1
KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
Rūta Skirpstūnaitė
Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus pritaikymas
terpenolaktonų analizei
Magistro darbas
Darbo vadovai:
prof. dr. L. Ivanauskas
doc. dr. V. Jakštas
KAUNAS, 2010
2
SANTRAUKA
Raktiniai ţodţiai: garinantis šviesos sklaidos detektorius, terpenolaktonai, Ginkgo biloba.
Tobulėjant mokslinei – analitinei technikai, plečiasi ir instrumentinės analizės galimybės. Viena iš naujovių efektyviojoje skysčių chromatografijoje ir superkritinių skysčių chromatografijoje – garinantis šviesos sklaidos detektorius, kuris vaistų analizėje turi išskirtinių privalumų tiriant priemaišas bei taikant stabilumo tyrimus. Jį galima taikyti UV ir regimąją šviesą neabsorbuojančių analičių, pavyzdţiui terpenolaktonų, tyrimui. Šis detektorius jautresnis nei šiuo metu taikomi refraktometriniai detektoriai, nėra jautrūs temperatūros svyravimams, tinka naudoti taikant judrios fazės gradientą. Todėl tikslinga metodikas, kuriose anksčiau taikytas refraktometras, optimizuoti pritaikant garinantį šviesos sklaidos detektorių.
Tyrimo objektas – sausas dviskiaučio ginkmedţio ekstraktas ir iš jo pagamintos GINKOBIL 40 mg vaistinio preparato pilotinės serijos. Tyrimas atliktas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, naudojant garinantį šviesos sklaidos detektorių.
Darbo tikslas – naudojant garinantį šviesos sklaidos detektorių optimizuoti analitinę metodiką terpenolaktonų kiekio nustatymui vaistinėje medţiagoje, sasame dviskiaučio ginkmedţio ekstrakte, ir vaistinio preparato kapsulėse, ją validuoti.
Nustatyta, jog garinantis šviesos sklaidos detektorius tinka ginkmedţio ekstrakto ir iš jo pagaminto vaistinio preparato analizei; iš dviskiaučio ginkmedţio lapų pagaminti preparatai pasiţymi farmakologinėmis savybėmis siejamomis su terpenolaktonų ir flavonoidų buvimu. Optimizuota metodika: pasirinkta kolonėlė, kolonėlės temperatūra, injekcijos tūris. Garinančio šviesos sklaidos detektoriaus nustatymai: azoto srautas – 2,5 ml/min; garintojo temperatūra – 55 °C. Kiekybiniam tyrimui pasirinktas gradavimo grafiko metodas, taikant logaritminį kalibravimo būdą. Gauti metodikos validacijos parametrų įverčiai patvirtina jos atrankumą, pakartojamumą tiesiškumą, ir taikymo ribos tikslumą. Validuota matodika pritaikyta, GINKOBIL vaistinės medţiagos ir iš jo pagaminto preparato tyrimui, nustatyta, kad sausajame kiekybiškai įvertintame ginkmedţio ekstrakte vidutiniškai ginkgolido C yra 1,414 proc., bilobalido – 2,652 proc., ginkgolido A – 1,134 proc., ginkgolido B – 0,654 proc., o vaistiniame preparate: 1,0625 proc. Ginkgolido C, 2,5875 proc bilobalido, 1,6375 ginkgolido A, 0,6437 proc ginkgolido B.
3
SUMMARY
Key words: evaporative light-scattering detector, terpenolactones, ginkgo biloba.
With the development of scientific - analytical techniques, instrumental analysis, and expanding opportunities. One of the innovative high-performance liquid chromatography and supercritical fluid chromatography - evaporation light scattering detector, which analyzes drug testing has unique advantages and impurities by the stability studies. It is possible to use for investigation of profiles which can not to absorbe UV and visible light, such as terpenolaktonų. This detector is more sensitive than the currently used refractometric detectors, are not sensitive to temperature variations, suitable for use with mobile phase gradient. Therefore, appropriate methods, which previously applied refractometer, to optimize adaptation evaporative light scattering detector. The object – the dry extract of Ginkgo biloba and made GINKOBIL 40 mg medicine pilot series. The study was conducted by high performance liquid chromatography using a evaporative light scattering detector. The aim - using evaporative light scattering detector to optimize the analytical method for the determination of terpenolactones in the pharmacy material dry extract of Ginkgo biloba and medicine capsules, it is validated.
It was found that evaporation light scattering detector can be used to analyze Ginkgo biloba extract produced from the analysis of medicinal products; products produced from Ginkgo biloba leaf have pharmacological properties associated with the presence of flavonoids and terpenolactones. The optimized methodology: selected column, column temperature, injection volume, evaporative light scattering detector parameters: nitrogen flow rate - 2.5 ml/min; evaporator temperature - 55 ° C. Calibration graph method using logarithmic calibration method selected for quantitative analysis of. Estimates obtained the parameters of validation confirmed its selectivity, linearity repeatability and the limits of accuracy. Validated matodology, adapted to GINKOBIL pharmacy material and from it preparated preparation investigation, found ,that the dry quantified extract of Ginkgo average is ginkgolido C 1.414 per cent, Bilobalido – 2.652 per cent., Ginkgolido A - 1.134 per cent., Ginkgolido B - 0.654 per cent., and in the medicinal product: 1.0625 per cent – Ginkgolido C, 2.5875 per cent – Bilobalido, 1.6375 per cent – Ginkgolido A, 0.6437 percent – Ginkgolido B.
4
TURINYS
Santrauka...2 Summary...3 Santrumpos...6 1. Įvadas...7 2. Literatūros apţvalga...92.1 Garinantis šviesos sklaidos detektorius...9
2.1.1 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus veikimo principas………9
2.1.2 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai, lyginant su ultavioletinės/regimosios šviesos, refraktometrijos, fluorescencijos, masių spektrometrijos detektoriais...12
2.1.2.1 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai ir trūkumai...12
2.1.2.2 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai lyginant su refraktometriniu detektoriumi...13
2.1.2.3 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai lyginant su UV/regimos šviesos spektre...14
2.1.2.4 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai lyginant su fluorescenciniu detektoriumi...15
2.1.2.5 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai lyginant su masių spektrometriniu detektoriumi...15
2.2. Dviskiaučio ginkmedţio apibūdinimas ...17
2.2.1 Botaninis apibūdinimas...17
2.2.2 Paplitimas ir augimo sąlygos...18
2.3. Dviskiaučio ginkmedţio kaupiamos farmakologiškai aktyvios medţiagos...19
2.3.1 Terpenolaktonų organoleptinės ir fiziko – cheminės savybės...21
2.4. Dviskiaučio ginkmedţio ekstrakte esančių terpenolaktonų analizė...22
2.4.1 Ekstrakto paruošimas...22
2.4.2 Mėginio valymas...23
2.4.3 Išskyrimas ir aptikimas...24
2.4.3.1 Plonasluoksnė chromatografija...25
2.4.3.2 Dujų chromatografija...26
2.4.3.3 Superkritinių skysčių chromatografija...26
2.4.3.4 Efektyvioji skysčių chromatografija...27
2.5. Ginkmedţio preparatų panaudojimas medicinoje...28
2.6. Terpenolaktonų farmakokinetika...31
2.7. Analitinės matodikos validacija...32
2.8. Esminiai validacijos parametrai...32
3. Eksperimentinė dalis...36
3.1. Tyrimo objektas ir metodika...36
3.1.1 Tyrimo objektas...36
3.1.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika...36
3.2. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas...39
3.2.1 Metodikos optimizavimas...39
5
3.3. Metodikos pritaikymas vaistinės medţiagos GINKOBIL ir iš jos pagaminto preparato
tyrimui...56
3.3.1 Vaistinio preparato GINKOBIL vaistinės medţiagos tyrimas...56
3.3.2 Vaistinio preparato GINKOBIL tyrimas...57
4. Išvados...59
6
SANTRUMPOS
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija ATF – adenozintrifosfatas
ICH – International Conference on Harmonization USP – United States Pharmacopoeia
RSS – residual sum of squares
ELSD – evaporative light scattering detection CRS – chemical reference standart
7
1. ĮVADAS
Pastaruoju metu vis didėja susidomėjimas augaliniais vaistais kaip natūraliais, maţai šalutinių poveikių sukeliančiais preparatais. Todėl ypač didelis dėmesys yra skiriamas augalinėse medţiagose ir augaliniuose preparatuose esančių biologiškai aktyvių junginių sudėties tyrimams. Tobulėjant mokslinei – analitinei technikai, plečiasi ir instrumentinės analizės galimybės. Viena iš naujovių efektyviojoje skysčių chromatografijoje ir superkritinių skysčių chromatografijoje – garinantis šviesos sklaidos detektorius, kuris vaistų analizėje turi išskirtinių privalumų tiriant priemaišas bei taikant stabilumo tyrimams. Jį galima taikyti UV ir regimąją šviesą neabsorbuojančių analičių, pavyzdţiui terpenolaktonų, tyrimui. Šis
detektorius jautresnis nei šiuo metu taikomi refraktometriniai detektoriai, nėra jautrus temperatūros svyravimams, tinka naudoti taikant judrios fazės gradientą. Todėl tikslinga metodikas, kuriose anksčiau taikytas refraktometras, optimizuoti pritaikant garinantį šviesos sklaidos detektorių [35].
