla papildomų sunkumų socialiniame gyvenime. Pacientų (arba alergišku vaikų tėvų) nerimas dėl galimų sunkių reakcijų gali nulemti socialinę izoliaciją ar psichinės sveikatos problemas [55]. Švedijos mokslininkų, tyrusių netoleruojančių maisto vaikų ir jų šeimų gyvenimo kokybę, susijusią su sveikata, duomenimis, kuo didesnis skaičius negalavimų, sukeltų dėl suvalgyto maisto, kankina vaiką, tuo žemesnis vaiko gyvenimo kokybės rodiklis, tuo labiau prastėja ir tėvų gyvenimo kokybė, tuo stipriau sutrikdomas tokių šeimų kasdieninis gyvenimas, rezultatai parodė, kad alergiškų vaikų gyvenimo kokybei pablogėti didesnės įtakos turi ne tikroji klinikinė organizmo reakcija į maisto alergeną, o galimos rizikos suvokimas, baimė, kad suvalgius tam tikro maisto įvyks alerginė reakcija, kad nuo šiol reikės imtis ir nuolatos laikytis atitinkamų priemonių, keisti įprastą gyvenimo būdą tam, kad išvengtų šių nepageidaujamų simptomų. Todėl tiek alergija, tiek tiesiog padidėjęs jautrumas produktui vertinama kaip stiprus psichosocialinis veiksnys [56].

ES finansuojamo jungtinio projekto „EuroPrevall“ metu atlikus analizę pagal specializuotus gyvenimo kokybės tyrimo klausimynus buvo nustatyta, kad kasdienis gyvenimo ritmas yra labiau sutrikdomas asmenims, alergiškiems žemės riešutams, negu asmenims, sergantiems reumatinėmis ligomis. Taip pat ištirta, kad šeimų, kuriuose yra bent vienas vaikas, alergiškas maistui, kasdienė veikla ir laisvalaikis buvo ženkliai apriboti [57].

1.5 Alergenų ženklinimą reglamentuojantys teisės aktai

Net mažas maisto produkto kiekis ar likutis jautriems vartotojams gali sukelti reakciją, todėl Europos Sąjungoje maisto gamintojams ir importuotojams yra nustatyti reikalavimai dėl sudedamųjų dalių, galinčių sukelti alergijas, ženklinimo. Ženklinimo reikalavimai parengti pagal Maisto kodekso komisijos maisto ženklinimo komiteto (angl. Codex Alimentarius Commission

Committee on Food Labeling) rekomendacijas ir Europos Sąjungoje galioja Europos Parlamento ir

Tarybos direktyva 2000/13/EB dėl valstybių narių įstatymų, susijusių su maisto produktų ženklinimu, pateikimu ir reikalavimu, derinimo (angl. Directive 2000/13/EC of the European

Parliament and of the Council of 20 March 2000 on the approximation of the laws of the Member States relating to the labeling, presentation and advertising of foodstuffs), nustatanti reikalavimus

gamintojams deklaruoti esamas sudedamąsias dalis. Ši direktyva turi daug pakeitimų, tačiau su alergenais susiję šie svarbiausi - Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2003/89/EB iš dalies pakeičianti Direktyvą 2000/13/EB dėl maisto produktuose esančių komponentų nurodymo ir Komisijos direktyva 2007/68/EB, iš dalies keičianti Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2000/13/EB ІІІa priedą dėl tam tikrų maisto sudedamųjų dalių. Minėtame ІІІa priede pateikiamas maisto produktų sudedamųjų dalių, galinčių sukelti alergiją ir kurios privalo būti ženklinamos, sąrašas. Lietuvoje galioja Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 2002 m. gruodžio 24d. įsakymu Nr. 677 patvirtinta Lietuvos higienos norma HN 119:2002 “Maisto produktų ženklinimas“ (Žin., 2003, Nr, 13-530), kuri perkelia Europos Sąjungos teisės aktų nuostatas. Šioje higienos normoje nurodoma, kad ženklinimo informacija turi būti pateikiama gerai matomoje maisto produktų pakuotės vietoje, lengvai įžiūrima, neištrinama, ryški, neuždegta kitais įrašais arba piešiniais, tačiau nėra numatyta konkrečių išmatuojamų jos įskaitomumo įvertinimo kriterijų. Išsamus maisto produktų sudedamųjų dalių, kurių ženklinimas yra reglamentuojamas Lietuvoje ir Europos Sąjungoje, sąrašas pateikiamas 2 lentelėje. JAV tai pat galioja panašus Maisto alergenų ženklinimo ir vartotojų apsaugos įstatymas [58, 59].