Norint įvertinti vaistinės medţiagos, sauso dviskiaučio ginkmedţio ekstrakto, ir vaistinio preparato kapsulių kokybę ir kiekinę sudėtį, naudojant garinantį šviesos sklaidos detektorių, reikia įteisinti analizės metodiką, kuri leistų patikimai, tiksliai bei atkartojamai nustatyti bilobalido, ginkgolidų A, B, C kiekį vaistinėje medţiagoje ar iš jos pagamintame preparate [34]. Taip pat būtina optimizuoti metodiką, kurios pagrindu pasirinktas Europos Farmakopėjos 04/2008:1827 straipsnis: sąlygas šviesos sklaidos detektoriui ir kitai turimai laboratorinei įrangai [33, 39].
Darbo tisklas
Naudojant garinantį šviesos sklaidos detektorių optimizuoti analitinę metodiką terpenolaktonų kiekio nustatymui vaistinėje medţiagoje, sausame dviskiaučio ginkmedţio ekstrakte, ir vaistinio preparato kapsulėse, ją validuoti.
Darbo naujumas
Naujas detektorius pritaikytas esamos vaistinės medţiagos – ginkmedţio sauso kiekybiškai įvertinto ekstrakto – kiekybės parametro kontrolei. Nauja analitinė metodika pritaikyta naujo vaistinio preparato kiekybės parametrų kontrolei.
Darbo uţdaviniai
1. Apibendrinti moksliniuose šaltiniuose skelbtą informaciją, reikalingą numatytam tikslui
pasiekti (garinančio šviesos sklaidos detektoriaus ypatumus, terpenolaktonų nustatymų metodikas, dviskiaučio ginkmedţio vaistinės medţiagos savybes, farmakologinį veikimą, siejamą su terpenolaktonų ir flavonoidų buvimu).
2. Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką sauso dviskiaučio
8
3. Atlikti eksperimentinius tyrimus, pagrindţiančius metodikos pritaikymą (metodiką
validuoti).
4. Validuotą metodiką pritaikyti vaistinės medţiagos – sauso, kiekybiškai įvertinto
9
2. LITERATŪROS APŢVALGA
2.1 Garinantis šviesos sklaidos detektorius
Atliekant augalų fitocheminę analizę labai svarbu pasirinkti tinkamą detektorių. Detektoriai, tai įrenginiai, nustatantys išskirstytas analites ištekančiame iš kolonėlės eliuate. Jie tam tikra prasme nustato judrios fazės sudėtį ir paverčia ją elektriniu signalu, kurį perduoda į registruojamąjį įrenginį, kuris įrašo ir parodo šį rezultatą kaip atsilenkimą nuo bazinės linijos. Kadangi signalas registruojamas nuolat, jo funkcija uţrašoma atsiţvelgiant į trukmę ar eliuato tūrį. Nustatant mišinio kokybinę sudėtį atsiţvelgiama į chromatografinių juostų eliucijos eiliškumą ir būdingus laikus, o kiekybinę sudėtį – į chromatografinių smailių plotus[22].
Garinantieji šviesos sklaidos detektoriai yra universalūs, gali būti naudojami nustatyti bet kurias analites, nepriklausomai nuo jų optinių ar elektrinių savybių; gali būti naudojama gradientinė eliucija; nereikalinga prieškolonėlinė ar pokolonėlinė derivacija. Judrioje fazėje turi būti naudojami tik lakūs buferio priedai, pavyzdţiui, amonio acetatas, acto rūgštis, azoto rūgštis. Detektoriai yra gana kompaktiški ir juos paprasta naudoti. Minimali aptinkama masė yra apie 10ng [22].
2.1.1 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus veikimo principas
Garinantis šviesos sklaidos detektorius unikalus analitės aptikimo metodu, kurį sudaro trys ţingsniai.
1. Eliuento purškimas (1 pav.) Eliuentas patekęs į purkštuvą susimaišo su nuolatiniu dujų
srautu (daţniausiai azoto). Taip jis paverčiamas aerozoliu. Aerozolis susideda iš vienodai pasiskirsčiusių lašelių, kurių dydis priklauso nuo dujų srauto naudojamo analizės metu. Kuo maţesnis dujų srautas, tuo didesni bus lašeliai. Didesni lašeliai išsklaido daugiau šviesos ir padidina analizės jautrumą, tačiau juos
10
1 pav. Eliuento purškimas kameroje
2. Tirpiklio garinimas.(2 pav.) Lakiųjų komponentų garinimas aerozolyje vyksta šildomam
nerūdijančio plieno tėkmės vamzdelyje. Išgarinus tirpiklo sluoksnį suformuojamos sausos dalelės. Tinkamos temperatūros nustatymas poslinkio vamzdelyje priklauso nuo mobiliosios fazės tirpalo sudėties ir srauto, ir nuo mėginio lakumo. Organinės mobilios fazės reikalauja maţesnės garinimo temperatūros poslinkio vamzdelyje nei itin vandeningos mobiliosios fazės. Ţemesnių mobiliųjų fazių srautas reikalauja ţemesnės temperatūros poslinkio vamzdelyje nei didesnės mobiliosios fazės srautas. Pusiau lakios analitės reikalauja daug ţemesnės temperatūros poslinkio vamzdelyje norint pasiekti optimalų jautrumą. Optimali temperatūra turėtų būti nustatoma laikantis signalo-triukšmo santykio, atsiţvelgiant į temperatūrą [20,21,39].
11
3. Aptikimas (3 pav.) Mėginio dalelės mobilios fazės garuose iš tėkmės vamzdţio patenka į
optinę kamerą. Joje mėginio dalelės išsklaido šviesą spinduliuojamą šviesos lazerio šaltinio, kol mobili fazė nėra išgaravusi. Išsklaidyta šviesa aptinkama silicio fotodiodo, susikuria signalas, kuris yra siunčiamas į įrenginį atsakingą uţ duomenų rinkimą[20,21,38,39].
12
2.1.2 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai, lyginant su
ultavioletinės/regimosios šviesos, refraktometrijos, fluorescencijos, masių
spektrometrijos detektoriais
2.1.2.1Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai ir trūkumai
Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus galimybė išgarinti mobiliąją fazę artimoje aplinkai temperatūroje leidţia aptikti pusiau lakias medţiagas (4 pav.) [39].
4 pav. Pusiau lakių medžiagų analizė izoterminėmis sąlygomis (Melissa J. Wilcox Product MarketingManager, www.discoverysciences.com)
Efektyviosios skysčių chromatografijos apribojimai: 1. gali būti naudojamos tik lakiosios mobiliosios fazės; 2. mėginys turi būti maţiau lakus nei nepastovi mobili fazė; 3. detektorius yra nelinijinis.
13
2.1.2.2 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai lyginant su
refraktometriniu detektoriumi
Atliekant analizę garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus pagalba aplinkos temperatūros pokyčiai analizės tikslumui įtakos neturi, tačiau naudojant refraktometrą pastebimas pradinis bazinės linijos nestabilumas dėl temperatūros pokyčių. Naudojant refraktometrą gaunamos neigiamos ir teigiamos smailės vieno bandymo metu, jautrumas maţas, tirpiklis gali analizei sukelti trukdţių.O naudojant analizėje garinantįjį šviesos sklaidos detektorių – smailės visada teigiamos, tirpiklis įtakos neturi, metodas
jautresnis (nanogramų tikslumu). Lyginant su refraktometrinio detektoriaus, garinančio šviesos sklaidos
detektoriaus bazinė linija stabilesnė, o tyrimas tikslesnis (5 pav.) [39].
5 pav. Angliavandenių chromatograma gauta naudojant garinantįjį šviesos sklaidos detektorių lyginama
su chromatograma gauta refraktometriniu detektoriumi (Melissa J. Wilcox Product Marketing Manager,
14
2.1.2.3Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai lyginant su UV/regimos
šviesos spektre
Atliekant eksperimentinius tyrimus UV/regimos šviesos spektre aptinkami tik tie junginiai, kurie absorbuoja UV ar regimąją šviesą, junginių aptikimas paremtas išnykimo koeficientu, chromatogramoje gradiento metu bazinė linija nukrypsta esant ţemam bangos ilgiui (6 pav.). Atliekant analizę šiais detektoriais galima naudoti ne visus tirpiklius, nes esant ţemam bangos ilgiui jie gali sukelti trukdţių [39]. Atliekant analizę garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus pagalba, aptinkamas bet kuris junginys, kuris yra maţiau lakus nei mobili fazė, o chromatogramoje bazinė linija gradiento metu nepakinta arba pakinta labai maţai (6 pav.). Šiai analizei tirpikliai įtakos neturi. Garinantis šviesos sklaidos detektorius nechromoforinius mišinius aptinka be papildomų cheminių reakcijų (7 pav.) [39].
6 pav. Steroidų chromatograma gauta naudojant garinantįjį šviesos sklaidos detektorių lyginama su
UV/regimos šviesos spektre gauta chromatograma (Melissa J. Wilcox Product Marketing Manager,
15
7 pav. Nechromoforinių mišinių chromatograma, analizę atliekant garinančiuoju šviesos
sklaidos detektorium (Melissa J. Wilcox Product Marketing Manager, www.discoverysciences.com)
2.1.2.4 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai lyginant su
fluorescenciniu detektoriumi
Ekperimentinių tyrimų metu, kai naudojamas fluorescencinis detektorius, kad junginiai būtų aptikti, daţniausiai reikalingos papildomos cheminės reakcijos. Naudojant garinantį šviesos sklaidos detektorių šių reakcijų nereikia [20, 21, 39].
2.1.2.5 Garinančiojo šviesos sklaidos detektoriaus privalumai lyginant su masių
spektrometriniu detektoriumi
Masių spektrometriniai detektoriai yra universalūs, tačiau šviesos sklaidos detektorius turi daugiau privalumų:
1. maţesnės investicijos ir pigesnis darbas;
2. ne tokios sudėtingos operacijos;
3. pigesnis išlaikymas;
16
Kadangi šviesos sklaidos detektoriui ir masių spektrometriniam detektoriui reikalingos sąlygos yra panašios, masių spektrometriniam detektoriui sukurtas metodas be jokių pakeitimų gali būti pritaikomas šviesos sklaidos detektoriui (8 pav.) [40].
8 pav. Palyginamos aspartamo, hidrokortizono, rezerpino, terfenadino chromatogramos gautos atliekant
analizę su UV detektoriumi, masių spektrometriniu detektoriumi, garinančiuoju šviesos sklaidos
17
2.2.Dviskiaučio ginkmedţio apibūdinimas
Dviskiautis ginkmedis (lot. Ginkgo biloba L.) ( sinonimai: Salisburia adiantifolia, Salisburia biloba, Pterophyllus salisburiensisd, angl. – „Maidenhair tree“). Japoniškai ginkgo – „sidabrinis abrikosas“ arba „sidabrinis vaisius“. Ginkmedis dar vadinamas gyvąja iškasena. Priklauso ginkūnų (Ginkgophyta) skyriui, ginkmedainių (Ginkgoopsida) klasei, ginkmedinių (Ginkgoaceae) šeimai [30].
9 pav. Dviskiautis ginkmedis Švėkšnos parke
2.2.1.Botaninis apibūdinimas
Dviskiautis ginkmedis – dvinamis lapuotis, vasarţalis medis. (9 pav.) Jis išauga iki 30 m – 40 m aukščio, ir iki 3 metrų skersmens. Vyriškieji augalai siauromis lajomis, moteriškieji – plačiomis; lauţytomis šakomis. Ţievė pilka, senų kamienų tamsiai pilka, suaiţėjusi. Ant šakų išauga dvejopi ūgliai: ilgaūgiai ir trumpaūgliai. Ilgaūglių lapai yra pavieniai, prisitvirtinę padrikai, o trumpaūglių – viršūnėse išaugę kuokštais po 5 – 7 [30].
18
10 pav. Dviskiaučio ginkmedžio lapas
Pavasarį ir vasarą ţali, rudenį pagelstantys ir prieš ţiemą nukrentantys lapai – ilgakočiai, vėduokliški, dviskiautėmis viršūnėmis. Jų gyslotumas primityvus, dichotominis (2 pav.). Sėklos pasėtos
sudygsta po 3 – 4 savaičių, o sunoksta spalio mėnesį. Vaisius panašus į slyvą, šviesiai gelsvos spalvos,
specifinio kvapo, 2 – 3 cm ilgio ir apie 3 cm skersmens (3 pav). Kauliukas baltas, tribriaunis. Šaknų sistema plastiška, gili, medţiai atsparūs vėjui. Gyvena 1000 ir daugiau metų [2, 5].
11 pav. Dviskiaučio ginkmedžio vaisiai
2.2.2. Paplitimas ir augimo sąlygos
Dviskiautis ginkmedis savaime auga tik Pietryčių Kinijos kalnuose. Kaip kultūrinis augalas ţinomas jau XIa. 1727 m. buvo atveţtas į Vakarų Europą, Jungtines Amerikos Valstijas. Lietuvoje auga Švėkšnos parke ir Kauno botanikos sode, Dubravos tyrimo stoties arboretume, Obelynėje [30].
19
2.3 Dviskiaučio ginkmedţio kaupiamos farmakologiškai aktyvios medţiagos
Dviskiautis ginkmedis plačiai taikomas medicinoje dėl kaupiamų biologiškai aktyvių medţiagų gausos.
Dviskiaučio ginkmedţio lapuose kaupiami:
1. Flavonoidai : 1.1. glikozidai; 1.2. aglikonai; 1.3. antocianidai; 1.4. biflavonai; 1.5. biflavonų glikozidai;
1.6. alkilfenoliai ir alkilfenolinės rūgštys;
1.7. kardanoliai; 1.8. kardoliai; 1.9. anakardinės rūgštys; 1.10. rezorcilinės rūgštys. 2. Terpenai: 2.1. steroidai ir fitosteroliai; 2.2. karotenoidai; 2.3. poliprenoliai. 2.4. monoterpenai; 2.5. diterpenai; R1 R2 R3 Ginkgolidas A H H OH Ginkgolidas B OH H H Ginkgolidas C OH OH OH Ginkgolidas J H OH OH Ginkgolidas M OH OH H
20
R
Ginkgolidas K OH
Ginkgolidas L H
13 pav. Ginkgolidų K, L struktūrinė formulė
2.6 Seskviterpenai;
14 pav. Bilobalido struktūrinė formulė
3. organinės rūgštys;
4. taninai;
21
2.3.1 Terpenolaktonų organoleptinės ir fiziko – cheminės savybės
Terpenolaktonai yra unikalūs savo chemine stuktūra. Jie yra svarbūs vertinant ekstrakto kokybę. Paprastai vadinami ginkgolidais A, B, C, J ir bilobalidas. Jų struktūra pavaizduota atitinkamai 12 pav., 13 pav. ir 14 pav. 1960 metais dvi Japonijos grupės nustatė tikslią ginkgolidų A, B, C struktūrą, o ginkgolido J ir bilobalido po kelių metų. 1980 metais susidomėjimas ginkgolidais išaugo dėl nustatyto stipraus antitrombozinio poveikio ir padidėjusios prekybos Ginkgo biloba ekstraktu [11].
Struktūra
Terpenai C20 sudaro šešis penkianarius ţiedus: spiro-4,4-nonanokarboksilinis ţiedas, trys laktonai ir tetrahidrofuranas. Iki šiol jie yra vieninteliai naturalūs produktai turintys tetrabutil grupę (12pav., 13 pav. ir 14 pav.) [2, 15, 31, 36].
Organoleptinės savybės
Ginkgolidai ir bilobalidas yra balti bekvapiai kristalai ar milteliai. Kartaus skonio. Jie atsparūs šviesai ir drėgmei. Bilobalidas nestabilus, kai terpės rūgštingumas didesnis nei pH 7 [36].
Lydymosi temperatūra
Ginkgolidai yra santykinai stabilios medţiagos, kurios turi daug funkcinių grupių ir todėl lydosi aukštoje temperatūroje. Yra skirtingų duomenų apie jų lydymosi temperatūrą, nes tai priklauso nuo naudojamų tirpklių kristalizacijai, grynumo ir eksperimento sąlygų. Tačiau daţniausiai literatūros šaltiniuose nurodoma lydymosi temperatūra – daugiau nei 300 °C [36].
Tirpumas
Ginkgolidai A, B, C ir bilobalidas gerai tirpūs acetone, etanolyje, metanolyje, etilacetate,
tetrahidrofurane, dioksane, acto rūgštyje, trifluoracto rūgštyje, acetonitrile, piridine, dimetilsulfokside. Šie junginiai sunkiai tirpūs eteryje ir vandenyje, o visiškai netirpsta heksane, benzene, chloroforme,
karbontetrachloride [36].
Acetono – vandens, metanolio – vandens mišiniai naudojami terpenotrilaktonų ekstrakcijai iš dviskiaučio ginkmedţio lapų, nes šiuose mišiniuose ginkgolidai A, B, C ir bilobalidas gerai tirpsta. Jie taip pat gali būti ekstrahuojami superkritiniu anglies dioksido skysčiu su 10 proc. metanoliu esant 335atm. slėgiui ir 45 °C temperatūrai [36, 37].
22
2.4. Dviskiaučio ginkmedţio ekstrakte esančių terpenolaktonų analizė
Cheminę ginkmedţio terpenotrilaktonų analizę galima padalinti į tris etapus: ekstrakto paruošimas, mėginio išvalymas, išskyrimas ir nustatymas.