2011 m. spalio 25 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (ES) Nr. 1169/2011 dėl informacijos apie maistą teikimo vartotojams, kuriuo iš dalies keičiami Europos Parlamento ir Tarybos reglamentai (EB) Nr. 1924/2006 ir (EB) Nr. 1925/2006 bei kuriuo panaikinami Komisijos direktyva 87/250/EEB, Tarybos direktyva 90/496/EEB, Komisijos direktyva 1999/10/EB, Europos

Parlamento ir Tarybos direktyva 2000/13/EB, Komisijos direktyvos 2002/67/EB ir 2008/5/EB bei Komisijos reglamentas (EB) Nr. 608/2004 (OL L 304, 2011 11 22, p. 18–63). Reglamento (ES) Nr. 1169/2011 paskesni daliniai pakeitimai ir pataisos buvo įterpti į pradinį tekstą. Reglamentas taikomas nuo 2014 m. gruodžio 13 d., kurio pagrindinės naujovės: aiškiai apibrėžtos atsakomybės, praplėstas privalomų pateikti duomenų sąrašas, atsirado naujos nuostatos dėl alergenų, nefasuotų maisto produktų ženklinimas. Prieš šio reglamento atnaujinimą, nefasuotiems gaminiams alergenų ženklinimas nebuvo reglamentuojamas. Ant pakuotės turi būti nurodytos visos alergiją ar netoleravimą sukeliančios medžiagos, naudojamos gaminant ar ruošiant maisto produktą ir išliekančias galutiniame produkte, nors ir pakitusiu pavidalu [60].

Pagal direktyvą 2007/68/EB, ženklinant turi būti nurodyti pripažinti maisto alergenai. Šios direktyvos ir direktyvos 2000/13/EB reikalavimai yra perkelti į nacionalinį teisės aktą – Lietuvos higienos norma HN 119:2002 „Maisto produktų ženklinimas“. Visi privalomi ženklinti maisto produktai – alergenai išvardinti minėtos higienos normos 5 priede [58]. Sudedamosios dalys, kurių ženklinimą reglamentuoja HN 119 :2002 „Maisto produktų ženklinimas“ 5 priedas (2 lentelė).

Šiuo metu mokslininkų atliekamų mokslinių tyrimų maisto alergijų kiekio (koncentracijos) slenksčio (minimalios dozės, kuri gali sukelti reakciją) nustatymas ir pagrindimas, tiriant atskirus individus, tam tikrą imtį, ir pritaikant rezultatus visai populiacijai, - jų pagrindu keičiami, tobulinami privalomieji reikalavimai, teisės aktai [61]. Taigi alergijos maistui pripažinimas aktualia visuomenės sveikatos problema leidžia kalbėti apie reikalingą ir tinkamą alergenų valdymą – jų ženklinimą, tinkamą informacijos pateikimą vartotojui, tolimesnius tyrimus alergenų slenksčiams nustatyti.

Yra nustatytos, tačiau nepatvirtintos alergenų likučių normos maistų produktuose, kurios turėtų nesukelti alerginės reakcijos ir vartotojas turėtų būti saugus;

1) celiakija (gliuteninė enteropatija): 10 – 100 mg gliadino per dieną; 2) alergija grūdinėms kultūroms: 0,4 – 10 g grūdinės kultūros; 3) vėžiagyviai: 14 g krevečių; 32 mg baltymo; 4) žuvis priklausomai nuo rūšies: 5 mg – 6 g; 5) vištų kiaušiniai: 0,1 – 200 mg baltymų; 6) žemės riešutai: 0,1 – 3 mg baltymai; 7) soja: 0,0013 – 500 mg sojos miltų; 8) karvės pienas: 0,5 – 50 ng baltymų / mL 23; 9) riešutai: 1 – 100 mg baltymų; 10) salierai: 0,7 – 5 g salierų; 11) garstyčios: 0,8 mg baltymų; 12) sezamas: 12,4 mg baltymų; 13) lubinai: 265 – 1000 mg lubinų miltų; 14) moliuskai 120 – 400 mg sausos sraigės [62].

2 lentelė. Maisto produktų sudedamosios dalys, kurių ženklinimą reglamentuoja ES ir Lietuvos Respublikos teisės aktai. HN 119 :2002 „Maisto produktų ženklinimas“ 5 priedas.

Eil. nr

Produktai Išimtys

1. Glitimo turintys javai (t. y. kviečiai, rugiai,

miežiai, avižos, kviečiai spelta, kamutas arba jų sukryžmintos atmainos ir jų produktai

Išskyrus:

1.1. kviečių pagrindu pagamintą gliukozės sirupą, įskaitant gliukozę ir jų produktus, jei dėl apdirbimo proceso nepadidėja Europos maisto saugos tarnybos įvertintas alergeniškumo lygis, taikomas atitinkamam produktui, iš kurio jie pagaminti;

1.2. kviečių pagrindu pagamintą maltodekstriną ir jo produktus, jei dėl apdirbimo proceso nepadidėja Europos maisto saugos tarnybos įvertintas alergeniškumo lygis, taikomas atitinkamam produktui, iš kurio jie pagaminti; 1.3. miežių pagrindu pagamintą gliukozės sirupą;

1.4. javus, naudojamus distiliatų ar žemės ūkio kilmės etilo alkoholio, skirto spiritiniams gėrimams ir kitiems alkoholiniams gėrimams, gamybai.

2. Vėžiagyviai ir jų produktai

3. Kiaušiniai ir jų produktai

4. Žuvis ir jos produktai Išskyrus:

4.1. žuvies želatiną, naudojamą kaip vitaminų ar karotenoidų preparatų nešiklį;

4.2. žuvies želatiną ar žuvų klijus, naudojamus alui ir vynui skaidrinti.

5. Žemės riešutai ir jų produktai

6. Sojų pupelės ir jų produktai Išskyrus:

6.1. rafinuotą sojų pupelių aliejų ir riebalus ir jų produktus, jei dėl apdirbimo proceso nepadidėja Europos maisto saugos tarnybos įvertintas alergeniškumo lygis, taikomas atitinkamam produktui, iš kurio jie pagaminti; 6.2. natūralių tokoferolių mišinius (E306), natūralų d-alfa tokoferolį, natūralų alfa tokoferolio acetatą, natūralų d-alfa tokoferolio sukcinatą iš sojų pupelių;

6.3. iš sojų pupelių aliejaus pagamintus fitosterolius ir fitosterolių esterius;

6.4. augalinių stanolių esterius, pagamintus iš sojų pupelių aliejaus sterolių.

7. Pienas ir jo produktai Išskyrus:

7.1. išrūgas, naudojamas distiliatų ar žemės ūkio kilmės etilo alkoholio, skirto spiritiniams gėrimamas ir kitiems alkoholiniams gėrimams, gamybai; 7.2. laktitolį.

8. Riešutai, t. y. migdolai (Amygdalus

communis L.), lazdynų riešutai (Corylus avellana), graikiniai riešutai (Juglans regia),

anakardžiai (Anakardium occidentale),

karijos (Carya illinoiesis (Wangenh.) K. Koch), bertoletijos (Bertholletia excelsa),

pistacijos (Pistacia vera), makadamijos

(Macadamia ternifolia) ir jų produktai

Išskyrus:

8.1. riešutus, naudojamus distiliatų ar žemės ūkio kilmės etilo alkoholio, skirto spiritiniams gėrimams ar kitiems alkoholiniams gėrimams, gamybai.

9. Salierai ir jų produktai

10. Garstyčios ir jų produktai

11. Sezamų sėklos ir jų produktai

12. Sieros dioksidas ir sulfitai, kurių

koncentracija didesnė kaip 10 mg/kg arba 10 mg/l, išreikšti kaip SO2.

13. Lubinai ir jų produktai

1.6 Maisto alergenų nustatymo metodai

Maisto alergenų nustatymo metodai - neatsiejama maisto industrijos dalis. Metodų taikymas: nustatytų reikalavimų atitikimo patikrinimui (galutinio produkto atitiktis etiketės informacijai, maisto produktų atšaukimo veiksmai ir tyrimai, vartotojų skundų tyrimai ir patvirtinimas); žaliavų/ingredientų kryžminei kontakto kontrolei (ypač produktų su deklaruojama informacija „be alergenų“ (angl. „allergen free“ claim); alergenų kontrolės programos, specifinių valymo etapų ir pan., efektyvumo patikrinimas; mokslinių tyrimų projektai ir klinikiniai tyrimai (pvz.: hipoalerginis maistas).

Norint pasirinkti tinkamiausią metodą, būtina įvertinti šiuos kriterijus: tinkamumas pagal maisto produktų apdirbimą (perdirbtas, šviežias ir pan.), specifiškumas, kiekybinis ar kokybinis, jautrumas (aptikimo slenkstis), ar standartizuotas (pripažintas tarptautiniu mastu kaip AOAC, CEN/ISO, CODEX Alimentarius ir pan). Šių dienų patvirtinti metodai, grindžiami masių spektrometrija: bendras baltymų (alergenų) aptikimas tamponu (angl. swab method), baltymai gali būti aptinkami bet kokiame mėginyje, tačiau nespecifiškas maisto alergenams, mažas jautrumas - aptikimo riba ~ 3-20 μg baltymo; rezultatai nekoreliuojami su ELISA metodo rezultatais; ATP/bioliuminescencinis – aptinka ATP biologiniuose šaltiniuose, nespecifiškas maisto alergenams ir netgi baltymams, ATP lygis gali skirtis priklausomai nuo maisto produktų, rezultatai nekoreliuojami su ELISA metodo rezultatais; greitas (< 30 sek.) ir gali būti atliekamas vietoje „realiu laiku“ (angl. real-time); PGR – tinkantis alergenų aptikimui tiek augalinės tiek ir gyvūninės kilmės maisto produktuose, tyrimo eigoje naudojama DNR, kuri visada yra stabili nepriklausomai nuo maisto apdorojimo, tinkamas daugeliui alergiško maisto produktams bei GMO, pusiau kiekybinis, jautrus (2.5 ir 10 mg/kg alergiško maisto/viso maisto); greitas aptikimas, realaus laiko PGR leidžia aptikti kelis alergenus mėginyje, naudingas tais atvejais kur ELISA metodas negalimas arba rezultatai abejotini (pvz.: hidrolizuoti baltymai), tačiau tyrimas nepajėgus atskirti pieno ir jautienos ar kiaušinio ir vištienos, įranga brangi ir ne visose laboratorijos galima, DNR nebuvimas nenurodo baltymų nebuvimo; matuokliai ir juostelės (angl. Lateral Flow Devices and Dipstick tests) – pagrįsti antikūnais kaip ir ELISA metodas, paprastai naudojami aplinkos mėginių, valymo ir maisto patikrinimui, tinkamas daugeliui maisto alergenų, greitas ir naudojamas vietoje (<5 min.), pigesnis nei ELISA, jautrus (~ 5 ppm), vieni iš jų yra pritaikyti tik skalavimo vandeniui bet ne maistui, reikalauja patvirtinimo metodų; ELISA – populiarus maisto industrijoje, didelis specifiškumas, galimas tiek kokybinis tiek kiekybinis variantas, pakankamai jautrus (dera su esama ribine informacija ir etaloninėmis dozėmis), suderinamas visiems mėginiams (ingredientams, gataviems produktams, skalavimo vandeniui, tamponų/aplinkos mėginiams; tyrimo laikas 30 minučių – 6 valandos; proteominiai – tokie kaip LC-MS/MS [63].