2.4.1 Ekstrakto paruošimas
Norint išvengti nepolinių priemaišų, beveik visuose ginkmedţio lapų ekstrakto paruošimo procesuose kaip sudėtinė dalis yra svarbus vanduo. Daţniausiai organiniai tirpikliai, tokie kaip acetonas ar metanolis, yra naudojami pagreitinti ekstrakcijai, nes ginkgolidas A ir ypač ginkgolidas B yra silpnai tirpūs 100 proc. kambario temperatūros vandenyje. Keli sisteminiai tyrimai leido palyginti tirpiklių sistemas. Etanolio – vandens ir acetono – vandens (santykiai 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 ir 9:1) mišiniais buvo pakankamai išekstrahuota terpenotrilaktonų, tačiau medţiagų išekstrahuotas kiekis buvo labai įvairus. Poliniai proantocianidinai išvis neišsiekstrahavo su 90 proc. organiniu tirpikliu, nors nepolinė ginkgolinė rūgštis buvo prastai išsiekstrahavusi. Tyrimų metu taip pat buvo palygintas veiksmingumas metanolio, metanolio – vandens (1:1), tekančio vandens. Jų metu buvo nustatyta, jog visi tirpikliai terpenotrilaktonus išekstrahavo vienodai gerai. Šiek tiek parūgštinus, pavyzdţiui 1 proc. acto rūgtimi, sumaţėja išekstrahuoto chlorofilo kiekis ir sumaţina nepatvaraus bilobalido irimą ekstrakcijos metu. Bilobalidas yra nestabilus, kai pH 7. Štai kodėl ekstrakcijos tirpiklių pasirinkimas yra toks menkas. Mokslininkai Lang ir Wai pirmiausiai ginkmedţio lapus ekstrahavo 2 minutes su 100 proc. vandeniu, antrą kartą 15 minučių
ekstrahavo tekančiu 0,1 proc. Na2HPO4 (pH 8). Tačiau ši neįprasta ekstrakcijos metodika pablogino
bilobalido išsiskyrimą, todėl buvo smarkiai sukritikuota [35].
Terpenotrilaktonai taip pat gali būti ekstrahuojami superkritinės ekstrakcijos būdu. Iš standartizuoto Ginkgo biloba ekstrakto terpenotrilaktonai gali būti išskirti anglies dioksidą pakeitus 10proc. metanoliu prie 335 atm slėgio ir 45 °C temperatūroje. Šios metodikos privalumai: atkuriamumas ir automatizacija. Tačiau metodo metu, kai ekstrakcija vykdoma iš ginkmedţio lapų, taip pat išsiskiria per daug nepolinių priemaišų, tokių kaip chlorofilas. Terpenotrilaktonus yra daug paprasčiau išskirti iš standartizuoto ekstrakto, nei iš šio augalo lapų, nes ekstraktą galimą ištirpinti pavyzdţiui 100 proc. metanolyje [37].
Galima teigti, kad yra keletas gerų tirpiklių, kuriuos galima panaudoti terpenotrilaktonų ekstrakcijai iš lapų, tačiau nereikia pamiršti, kad tuo pačiu metu išsiskirs ir priemaišos, kurias prieš terpenotrilaktonų nustatymą būtina pašalinti.
23
2.4.2 Mėginio valymas
Pagrindine ginkmedţio kaupiamų terpenotrilaktonų analizės problema išlieka neapdirbtų, pirminių ektraktų bei standartizuoto esktrakto valymas nuo tirpiklių. Standartizuotas ekstraktas susideda ne tik iš apie 6 proc. terpenotrilaktonų, bet ir apie 24 proc. flovanolio glikozidų bei kitų panašių polinių junginių, kurie , jei jų nepašalinsime, gali trukdyti terpenotrilaktonų išskyrimui ir aptikimui [35].
Viena iš geriausių fazių mėginio valymui yra silikagelis. Tačiau norint ekstraktą valyti šiuo būdu reikia itin nepolinio organinio tirpiklio, kitu atveju ginkgolidai nebus išsaugomi, bet tokiuose tirpikliuose ginkgolidai yra silpnai tirpūs. Ši problema buvo išspręsta taip: neapdirbtas ekstraktas buvo patalpintas į metanolį ir vėliau perkeltas į 60°C temperatūros metanolį vakuume. Tada terpenotrilaktonai galėjo būti plaunami labiau nepoliniu tirpikliu. Visi duomenys leidţia šią metodiką validuoti: smailių grynumas, linijiškumas, atkuriamumas [37].
Kiekybinis kietų fazių ekstrakcija – dujų chromatografija – liepsnos jonizacijos detektorius metodas terpenotrilaktonų nustatymui ginkmedţio lapuose pagal E. Lolla ir kt. (1998):
1. 5 g lapų miltelių ekstrahuojami sokslete su heksanu 4 valandas ir dţiovinami krosnelėje.
2. Ekstrahuoti lapai su 120 ml acetono – vandens (6:4) paliekami per naktį kambario
temperatūroje ir maišomi.
3. Filtruojami, garinami vakuume ir tirpinami metanolyje ardymui ultragarsu.
4. Perkeliama 0,5 ml į kietosios fazės ekstrakcijos kolonėlę uţildytą 1,2 g silikagelio,
dţiovinama vakuume 4 valandas, kai kolonėlės temperatūra 60 °C.
5. Išplaunama kolonėlė su 10 ml tolueno- acetono (7:3), vidinis standartas įpilamas į eliuatą.
6. Garinamas N2 60 °C temperatūroje, įvedamas piridinas ir 1 proc. trimetilchlorosilanas į
N,O-bis(trimetil)trifluoroacetamidą ir šildoma 60 °C temperatūroje 30 min.
7. Dujų chromatografijos analizė atliekama dujų chromatografijos nejudrios fazės – kolonelės
pagalba (15 m x 0,25 mm x 0,25 μm), krosnelės temperatūra 120 – 300 °C, liepsnos jonizacijos detektorius [35, 37].
Europos Farmakopėjos straipsnyje (1999) pateiktas mėginio valymas:
1. Per 3 g ginkmeţio lapų miltelių leidţiamas 100 ml acetonas – vanduo (6:4) 30 min,
filtuojama, filtratas surenkamas.
2. Kartojama ekstrakcija su 80 ml tirpiklio, filtruojama, sumaišius filtratus garinamas
acetonas.
3. Perkeliama į dalomąjį piltuvėlį su 10 ml fosfato buferinio tirpalo, pH 5,8, ekstrahuojama
24
4. Sujungiame etilacetato sluoksnį, išgariname vakuume, likutį tirpiname 10 ml buferinio
fosfato tirpalo, pH 5,8.
5. Kiekybiškai perkeliame į kolonėlę su 20 g kieselguru ir 5 ml buferinio tirpalo.
6. Palaukus 15 min., išplauname kolonėlę 100 ml etilacetatu, gariname vakuume.
7. Tirpiname 2,5 ml sistemoje: tetrahidrofuranas – metanolis - vanduo (10:20:75) ir
injekuojame 100 μl į ESC.
8. ESC 5 μm 250 x 4mm C18 kolonėlė, 1,0 ml/min tetrahidrofuranas – metanolis - vanduo
(10:20:75).
9. Refraktometrinis detektorius, skaičiuojama pagal atitinkamus faktorius lyginant su
benzilalkoholiu [35,37].
Šio metodo metu ginkgolidai lengvai išplaunami koncentruotu organiniu tirpikliu.
2.4.3 Išskyrimas ir aptikimas
Terpenotrilaktonų išskyrimui ir aptikimui naudojami šie metodai:
1. Plonasluoksnė chromatografija;
2. Dujų chromatografija;
3. Efektyvioji skysčių chromatografija.
Chromatografija yra fizikinės – cheminės analizės metodas, pagrįstas junginių išskirstymu dėl skirtingos mišinio komponentų fizikinės – cheminės sąveikos su nejudria ir judria fazėmis. Skirstymo metu bandinio komponentai pasiskirsto tarp nejudrios ir judrios fazės. Po atskyrimo juos galima nustatyti kiekybiškai ir kokybiškai. Chromatografinės analizės stadijos: bandinio įleidimas, skirstymas, atskirtų analičių detekcija ir gautų duomenų apdorojimas bei įvertinimas [22].
Chromatografija paplito dėl atrankumo, paprastumo, analizės atlikimo spartos. Derinant chromatografiją su kitais analizės metodais, galima automatizuoti metodą. Svarbu tai, kad chromatografiniai metodai universalūs, t.y. juos galima taikyti kietiems, skystiems, dujiniams neorganiniams bei organiniams junginiams atskirti ir jų kiekiams nustatyti, be to yra labai platus nustatomųjų medţiagų koncentracijų intervalas [22].
25
2.4.3.1 Plonasluoksnė chromatografija
Ginkgolidai ir bilobalidas taip pat gali būti išskiriami plonasluoksnės chromatografijos metodu, kai naudojama silikageliu dengta plokštelė. Tirpiklių sistemos gali būti įvairios: tolueno ir acetono (7:3), cikloheksano – etilacetato (1:1), etilacetato – tolueno – acetono – heksano (4:3:2:1) ir trichlormetano - acetono – skruzdţių rūgšties (75:16,5:8,5). Prieš tyrimą plokštelę impregnavus natrio acetatu kartu su metilo acetatu, kaip tirpikliais, gaunamos šiek tiek aiškesnės, ryškesnės dėmės ir gerenė skiriamoji geba.
Rf vertės maţėja atitinkama tvarka: bilobalidas, ginkgolidas A, ginkgolidas B, ginkgolidas J, ginkgolidas
C. Šis metodas aprašytas Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėjoje, kaip kokybinis ginkmeţio lapų tyrimas [35].
Taip pat gali būti naudojama kietų fazių ekstrakcija – plonasluoksnė chromatografija –
densitometrijos metodas, kurį aprašė X. Peishan ir kt. (2001):
1. 3 g ginkmedţio lapų miltelių ekstrahuojama ardant ultragarsu 20+15 min su 2 x 80 ml
metanolis - vanduo (1:9)
2. Filtruojame, sujungiame filtratus, paleidţiame per poliamidinę šerdelę ir plauname 100 ml
vandens.