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1 Mėginių paruošimas

Maisto alergenų (kazeino, sojos baltymo, žemės riešutų baltymo) ir laktozės tyrimai valgomuosiuose leduose buvo atlikti įmonės „Unilever Lietuva ledų gamyba“ laboratorijoje. Įmonė gamina ir tiekia Europos rinkai ryžių pieno bei sojos valgomuosius ledus. Šių produktų pakuotėse deklaruojama, kad produktas be pieno (įskaitant laktozę), gliuteno, žemės riešutų, o ryžių pieno valgomuosiuose leduose – ir be sojos.

2.1.1 Mėginių paruošimas kazeino likučių nustatymui

Į stiklinę tarą pasveriama po 200 g (430 ml) tiriamojo sojos valgomojo ledo. Tokiu būdu paruošiami septyni mėginiai. Į pirmą mėginį nededamas alergenas – tai kontrolinis mėginys. Į likusius septynis susvertus mėginius atitinkamai įdedamas tiriamasis alergenas - pieniškų valgomųjų ledų mišinys įvairiomis koncentracijomis: į 2 mėginį 10 μl, į 3 – 20 μl; į 4 - 40 μl; į 5 – 70 μl, į 6 – 100 μl, 7 – 150 μl, 8 - 200 μl, pieniškų ledų mišinio kiekio (3 lentelė). Naudojamų pieniškų ledų mišinio sudėtyje 84,4 proc. sudaro pienas ir pieno produktai (liesas pienas, sviestas, lieso pieno milteliai). Įkaitinama kaitlentė iki 45˚C temperatūros ir ištirpinami tiriamieji mėginiai. Gerai išmaišomi, kad tolygiai pasiskirstytų tiriamasis alergenas.

3 lentelė. Pieniškų ledų mišinio kiekis (μl) tiriamuosiuose sojos valgomuosiuose ledų mėginiuose.

Mėginio nr.

Pieniškų ledų mišinio kiekis (μl) sojos valgomuosiuose leduose 1 0 (kontrolinis) 2 10 3 20 4 40 5 70 6 100 7 150 8 200

Mėginių ruošimui bei kontroliniams mėginiams naudoti sojos valgomieji ledai buvo ištirti, išorinėje akredituotoje laboratorijoje, dėl kazeino likučių ir laktozės kiekio. Iš šios partijos ištirti du mėginiai: prasidėjus gamybai viena pirmųjų ledų pakuotė (žr. 1 priedas) ir besibaigiant partijos gamybai, viena paskutiniųjų ledų pakuotė (žr. 2 priedas), kad įvertinti alergenų užteršimo riziką

visos gamybos metu, užtikrinant saugią gaminamą produkciją. Mėginiuose kazeino nerasta (<0,5 ppm), taip pat ir laktozės neaptikta daugiau nei 0,01/100g.

2.1.2 Mėginių paruošimas sojos likučių nustatymui

Į stiklinę tarą pasveriama po 200 g (430 ml) tiriamųjų ryžių pieno pagrindu (ryžių pieno 60

proc.) pagamintų valgomųjų ledų. Tokiu būdu paruošiami septyni mėginiai. Pirmasis mėginys tai kontrolinis mėginys – be įdėto alergeno. Į kitus paruoštus šešis mėginius, kuriuose sudėta po 200 g ryžių valgomųjų ledų mišinio, atitinkamai įdedamas tiriamasis alergenas - sojos valgomųjų ledų mišinys, kurį 7 proc. sudaro sojos miltai, įvairiomis koncentracijomis: į 2 mėginį 10 μl, į 3 – 20 μl; į 4 - 30 μl; į 5 – 50 μl, į 6 – 70 μl, 7 – 100 μl sojos ledų mišinio kiekio (4 lentelė). Įkaitinama kaitlentė iki 45˚C temperatūros ir ištirpinami tiriamieji mėginiai. Gerai išmaišomi, kad tolygiai pasiskirstytų tiriamas alergenas.

Mėginių ruošimui bei kontroliniams mėginiams naudoti ryžių pagrindu pagaminti valgomieji ledai buvo ištirti, išorinėje akredituotoje laboratorijoje, dėl kazeino, sojos likučių bei laktozės kiekio. Iš šios partijos ištirti du mėginiai: prasidėjus gamybai viena pirmųjų ledų pakuotė (žr. 3 priedas) ir besibaigiant partijos gamybai, viena paskutiniųjų ledų pakuotė (žr. 4 priedas), kad įvertinti alergenų užteršimo riziką visos gamybos metu, užtikrinant saugią gaminamą produkciją. Mėginiuose kazeino nerasta (<0,5 ppm), laktozės neaptikta daugiau nei 0,01/100g, sojos daugiau nei 2,5 ppm neaptikta taip pat.