3. Išgariname eliuatą, tirpiname 5 ml metanolio, maišome su 3 g silikagelio. Dţioviname 4
valandas virš fosforo pentoksido (P2O5)vakuume.
4. Perkeliame silikagelį į kietos fazės ekstrakcijos kolonėlę uţpildytą 5g aktivuoto silikagelio,
plauname su 200 ml trichlormetano – metanolio (1:1).
5. Gariname eliuatą, tirpiname 1,0 ml metanolio.
6. Su automatiniu pavyzdţio ėmikliu uţdedame 6 – 10 μl tirpalo ant silikagelio plokštelės,
impregnuotos natrio acetatu.
7. Plokštelę dţioviname daugiau nei 4 val virš fosforo pentoksido (P2O5), palaikome
plokštelę virš vandeninio H2SO4 tirpalo.
8. Patalpiname plokštelę į tirpiklių sistemą: toluenas – etilacetatas – acetonas – metanolis
(10:5:5:0,6).
9. Išgariname tirpiklius, kaitiname plokštelę 30 min 160 °C temperatūroje, skanuojame
chromatogramą plonasluoksnės chromatografijos skaneriu λ=366 nm, kalibruojame pagal antros eilės daugianarę regresiją, suskaičiuojame rezultatus [35, 37 ].
26
2.4.3.2 Dujų chromatografija
Prieš analizę sililinimas yra būtinas, nes ginkgolidai ir bilobalidas yra nelakūs. Tai yra pagrindinis trūkumas lyginant su efektyviąja skysčių chromatografija. Išskyrimas taip pat geras kaip ir aptikimas liepsnos jonizacijos detektoriaus pagalba, kuris geresnis uţ kitus detektorius atkuriamumu, bazinės linijos stabilumu, jautrumu. Hasler ir Meier ištyrė sililinimo procesą ir jį aprašė. Po sililinimo mišinys turi būti injekuotas tiesiai į dujų chromatografą išvengiant desililinimo problemų. Aptikimo kiekis varijuoja nuo 50 ng iki 100 ng ir ţemas santykinis derivacijos standartas (1–2 proc.) [37].
Be liepsnos jonizacijos detektoriaus, gali būti naudojami ir kiti detektoriai: elektronų sugavimo ir masių spektrometrijos. Elektronų sugavimo detektorius taip pat yra pakankamai jautrus, jei derivacija vyksta su reagentais, turinčiais halogenų, pavyzdţiui heptafluorbutiriniu anhidridu [37].
Aptikimo riba ţemesnė nei 1 pg, todėl gali kilti problemų dėl bilobalidų darinių stabilumo. Ši derivacija yra maţos praktinės reikšmės kasdienei lapų ar ekstraktų analizei, kur itin didelis jautrumas nereikalingas [35].
Tačiau šiuo metodu tyrimas nelakiųjų junginių sudėtingas – tik apie 20 proc. visų organinių junginių gali būti tiriami šiuo metodu, papildomai nenaudojant cheminio apdorojimo.
2.4.3.3 Superkritinių skysčių chromatografija
Superkritinių skysčių chromatografija taip pat gali atskirti ginkmedţio terpenotrilaktonus. Naudojant Deltabond deaktivuoto aminopropilo efektyviosios skysčių chromatografijos kolonėlę (150 x 4,6, 5μm ) su 12 proc. metanolio anglies diokside skysčio pavidalu (280 atm, 3,5 ml/min, 40°C temperatūros) bazinė linija bilobalido ir nagrinėjamų ginkgolidų gali būti išskirta per 9 min. Aptikimas vykdomas šviesos sklaidos detektoriaus pagalba. Aptikimo riba apytiksliai 10 ng. Sistemos selektyvumas aukštesnis nei efektyviosios skysčių chromatografijos. Dauguma ginkmedţio priemaišų yra labiau polinės nei terpenotrilaktonai. Pirmiausiai išvaloma ir priemaišos pasilieka kolonėlėje. Švaresnė chromatograma gaunama, kai pavyzdys išvalomas silikagelio pagalba. Kai kurie standartizuoti ekstraktai gali būti analizuojami ir be valymo. Taigi, superkritinio skysčio chromatografija galima analizuojant ginkmedţio ekstraktą, nes šis metodas greitas, suvartojama maţai organinių tirpiklių ir daug paprastesnis mėginių išvalymas. Tačiau eliuatai naudojami kritinėmis sąlygomis gali būti toksiški ar pernelyg brangūs, sudėtinga aparatūra. Todėl šis metodas nėra labai populiarus [35].
27
2.4.3.4 Efektyvioji skysčių chromatografija
Šiuolaikinė efektyvioji skysčių chromatografija – plačiai paplitusi chromatografijos rūšis. Klasikinė kolonėlinė skysčių chromatografija turi nemaţai trūkumų: nedidelis eliuento tekėjimo greitis ir dėl to lėtas atskyrimas, atskirtas frakcijas reikia analizuoti kitais metodais. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo atsiradimą lėmė ir ta, kad reikėjo analizuoti aukštos virimo temperatūros (>400° C) bei nepatvarius junginius, kurių dujų chromatografijai atskirti nepavykdavo. Antra, reikėjo padidinti skysčių atskyrimo spartą ir efektyvumą. Tam buvo panaudotos maţo vidinio skersmens kolonėlės (2–6 mm). Masės mainams padidinti buvo sumaţintas sorbento dalelių skersmuo (5–50 μm), o tai savo ruoţtu privertė iki 0,5–40 MPa padidinti slėgį [35, 37].
Efektyviojoje chromatografijoje gali būti panaudojami visi chromatografinio atskyrimo mechanizmai: adsorbcija, pasiskirstymas, jonų mainai ir kt. Paprastai atskyrimą sudaro keli mechanizmai, pavyzdţiui, adsorbcija, pasiskirstymas, ekskliuzija ir panašiai. Pagal naudojamų sorbentų rūšį galimi du efektyviosios skysčių chromatografijos variantai: normaliųjų fazių ir atvirkštinių fazių chromatografija. Didelis efektyviosios skysčių chromatografijos pranašumas yra tas, kad galima taikyti izokratinį arba gradientinį eliuavimą ir taip pagerinti junginių atskyrimą [13].
Atvirkštinės fazės efektyvioji skysčių chromatografija terpenotrilaktonų išskyrimui puikiai tinka dėl nesudėtingos technikos šių junginių analizei, nes jų lydymosi temperatūra yra aukšta, šie junginiai nelakūs. Geriausios tirpiklių sistemos: vanduo – metanolis (~70:~30); vanduo – metanolis – tetrahidrofuranas (~70:~20:~10) [35, 37].
Šie tirpikliai yra gana skirtingo atrankumo. Naudojant minėtą vanduo – metanolis –
tetrafidrofuranas sistemą, chromatogramoje smailės labiau išsisklaidę ir lygiau išsibarstę. Kadangi į šią sistemą įeina tetrahidrofuranas, ne visi refraktometriniai detektoriai gali veikti.
Iš pradţių terpenotrilaktonų aptikimui buvo bandytas ultraviotetinės spinduliuotės detektorius. Tačiau šis pasirinkimas nebuvo geras, nes maţa ε vertė ir neselektyvus bangos ilgis – 219 nm. Todėl dominančios smailės chromatogramoje buvo aptemdytos absorbcijos pėdsakų junginių, likusių dalinai išvalytame ekstrakte. Daug geresni, maţiau nukrypimų rodantys detektoriai: refraktometrinis detektorius, šviesos sklaidos detektorius [35, 37].
Abu metodai yra naudojami terpenotrilaktonų analizei po išskyrimo. Šviesos sklaidos detektorius yra pranašesnis uţ refraktometrinį detektorių, nes bazinė linija yra stabilesnė, suderinami su tetrahidrofuranu ir gradientai, maţi tirpiklių pikai ir geresnis jautrumas. Refraktometrinis detektorius pranašesnis, nes didesnės linijiškumo ribos, maţesni kaštai, platesnis pritaikymas.
28
2.5 Ginkmedţio preparatų panaudojimas medicinoje
Ginkmedţių lapuose esančios vaistinės medţiagos veikia kraujagyslių tonusą, gerina reologines kraujo savybes, audinių metabolizmą, saugo membranas, kad jų nepaţeistų laisvieji radikalai. Taip gerina audinių, galvos smegenų, taip pat širdies vainikinę ir periferinę kraujotaką, veikia venų tonusą, stiprina kapiliarų sieneles, maţina kraujo klampumą ir slopina trombocitų agregaciją [1, 12, 30].
Bandymais yra nustatyta, kad flavonoidai stiprina endotelio spazmus atpalaiduojančio veiksnio poveikį kraujagyslių sienelėms, tokiu būdu skatindamas spazmuotas kraujagysles atsipalaiduoti. Geras gydomasis poveikis pastebėtas pacientams, kurių sutrikusi smegenų kraujotaka, taip pat kuriems bėgant metams atsiranda galvos smegenų funkcijų pokyčių, t.y. silpsta atmintis, vis maţėja gebėjimas sutelkti dėmesį, vargina depresija, galvos svaigimas, spengimas ausyse, galvos skausmas [2, 3, 5, 41].
Eksperimentiniai duomenys rodo, kad ginkmedţių kaupiamos vaistinės medţiagos, aktyvindamos gliukozės utilizavimą ir ATF sintezę, gerina ląstelių energijos apykaitą, stabilizuoja ląstelių membranas deguonies stygiaus sąlygomis. Padeda gerinti smegenų medţiagų apykaitą, norminti impulsų perdavimą, apsaugoti smegenų ląsteles nuo hipoksijos. Badymais in vivo įrodytas gebėjimas apsaugoti smegenų ląsteles, kai susidaro išemijos sąlygos. Gyvūnai, gavę geriamojo ginkmedţių ekstrakto, hipoksijos sąlygomis išgyveno ilgiau nei kontrolinės grupės gyvūnai. Eksperimentiniai duomenys taip parodo teigiamą biologiškai aktyvių medţiagų poveikį gyvūnams, kurių smegenų kraujotaka sutriko dėl embolijos ar smegenų edemos, atsiradusios po traumos arba neurotoksinių medţiagų poveikio [1, 2, 9, 29, 40].
Ginkmeţio preparatai padeda sergantiesiems Reynaud sindromu, sutrikus kraujotakai dėl flebito, taip pat kai sergama kraujagyslinėmis arba involiucijos sukeliamomis vidinės ausies ligomis, kurioms būdingas spengimas ausyse, svaigulys [2].
Tyrimų duomenimis yra patvirtintas ginkmedţio poveikis gydant protarpinį šlubumą. 24 savaites trukusiame, dvigubai aklame, placebo kontroliuojamame tyrime dalyvavo 111 pacientų. Jo metu nustatytas skausmą maţinantis ginkmedţio poveikis lyginant su placebu. Kito dvigubai aklo, kontroliuojamo placebu, tyrimo metu, trukusio taip pat 24 savaites, buvo siekiama nustatyti efektyviausią dozę. Dalyvavo 74 pacientai kamuojami protarpinio šlubumo, kurie teigė, kad 120 mg dozė ginkmedţio ekstrakto du kartus per dieną yra efektyvesnė nei 60 mg dozė du kartus per dieną [24]. Vartojant ginkmedţio preparatus aprimsta spazminiai blauzdų skausmai, maţiau maudţia kojas, kai ilsisi po krūvio. [2].
Moksliniuose šaltiniuose teigiama, kad ginkmedţio preparatai gali būti vartojami galvos svaigimo ir kalnų ligos sindromų sukeltiems simptomams maţinti [5]. Tris mėnesius trukusio tyrimo metu 70 individų, kurie iki tol buvo varginami įvairių svaigimo sindomų, kasdien vartojo 160 mg ginkmedţio
29
ekstrakto du kartus per dieną. Tyrimas buvo dvigubai aklas, kontroliuojamas placebo. Tyrimo rezultatai parodė, kad efektas buvo didesnis tiems pacientams, kurie vartojo ekstaktą, nei tiems, kurie vartojo placebą. Taip pat buvo vykdomas dvigubai aklas, placebo kontroliuojamas tyrimas, kuriame dalyvavo 44 alpinistai iš Himalajų ekspedicijos. Buvo nustatyta, kad kasdienė 160 mg standartizuoto ginkmedţio ekstrakto neleido pasireikšti kalnų ligos sindromams, taip pat simtomams, susijusiems su itin ţema temperatūra [24].
Dvigubai aklų, placebo kontroliuojamų ginkmedţio tyrimų pagalba buvo nustatyti reikšmingi įrodymai apie jo poveikį Alzheimeriu ir demensija sergančių ţmonių sveikatai [10]. Tyrimuose trukusiuose 52 savaites dalyvavo 309 pacientai. Poveikis buvo nustatytas remiantis elgsena grįstais testais, kur buvo vertinama atmintis ir kalba (Alzhaimerio ligos vertinimo skalė). Taip pat buvo vertinama pagal slaugytojų vertinimus (geriatrinis vertinimas pagal giminaičių vertinimo aktus). Kiti Europoje atlikti tyrimai vertino ginkmedţio efektyvumą gydant Alzheimerio ir ne Alzheimerio demencijos ligas ir taip pat buvo nustatytas poveikis. Be to, daugiau nei 40 kitų dvigubai aklų tyrimų nustatė teigiamą ginkmedţio poveikį gydant demensiją dar prieš 1992 metus. Aštuoni iš jų buvo vertinami kaip geros kokybės, įtraukiantys iš viso apie 1000 pacientų ir rezultatai visų buvo teigiami [24, 25].
Mokslinių tyrimų metu buvo vertinamas ir ginkmedţio poveikis atminties ir protinės veiklos gerinimui tarp jaunų, sveikų ţmonių. 30 dienų trukusio dvigubai aklo tyrimo, kontroliuojamo placebu, metu, į kurį buvo įtraukta 61 sveiki vyrai ir moterys, buvo vertinamas 120 mg ginkmedţio ekstrakto poveikis. Rezultatai parodė reikšmingą poveikį, kai buvo vertinama atminties funkcija, įskaitant mokymosi atmintinai rezultatus taip pat ir darbinės atminties greitį [6, 24]. Kitame dvigubai aklame tyrime, kontroliuojamame placebo, 20 ţmonių 19 – 24 metų amţiaus vartojo 120mg, 240mg ir 360mg ginkmedţio ektrakto ar placebo vieną dozę. Vertinant protinę veiklą teigiamus rezultatus parodė 240mg ir 360mg dozės. Ţymiausias poveikis buvo pastebėtas vertinant galimybę sutelkti dėmesį, kai uţduotys reikalauja greitos reakcijos [18, 24].
Į ginkmedţio sudėtį įeinantys flavonoidai veikia kaip antioksidantai [14, 27, 28]. Jie yra organizme susidarančių laisvųjų radikalų „gaudytojai“. Flavonoidai geba sujungti laisvuosius radikalus, pašalindamos ţalingą jų poveikį ląstelių membranoms. Sergant išemija, hipoksija ir esant kitiems medţiagų apykaitos sutrikimams, didėja laisvųjų radikalų gamyba. Jie paţeidţia fermentų sistemas ir ląstelių membranas, kraujagysles plečiančių ir trombocitų agregaciją stabdančių bei jas sutraukiančių medţiagų pusiausvyrą [17]. Flavonoidai taip pat gerina kraujotaką ir saugo eritrocitus nuo hemolizės, o stiprindami deguonies ir angliavandenių pasisavinimą audiniuose, palaiko normalią ląstelių medţiagų apykaitą [2, 12, 30].
30
Ginkmedis, dėl lapuose kaupiamų biologiškai aktyvių medţiagų, gali būti vartojamas siekiant palengvinti priešmenstruacinio sindromo sukeltus simptomus. Vienas dvigubai aklas, placebo kontroliuojamas tyrimas įvertino poveikį skysto ginkmedţio ekstrakto (80 mg du kartus per dieną) palengvinant priešmenstruacino sindromo simptomus. Tyrime dalyvavo 143 moterys 18 – 45 metų amţiaus. Ginkmedţio ekstraktą vartojo du menstruacinius ciklus. Visos moterys pripaţino, kad buvo varginamos priešmenstruacinio sindromo bent tris menstruacijos ciklus iš eilės iki tyrimo. Kai tyrimas prasidėjo, kiekviena moteris vartojo 80 mg ginkmedţio du kartus dienoje arba placebą nuo šešioliktosios ciko dienos. Gydymas buvo tęsiamas iki penktos kito ciklo dienos ir vėl atnaujintas šešioliktąją ciklo dieną. Tyrimo dalyvės galėjo padvigubinti dozę, jei jautė, kad simptomai itin vargina. Rezultatai parodė, kad ginkmedţio ekstrakto vartojimas sumaţino krūtų jautrumą taip pat ir emocinius simptomus. [24]
Įvairios Candida rūšys, C. Albicans yra pagrindiniai sisteminių ir vietinių infekcijų sukėlėjai. Buvo nustatytas ginkmedţio kaupiamų terpenų priešuţdegiminis veikimas gydant reumatiniu artritu sergančius gyvūnus, kai sukėlėjas C. Albicans [14]. Taip pat literatūros šaltiniuose nurodoma, kad ginkmedţio ekstraktas gali būti vartojamas kraujospūdţiui reguliuoti, kaip broncholitinis, astmai gydyti skirtas vaistas [26].
Nerekomenduojama vartoti ginkmedţio preparatų esant hemoragijos tikimybei. Mokslinių tyrimų duomenimis, dviskiaučio ginkmedţio kaupiamas ginkgolidas B sulėtina proliferaciją ir dauginimąsi pelių embrionų kamieninių ląstelių in vitro ir sukelia vystymosi sutrikimus in vivo. Todėl remiantis tyrimų duomenimis galima daryti prielaidą, kad vartojant ginkmedţio ekstraktą, galimas neigiamas efektas embriogenezei. Todėl besilaukiančioms moterims vartoti šių preparatų nerekomenduojama [7].
Taip pat įrodyta, kad tinito gydymas ginkmedţio preparatais nėra veiksmingas [31]. Moksliniuose šaltiniuose teigiama, jog ginkmedis turi antimikrobinį poveikį teigiamoms ir Gram-neigiamoms bakterijoms, tačiau šis poveikis dar maţai ištirtas [23].
Viršijus terapines dozes ir ilgai vartojant ginkmedţio praparatus gali sutrikti miegas, širdies ritmas, padidėti arterinis kraujospūdis [3]. Galima sąveika su antikoaguliantais [1, 4].