4 lentelė. Sojos ledų mišinio kiekis (μl) tiriamuosiuose ryžių pieno valgomuosiuose ledų mėginiuose.

Mėginio nr. Sojos ledų mišinio kiekis (μl)

ryžių valgomuosiuose leduose

1 _{0 (kontrolinis)} 2 ₁₀ 3 ₂₀ 4 ₃₀ 5 ₅₀ 6 ₇₀ 7 ₁₀₀

2.1.3 Mėginių paruošimas žemės riešutų likučių nustatymui

Alergeno, žemės riešuto, nustatymui naudota žemės riešutų chalva, kurios sudėtyje žemės riešutų masė sudaro 58 proc. Atliktas žemės riešutų chalvos praskiedimas su fiziologiniu tirpalu 1:100 ir 1:10 santykiais.

Mėginiai su žemės riešutų chalva 1:100 praskiedimu. Į stiklinę tarą pasveriama po 200 g (430 ml) ryžių pieno pagrindu pagaminto valgomojo ledo. Tokiu būdu paruošti septyni mėginiai. Pirmasis mėginys be įdėto alergeno – tai kontrolinis mėginys. Į kitus šešis paruoštus mėginius atitinkamai įdėta tiriamojo alergeno – žemės riešutų chalvos 1:100 praskiedimo įvairiomis koncentracijomis: į 2 mėginį 10 μl, į 3 – 20 μl; į 4 - 50 μl; į 5 – 70 μl, į 6 – 100 μl, 7 – 150 μl sojos ledų mišinio kiekio (5 lentelė).

Mėginiai su žemės riešutų chalva 1:10 praskiedimu. Su žemės riešutų chalvos praskiedimu 1:10 santykiu taip pat paruošti mėginiai: 1 – kontrolinis, į kitus šešis paruoštus mėginius atitinkamai įdėta tiriamojo alergeno – žemės riešutų chalvos 1:10 praskiedimo įvairiomis koncentracijomis: į 2 mėginį 10 μl, į 3 – 20 μl; į 4 - 50 μl; į 5 – 70 μl, į 6 – 100 μl, 7 – 150 μl sojos ledų mišinio kiekio (5 lentelė). Įkaitinama kaitlentė iki 45˚C temperatūros ir ištirpinami tiriamieji mėginiai. Gerai išmaišomi, kad tolygiai pasiskirstytų tiriamas alergenas.

5 lentelė. Žemės riešutų chalvos praskiedimo kiekis (μl) tiriamuosiuose ryžių valgomuosiuose ledų mėginiuose (1:100 ir 1:10 santykiais).

Mėginio nr. _{praskiedimo kiekis (μl) ryžių} Žemės riešutų chalvos 1:100 valgomuosiuose leduose

Žemės riešutų chalvos 1:10 praskiedimo kiekis (μl) ryžių

valgomuosiuose leduose 1 0 (kontrolinis) 0 (kontrolinis) 2 10 10 3 20 20 4 50 50 5 70 70 6 100 100 7 150 150

2.1.4 Mėginių paruošimas laktozės nustatymui

Laktozės kokybiniam nustatymui naudojami tie patys paruošti sojos valgomųjų ledų mėginiai su skirtingomis pieniškų ledų mišinio koncentracijomis, kurie buvo paruošti ir kazeino likučių nustatymui (3 lentelė). Įkaitinama kaitlentė iki 45˚C temperatūros, stiklinėje taroje ištirpinami tiriamieji mėgininiai.

2.2 Alergenų nustatymas

Sojos valgomuosiuose leduose tiriami kazeino likučiai naudojant RIDASCREEN® FAST Casein rinkinį. Valgomuosiuose ryžių leduose sojos likučiai tiriami naudojant RIDASCREEN® FAST Soya rinkinį, žemės riešutų likučiai tiriami su RIDASCREEN® FAST Peanut rinkiniu. ELISA tyrimui atlikti naudota R-Biopharm AG firmos geros ELISA praktikos vadovas [64].

Prietaisai ir priemonės: ACCU Reader mikroplokštelių skaitytuvas; mikrocentrifuga „NUVE NF200“; šildoma vandens vonelė, automatinės pipetės TermoLabsystems Finnpipette® (20-200 μl; 200-1000 μl ir 1-5 ml) ir CAPP Rhythm; 200 μl ir 5 ml antgaliai automatinėms pipetėms; 2,5 ml švirkštai CAPP; 5 ml mėgintuvėliai centrifugavimui; kiuvetės iš rinkinių ir jų laikiklis; stovelis mėgintuvėliams; stiklinės kolbos; svarstyklės KERN EG620-3NM ir VIBRA AJ AJH-2200CE; vienkartinės pipetės 2 ml.