31
2.6 Terpenolaktonų farmakokinetika
Farmakokinetika ir bioprieinamumas ginkgolidų A ir B ir bilobalido buvo tyrinėjamas 12 sveikų jaunų savanorių pagalba. Buvo tiriamas standartizuoto ginkmedţio lapų ektrakto vartojimas per os (nevalgius ir po įprasto maisto) ir suleidus vieną šio ektrakto dozę į veną. Per os dozė (120 mg ektrakto) atitinka 1,44 mg ginkgolido A, 1,03 mg ginkgolido B ir 3,36 mg bilobalido. Plazmos ir šlapimo mėginiai buvo imami 36 valandas ir po 48 valandų buvo vertinami. Kai ekstraktas buvo vartojamas per os nevalgius buvo nustatytas labai geras ginkgolidų A ir B bei bilobalido bioprieinamumas: atitinkamai 80 proc. , 88 proc. ir 79 proc. [17].
Per os suvartojus ekstrakto po valgio bioprieinamumas nesumaţėjo ir pasikeitė tik tai, kad didţiausia koncentracija buvo uţfiksuota vėliau. Didţiausia koncentracija kraujyje nevalgius buvo uţfiksuota nuo 16,5 iki 33,3 ng/ml, suvartojus įprasto maisto - nuo 11,5 iki 21,1 ng/ml. Vidutinis plazmos eliminacijos pusperiodis buvo uţfiksuotas intervale 9,5 – 10,6 valandų ginkgolido B ir 3,2 – 4,5 valandų ginkgolido A ir bilobalido. Ektrakto suleidus į veną eliminacijos pusperiodis ginkgolido A ir bilobalido buvo panašus kaip ir suvartojus per os, o ginkgolido B eliminacijos pusperiodis trumpesnis. Suvartojus ektrakto per os nevalgius Ginkgolido A, B ir bilobalido išsiskyrimas su šlapimu apskaičiuotas atitinkamai 72 proc., 41proc., 31proc. [17, ].
32
2.7
Analitinės metodikos validacija
Prieš vykdant analizės procesą, labai svarbu sukurti tinkamą fitocheminę metodiką (kitaip, išvystyti) ir moksliškai pagrįstai sukurtą metodiką įteisinti (patvirtinti, validuoti). Kuriant ir diegiant naują cheminio tyrimo metodiką būtina ją išvystyti, tobulinti, įteisinti ir taikyti.
Sunku atskirti metodikos vystymą ir sistemos tobulinimą nuo metodikos validacijos – visi šie ţingsniai sudaro vieną nepertraukiamą procesą. Validacija – tai protokoluotas metodikos charakteristikų pateikimas, įrodantis metodikos tinkamumą. Validacijos procedūra prasideda nuo pirmų proceso ţingsnių, tačiau baigta gali būti tik pabaigus vystymo ir tobulinimo darbus. Būtent išvystytai metodikai atliekami eksperimentai tinkamumui įrodyti [8, 19, 32, 34].
2.8 Esminiai validacijos parametrai
Metodikos validacijos parametrai buvo apibrėţti skirtingų nacionalinių ir tarptautinių komitetų ir apibūdinti literatūroje. Tačiau vis dėlto, kai kurie apibrėţimai skirtingose organizacijose nesutampa. Tarptautinės konferencijos suderinimo klausimais (International Conference on Harmonization, kitaip ICH) metu buvo siekiama suderinti parametrus farmaciniam naudojimui. Jos metu pramonės, kontrolės agentūrų atstovai iš Jungtinių Amerikos Valstijų, Europos ir Japonijos apibūdino parametrus ir aprašė analitinių metodikų validacijos metodologiją [32].
Analizės matodo validacijos parametrai.
1. Metodikos atrankumas – įtrauktas į ICH publikacijas ir Jungtinių Amerikos valstijų
farmakopėją (United States Pharmacopoeia, kitaip USP).
Metodikos atrankumas arba specifiškumas, angl. Specificity, yra gebėjimas vienareikšmiškai įvertinti analitės buvimą.
Esant daugiakomponenčiui mišiniui, ar mėginiui, kuriame gali būti priemaišų, pateikiama standartinė mėginio chromatograma, ,,tuščio” mėginio (injektuojamas atitinkamas kiekis tirpiklio) ir tiriamo mėginio chromatogramos [8, 19].
2. Analitės nustatymo tikslumas – įtrauktas į ICH publikacijas ir USP.
Nustatymo tikslumas, angl. Accuracy, išreiškia artumą susitarimo tarp nustatytosios ir tikrosios vertės. Vaistinio preparato kiekiniam vertinimui nustatymo tikslumas patvirtinamas įteisinus rezultatų glaudumą, tiesiškumą ir atrankumą. Tikslumas turi būti patvirtintas būtinose ribose , kurios aprašomos skirsnyje „Ribos ir tiesiškumas“.
33
A. Veikliajai medţiagai.
Reikia įrodyti, jog nėra gamybos preimaišų, trukdančių nustatymui.
1) Smailės plotas gali būti lyginamas su smailės plotu ţinomo grynumo etalono.
2) Gali būti naudojama gerai pagrįsta farmakopėjinė nustatymo procedūra. Lyginami abejomis procedūromis gauti rezultatai.
3) Kartu naudojamos kitos analitinės technikos: drėgmės, metalų priemaišų, terminė gravimetrinė analizė ir kt.
4) Nustatymo tikslumas patvirtinamas įteisinus rezultatų glaudumą, tiesiškumą ir atrankumą.
B. Galutiniam produktui.
1) Metodika patikrinama pagaminus produktą su tiksliai ţinomais kiekiais tiriamos analitės (pagalbinės medţiagos privalo būti tokiais kiekiais kaip produkte).
2) Gali būti naudojama gerai pagrįsta farmakopėjinė nustatymo procedūra. Lyginami abejomis procedūromis gauti rezultatai.
3) Gali būti įvertinama pridedant ţinomus skirtingus kiekus ţinomo grynumo analitės etalono į preparatą ar analizuojamą mėginį.
4) Nustatymo tikslumas patvirtinamas įteisinus rezultatų glaudumą, tiesiškumą ir atrankumą. C. Priemaišos.
1) Metodika patikrinama pagaminus produktą su tiksliai ţinomais kiekiais tiriamos analitės, visos pagalbinės medţiagos privalo būti tokiais kiekiais kaip produkte ar veikliojoje medţiagoje.
2) Gali būti naudojama kita pagrįsta nustatymo procedūra. Lyginami abiem procedūrom gauti rezultatai [8, 19, 32].
Būtina tiksliai nurodyti kiekio nustatymo metodiką, pvz.: proc. m/m, smailės ploto proc.
3. Rezultatų glaudumas.
Metodikos rezultatų glaudumas, angl. Precision, nustatomas atlikus matavimų seriją naudojant tą patį tiriamą mėginį pagal nustatytus reikalavimus. Vertinant glaudumą analitinės procedūros paprastai išreiškiamos dispersija, standartiniu nuokrypiu arba variacijos koeficientu iš eilės matavimų. Metodikos glaudumas gali būti įvertinamas esant trims lygiams: pakartojamumo, tarpinio preciziškumo ir
atkuriamumo.
Pagal dominančių smailių sulaikymo laikų, smailių plotų vidurkius ir standartinį nuokrypį skaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis SSN% (standartinio nuokrypio ir vidurkio reikšmės santykis), kitaip variacijos koeficientas (angl. RSD% arba CV%).
34
Įvertinimui naudotojams charakteristikos: programinės įrangos suintegruotos smailės plotas [mAU×s], analitės sulaikymo trukmė [min], programinės įrangos apskaičiuotas analitės kiekis ir variacijos charakteristikos [8, 19, 32, 34].
Tinkamumo kriterijus yra variacijos koeficientas, kuris nėra tiksliai apibrėţtas, tačiau nurodoma, jog neturėtų viršyti 5 proc.
1) Pakartojamumas –įtrauktas į ICH publikacijas.
Pakartojamumas, angl. Repeatability. Išreiškia tikslumą tomis pačiomis veikimo sąlygomis per trumpą laiko tarpą. Pakartojamumas skaičiuojamas iš tą pačią dieną viena po kitos atliktų analizių rezultatų.
a) Gali būti skaičiuojama iš 6 analizės pakartojimų naudojant 100 proc. preparatą b) Gali būti skaičiuojama iš 9 analizės pakartojimų, atliekant tyrimus nustatytose ribose.
Šiuo atveju naudojami 3 pakartotinių injekcijų 3 skirtingų koncentracijų duomenys 2) Tarpinis preciziškumas –įtrauktas į ICH publikacijas.
Tarpinis preciziškumas, angl. Intermediate precision. Vertinamas skirtingomis dienomis, skirtingiems analitikams ir t.t. Gali būti vertinamas: diena po dienos – kelias dienas (nebūtinai iš eilės) atliktų to pačio bandinio analizių.
Tinkamumo kriterijus yra variacijos koeficientas, kuris nėra tiksliai apibrėţtas, tačiau nurodoma, jog neturėtų viršyti 10 proc.
Statistiškai duomenys gali būti apdoroti testais: F-test, t-test. Testai turi pagrįsti rezultatų išsibarstymo nereikšmingumą.