2.2.1 Kazeino likučių nustatymas

RIDASCREEN® FAST Casein rinkinys. Jį sudaro: plovimo (angl. wash) tirpalas (100ml);

ekstrakcijos buferinis tirpalas (125 ml); standartinis tirpalas 1 (0 ppm kazeino koncentracija); standartinis tirpalas 2 (0,5 ppm kazeino koncentracija); standartinis tirpalas 3 (1,5 ppm kazeino koncentracija); standartinis tirpalas 4 (4,5 ppm kazeino koncentracija); standartinis tirpalas 5 (13,5 ppm kazeino koncentracija) (2 pav.) konjugato tirpalas (0,7 ml); Red Chromogen Pro tirpalas (10 ml); konjugato praskiedimo buferis (7 ml); „stop“ tirpalas (14 ml).

2 pav. RIDASCREEN FAST® Cazein rinkinyje esančių standartinių mėginių kokybės užtikrinimo sertifikate pateikiama jų koncentracijų kreivė.

Tirpalų paruošimas

1. Ekstrakcijos buferis 125 ml – pašildomas 37°C temperatūros vandens vonelėje apie 10 - 12 minučių, gerai supurtant, kol tirpalas tampa visiškai skaidrus ir jame nesimato smulkių kristalų.

2. 20 ml ekstrakcijos buferio tirpalo įpilti į 200 ml talpos tirpalo ruošimo kolbą ir iki menisko praskiesti distiliuotu vandeniu, užkimšti kamštį, gerai suplakti kolbą vartant 7 kartus. Taip paruoštas tirpalas galioja 12 savaičių jį laikant šaldytuve 0 - 6°C temperatūroje.

3. 20 ml plovimo tirpalo įpilti į 200 ml talpos tirpalo ruošimo kolbą ir iki menisko praskiesti distiliuotu vandeniu, užkimšti kamštį, gerai suplakti kolbą vartant 7 kartus. Taip paruoštas tirpalas galioja 4 savaites jį laikant šaldytuve 0-6°C temperatūroje.

Tyrimo atlikimas

 1 g ištirpinto tiriamojo mėginio pasverti į 100 ml tirpalo ruošimo kolbą (matavimo kolbą) su dangteliu.

 20 ml pašildyto ekstrakcijos buferinio tirpalo įpilti į 100 ml matavimo kolbą su 1 g mėginio. Kolbą su mėginiu įdėti į 60°C temperatūros vandens vonelę ir šildyti 10 min. Pastaba. Kas 3 min mėginys, esantis 100 ml matavimo kolboje su ekstrakcijos buferiniu tirpalu, ištraukus iš vonelės supurtomas ir vėl grąžinamas į vonelę.

 Imamas 5 ml mėgintuvėlis kiekvienam tiriamam mėginiui. Į juos įpilti po daugiau kaip pusę jo tūrio (apytikriai, nereikia tikslaus matavimo) tiriamo mėginio (tiriamas mėginys 1 g + 20 ml pašildyto ekstrakcijos buferinio tirpalo). Mėgintuvėlis centrifuguojamas 10 min centrifugoje.

 Išsicentrifugavęs mėginys esantis mėgintuvėlyje nepurtomas, imama apytikriai nuo 2 ml iki 5 ml tirpalo iš šio mėgintuvėlio ir pernešama į kitą švarų 5 ml mėgintuvėlį. Pastaba. Iš mėgintuvėlio imamas tik skaidrus skystis esantis mėgintuvėlio centre. T.y. stengiamasi nepaimti tirpalo nuo dugno ar nuo viršaus. Tai turi būti atliekama labai kruopščiai, kad pipete paimtas mėginys atsitiktinai nesugrįžtų atgal į mėgintuvėlį ir nesudrumstų tirpalo.

 2 ml - 5 ml pernešto tiriamo mėginio į naują mėgintuvėlį centrifuguojama 10 min. Toliau kiekvienas sekantis žingsnis turi būti atliekamas per 10 min.

 Pagal parodytą pavyzdį išdėliojamos kiuvetės (6 lentelė) ir po 100 µl į kiuvetes supilstomi iš rinkinio RIDASCREEN® FAST Casein esantys standartiniai tirpalai bei tiriamieji mėginiai.

 Sukamaisiais judesiais supurtomas laikiklis su kiuvetėmis ir laukiama 10 min.

 Po 10 min kiuvetėse esantį turinį išpilti, likučiai gerai išpurtomi.

 Į ištuštintas kiuvetes įpilti plovimo tirpalo po 250 µl, užpildomos visos kiuvetės. Sukamaisiais judesiai supurtyti kiuvetes esančias laikiklyje. Turinys pašalinamas, tirpalo likučiai esantys kiuvetėse išpurtomi. Toks veiksmas atliekamas 3 kartus.

6 lentelė. Kiuvečių užpildymo schema standartiniais ir tiriamaisiais mėginiais.

1 2 3 4

A Standartas 1 Standartas 1 mėginys 4 mėginys 4 B Standartas 2 Standartas 2 mėginys 5 mėginys 5 C Standartas 3 Standartas 3 mėginys 6 mėginys 6 D Standartas 4 Standartas 4 mėginys 7 mėginys 7

E Standartas 5 Standartas 5

F mėginys 1 mėginys 1

G mėginys 2 mėginys 2

H mėginys 3 mėginys 3

 Mėgintuvėlyje pasiruošiamas tirpalas iš konjugato ir konjugato praskiedimo buferinio tirpalų. Šių tirpalų kiekis pasirenkamas iš lentelės pagal tiriamų kiuvečių kiekį, įskaitant ir kiuvetes į kurias pilasi standartiniai tirpalai iš rinkinio RIDASCREEN FAST® Casein (7 lentelė). Paruoštas tirpalas nusidažo žaliai.

7 lentelė. Konjugato ir konjugato praskiedimo buferio tirpalų santykis esant skirtingam kiuvečių kiekiui.

 Po 100 µl pasiruošto tirpalo pilstoma į tuščias kiuvetes kiekvienai kiuvetei keičiant pipetės antgalį. Laikiklis su kiuvetėmis supurtomas sukamaisiais judesiais ir paliekamas 10 min.

 Po 10 min kiuvetėse esantis turinys išpilamas, likučiai gerai išpurtomi.

 Plovimo tirpalu daromas kiuvečių plovimas. Po 250 µl pilama į kiuvetes, užpildomos visos kiuvetės. Sukamaisiais judesiais supurtome kiuvetes esančias laikiklyje ir turinys išpilamas, tirpalo likučiai esantys kiuvetėse išpurtomi ant popieriaus. Toks veiksmas atliekamas 3 kartus iš eilės.

 Po 100 µl su pipete pernešama į kiuvetes Red Chromogen Pro tirpalas, kiekvienai kiuvetei keičiant pipetės antgalį. Jei po šio žingsnio tiriamasis mėginys (neskaitant standartinių mėginių iš rinkinio RIDASCREEN FAST Casein) nusidažo mėlyna spalva kyla įtarimas, kad tiriamajame mėginyje kazeino yra > 0,5 ppm arba mėginys paruoštas neteisingai.

 Kiuvetės paliekamos tamsoje 10 min.

Kiuvečių skaičius Konjugato tirpalas Konjugato praskiedimo tirpalas

12 kiuvečių 150 µl 1,5 ml 14 kiuvečių 175 µl 1,75 ml 16 kiuvečių 200 µl 2,0 ml 18 kiuvečių 225 µl 2.25 ml 20 kiuvečių 250 µl 2,50 ml 22 kiuvečių 275 µl 2,75 ml 24 kiuvečių 300 µl 3,0 ml

 Po 10 min kiuvetėse esantis turinys neišpilamas. Į kiuvetės pilama po 100 µl „stop“ tirpalo, kiekvienai kiuvetei keičiant pipetės antgalį. Atlikus šį veiksmą, standartiniai mėginiai, didėjant koncentracijoms, geltonuoja ryškėjančia tvarka (3 pav.). Mėginiai, kuriuose aptinkami tiriamojo alergeno likučiai, taip pat geltonuoja.

3 pav. Tyrimo pabaigoje, standartiniai mėginiai užpildyti „stop“ tirpalu, geltonuoja ryškėjančiai, didėjant alergeno koncentracijai.

 Paruoštos kiuvetės dedamos į Accu Reader mikroplokštelių skaitytuvą. Reikalinga nustatyti reikiamą programą – ELISA, pasirenkant tiriamąjį baltymą.

 Gaunami rezultatai – standartinių mėginių koncentracijų kreivė, standartinių ir tiriamųjų mėginių kiuvečių absorbcijos reikšmės bei alergeno likučių kiekio rezultatai (ppm).

2.2.2 Sojos likučių nustatymas

Naudojamas RIDASCREEN FAST® Soya rinkinys. Jį sudaro: plovimo tirpalas (100ml);

alergeno ekstrakcijos buferio tirpalas (125 ml); ekstrakcijos tirpalas 2 (110 ml); standartinis tirpalas 1 (0 ppm sojos koncentracija); standartinis tirpalas 2 (2,5 ppm sojos koncentracija); standartinis tirpalas 3 (5 ppm sojos koncentracija); standartinis tirpalas 4 (10 ppm sojos koncentracija); standartinis tirpalas 5 (20 ppm sojos koncentracija) (4 pav.); konjugato tirpalas (0,7 ml); Red Chromogen Pro tirpalas (10 ml); „stop“ tirpalas (14 ml).

Tirpalų paruošimas

 Plovimo tirpalas ir alergenų ekstrakcijos buferinis tirpalas pašildomi 37°C temperatūros vandens vonelėje apie 10 - 12 min, juos gerai supurtant, kol tirpalai tampa visiškai skaidrūs ir juose nesimato smulkių kristalėlių. Ekstrakcijos tirpalas 2 naudojamas neskiestas.

 20 ml pašildyto alergeno ekstrakcijos buferinio tirpalo koncentrato pilama į 200 ml tūrio tirpalo ruošimo kolbą ir iki menisko praskiedžiama distiliuotu vandeniu, užkemšama kamščiu,

suplakamas turinys. Taip paruoštas tirpalas galioja 12 savaičių jį laikant šaldytuve 2 - 8°C temperatūroje.

 20 ml plovimo tirpalo pilama į 200 ml tūrio tirpalo ruošimo kolbą ir iki menisko praskiedžiama distiliuotu vandeniu, užkemšamas kamštis, kolba pavartoma. Taip paruoštas tirpalas galioja 4 savaites jį laikant šaldytuve 2 - 8°C temperatūroje.

4 pav. RIDASCREEN FAST® Soya rinkinyje esančių standartinių mėginių kokybės užtikrinimo sertifikate pateikiama jų koncentracijų kreivė.

Tyrimo atlikimas

1. 1 g paruošto mėginio lašinamas pipete į 100 ml tirpalo ruošimo kolbą su dangteliu.

2. Paruoštas atskiestas alergeno ekstrakcijos buferinis tirpalas šildomas 60°C temperatūros vandens vonelėje apie 15 min.

3. 17,5 ml pašildyto alergeno ekstrakcijos buferinio tirpalo ir 2,5 ml neskiesto ekstrakcijos tirpalo 2 pilama į 100 ml matavimo kolbą su 1 g mėginio.

4. Kolba su mėginiu statoma į 100°C temperatūros vandens vonelę ir kaitinama 10 min. Pastaba. Kas 3 min mėginys ištraukus iš vonelės supurtomas ir vėl grąžinamas į vonelę.

5. Per trumpą laiką atvėsinamas mėginys.

6. Į 5 ml tūrio mėgintuvėlius pilamas kiekvienas tiriamasis mėginys, po daugiau kai pusę jo tūrio. Mėgintuvėlis centrifuguojamas 10 minučių centrifugoje.

7. Išsicentrifugavęs mėginys esantis mėgintuvėlyje nepurtomas, imama apytikriai nuo 2 ml iki 5 ml tirpalo iš šio mėgintuvėlio ir pernešama į kitą švarų 5 ml mėgintuvėlį. Pastaba. Iš mėgintuvėlio imamas tik skaidrus skystis esantis mėgintuvėlio centre. T. y. stengiamasi

nepaimti tirpalo nuo dugno ar nuo viršaus. Tai turi būti atliekama labai kruopščiai, kad pipete paimtas mėginys atsitiktinai nesugrįžtų atgal į mėgintuvėlį ir nesudrumstų tirpalo.

8. Dar kartą mėgintuvėliai centrifuguojami 10 minučių.

9. Po antrojo centrifugavimo paimama po 200 µl mėginio į švarų mėgintuvėlį. Įpilama po 800 µl pasiruošto atskiesto allergen extraction buffer tirpalo. Kiekvienas sekantis žingsnis turi būti atliekamas per 10 min.

10. Kiuvetės išdėliojamos pagal pavyzdį (6 lentelė). Po 100 µl į kiuvetes supilstomi iš rinkinio RIDASCREEN® FAST Soya esantys standartiniai tirpalai bei tiriamieji mėginiai.

11. Sukamaisiais judesiais supurtomas laikiklis su kiuvetėmis ir laukiama 10 minučių. 12. Po 10 min kiuvetėse esantis turinys pašalinamas, likučiai gerai išpurtomi.

13. Pasiruoštas plovimo tirpalas po 250 µl pilamas į kiuvetes, užpildomos visos kiuvetės. Sukamaisiais judesiais supurtomos kiuvetes esančios laikiklyje, turinys pašalinamas, likučiai išpurtomi.

14. Į švarų mėgintuvėlį paruošiamas tirpalas iš RIDASCREEN® FAST Soya konjugato tirpalo ir distiliuoto vandens. Prieš praskiedžiant, konjugato tirpalo koncentratas švelniai supurtomas. Šių tirpalų kiekis pasirenkamas iš lentelės pagal tiriamų kiuvečių kiekį tame tarpe įskaitant ir kiuvetes į kurias pilasi standartiniai tirpalai iš rinkinio (8 lentelė).

15. Po 100 µl pasiruošto tirpalo pilstoma į tuščias kiuvetes kiekvienai kiuvetei keičiant pipetės antgalį. Laikiklis su kiuvetėmis supurtomas sukamaisiais judesiais ir paliekamas 10 min. 16. Po 10 minučių kiuvetėse esantis turinys pašalinamas, likučiai gerai išpurtomi.

17. Pasiruošto plovimo tirpalo po 250 µl pilama į kiuvetes, užpildomos visos kiuvetės. Sukamaisiais judesiai supurtomos kiuvetes esančios laikiklyje, turinys pašalinamas, likučiai gerai išpurtomi. Toks veiksmas atliekamas 3 kartus iš eilės.

18. Tirpalas Red Chromogen Pro po 100 µl su pipete pernešamas į kiuvetes, kiekvienai kiuvetei keičiant pipetės antgalį. Jei po šio žingsnio tiriamasis mėginys (ne standartiniai iš rinkinio) nusidažo mėlyna spalva kyla įtarimas, kad tiriamajame mėginyje sojos baltymo yra > 2,5 ppm arba mėginys paruoštas neteisingai.

19. Kiuvetės paliekamos tamsoje 10 min.

20. Po 10 min kiuvetėse esantis turinys neišpilamas. Į kiuvetės pilama po 100 µl „Stop“ tirpalo, kiekvienai kiuvetei keičiant pipetės antgalį.

21. Paruoštos kiuvetės dedamos į ACCU Reader aparatą. Reikalinga nustatyti reikiamą programą – ELISA, pasirenkant tiriamąjį baltymą.

22. Gaunami rezultatai – standartinių mėginių koncentracijų kreivė, standartinių ir tiriamųjų mėginių kiuvečių absorbcijos reikšmės bei alergeno likučių kiekio rezultatai (ppm).