Atlikama 18 vieno ir to paties mėginio injekcijų: 3 skirtingas dienas atlikti po 6 pakartotines injekcijas.
Įvertinimui naudojamos charakteristikos: programinės įrangos apskaičiuotas analitės kiekis ir variacijos charakteristikos (variacijos koeficientas, F-test, t-test).
3) Atkuriamumas – parametras įtrauktas į ICH publikacijas, bet nėra būtinas.
Atkuriamumas, angl. Reproducibility. Atkuriamumas išreiškia metodikos tikslumą tarp laboratorijų (bendruose tyrimuose paprastai taikoma metodikos standartizacija) [8, 19, 32, 34].
4. Ribos ir tiesiškumas – įtrauktas į ICH publikacijas ir USP.
Ribos, angl. Range yra tarpas tarp viršutinės ir apatinės koncentracijos (kiekinės) kuriame buvo įrodyta, kad analizės procedūros yra tinkamos naudojimui. Daţniausiai sutampa su ribomis, kuriose nustatytas tiesiškumas.
35
Veikliajam junginiui farmaciniame preparate būtina pagrįsti nuo 80 iki 120 proc. ribas (nuo deklaruojamo kiekio), kartais rekomenduojama 50-150 proc. (kartu ir vystant naują analitinę metodiką).
Tiesiškumas, angl. Linearity yra gebėjimas (nustatytose ribose) gauti detektoriaus atsako įverčius chromatogramose (t.y. programinės įrangos suintegruotos smailės plotas [mAU×s]), kurie tiesiogiai proporcingi analitės kiekinei koncentracijai (suma) mėginyje. Įvertinama kalibravimo kreivės metodu. Kartu nustatomas ir išsibarstymas RSS (angl. residual sum of squares).
Nurodoma 5 etaloninių junginių tirpalo praskiedimų gamyba, koncentracijos. Pateikiama kalibravimo kreivė.
Pateikiama lentelė su kreivės charakteristika (R, paklaida). R turi būti ≥0,999, arba 0,98 (priemaišoms, valymo priemonėms).
1) Aptikimo riba, angl. Detection Limit. Aptikimo riba yra maţiausias kiekis analitės
mėginyje, kuris gali būti aptinkamas, bet nebūtinai nustatomas kiekybiškai. Šis parametras gali būti vertinamas esant nedidelei junginių koncentracijai mėginio matricoje. Nustatant veikliosios medţiagos kiekį vaistiniame preparate netaikomas.
2) Kiekybinio nustatymo riba, angl. Quantitation Limit. Tai maţiausias analitės kiekis, kuris
gali būti kiekybiškai nustatomas tinkamo tikslumo ribose. Šis parametras gali būti vertinamas esant nedidelei junginių koncentracijai mėginio matricoje. Nustatant veikliosios medţiagos kiekį vaistiniame preparate netaikomas [8, 19, 32, 34].
5. Metodikos atsparumas - parametras įtrauktas į ICH publikacijas, bet nėra būtinas, įtrauktas
36
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS
3.1 Tyrimo objektas ir metodika
3.1.1 Tyrimo objektas
Eksperimentų metu buvo tiriama GINKOBIL preparato vaistinė medţiaga Serija: G24 067514-000 (gamybos data 2006 – 04, tinkamumo laikas iki 2011 – 04, kiekis 20g) ir iš jos pagamintos GINKOBIL 40 mg vaistinio preparato pilotinės serijos: P0304, P0305, P0306, P0304D, P0305D, P0306D.
3.1.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Naudojama analitinė aparatūra ir priedai
1. ESC chromatografas Waters Alliance 2695 separation module.
2. Detektorius: Alltech 3300 ELSD (Grace, JAV), kurio šviesos šaltinis yra 630nm lazerinis
diodas.
3. ESC kolonėlė: Discovery C8 25 cm x 4,6 mm , 5 µm, Supelco, serijos nr. 94245 – 03
4. Programinė įranga: Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation,
Milford, JAV).
Naudoti reagentai
Acetonitrilas gradientinio švarumo klasės: ≥99,9 proc. (gamintojas: Sigma – Aldrich INC). Tetrahidrofuranas, stabilizuotas, švarumas: ≥99,9 proc. (gamintojas: Sigma – Aldrich Lasborchemikalien).
Dejonizuotas vanduo, kuris gaminamas laboratorijoje, naudojant išgrynintą vandenį. (Millipore, JAV)
Naudoti etalonai
Eksperimento metu buvo naudojamas ginkmedţių sausasis ekstraktas smailių identifikavimui (CRS). Kalibracinei kreivei sudaryti buvo naudojami terpenolaktonų etaloniniai junginiai gauti iš ChromaDex (JAV). Kokybės sertifikatai laboratorijoje.
Naudotos serijos:
1. Part: ASB – 00007176 – 005 Ginkgolide A Qty: 5mg. Lot: 07146 – 401.
Galiojimas: 05/2012
2. Part: ASB – 00007181 – 005 Ginkgolide B Qty: 5mg. Lot: 07181 – 502.
Galiojimas: 08/2012
3. Part: ASB – 00007179 – 005 Ginkgolide C Qty: 5mg. Lot: 07179 – 000.
Galiojimas: 12/2012
37
Etaloninio tirpalo paruošimas.
Patalpiname 0,129 g ginkmedţio sausojo ekstrakto smailių identifikavimui palyginamojo standarto į 25 ml kolbutę ir maišant ištirpiname 10 ml buferinio fosfato tirpalo, kurio pH 5,8. Tuomet gautą tirpalą perpilame į chromatografinę kolonėlę, kurios ilgis apie 0,15 m, o vidinis skersmuo apie 30 mm. Ji turi būti uţpildyta 15 g kieselguru. Kolbutę du kartus po 5 ml perplauname buferiniu fosfato tirpalu, kurio pH 5,8 ir supilame į chromatografinę kolonėlę. Paliekame 15 min. Plauname 100 ml etilacetato. Eliuatą gariname iki sausumo didesniame nei 4kPa slėgyje, 50 ºC temperatūros vandens vonelėje. Tirpiklio likutis pašalinamas oro srovės pagalba. Likutį įdedame į 2,5 ml judriosios fazės. Pieš suleidţiant į chromatografinę kolonėlę tirpalas filtruojamas pro 0,45 µm porų dydţio PVDF filtrą (Restek, Kinija).
GINKOBIL vaistinės medţiagos tiriamojo tirpalo paruošimas
0,120 g vaistinės medţiagos perkeliame į 25 ml kolbutę ir maišant ištirpiname 10ml buferinio fosfato tirpalo, kurio pH 5,8. Tuomet gautą tirpalą perpilame į chromatografinę kolonėlę, kurios ilgis apie 0,15 m, o vidinis skersmuo apie 30mm. Ji turi būti uţpildyta 15 g kieselguru. Kolbutę du kartus po 5 ml perplauname buferiniu fosfato tirpalu , kurio pH 5,8 ir supilame į chromatografinę kolonėlę. Paliekame 15 min. Plauname 100 ml etilacetato . Eliuatą gariname iki sausumo didesniame nei 4kPa slėgyje, 50 ºC temperatūros vandens vonelėje. Tirpiklio likutis pašalinamas oro srovės pagalba. Likutį įdedame į 2,5 ml judriosios fazės. Pieš suleidţiant į chromatografinę kolonėlę tirpalas filtruojamas pro 0,45 µm porų dydţio PVDF filtrą (Restek, Kinija).
GINKOBIL vaistinio preparato tiriamojo tirpalo paruošimas
Į 10 ml matavimo kolbą atsveriama 1 g kapsulių turinio masės, uţpilama 8 ml eliuento, tirpinama ultragarso vonelėje 5 min ir praskiedţiama eliuentu iki ţymės. Gauto tirpalo viršutinės frakcijos 2 ml nufiltruojama per 0,45 µm filtrą į chromatografinį buteliuką.
Etaloninių junginių tirpalų ruošimas kalibravimo kreivės sudarymui
Pradinis tirpalas. Sveriama 50,0 mg etaloninio junginio, tirpinama 100 ml vandens.
Apskaičiuota koncentracija 0,5 mg/ml.
Tirpalas A. Imama 2 ml pradinio tirpalo, skiedţiama vandeniu 10 ml matavimo kolbutėje iki
ţymės. Apskaičiuota koncentracija 0,1 mg/ml.
Tirpalas B. Imama 3 ml pradinio tirpalo, skiedţiama vandeniu 10 ml matavimo kolbutėje iki
38
Tirpalas C. Imama 4,5 ml pradinio tirpalo, skiedţiama vandeniu 10 ml matavimo kolbutėje iki
ţymės. Apskaičiuota koncentracija 0,225 mg/ml.
Tirpalas D. Imama 5 ml pradinio tirpalo, skiedţiama vandeniu 10 ml matavimo kolbutėje iki
ţymės. Apskaičiuota koncentracija 0,25 mg/ml.
Tirpalas E. Imama 6 ml pradinio tirpalo, skiedţiama vandeniu 10 ml matavimo kolbutėje iki
ţymės. Apskaičiuota koncentracija 0,3 mg/ml.
Tirpalas F. Imama 8 ml pradinio tirpalo, skiedţiama vandeniu 10 ml matavimo kolbutėje iki
ţymės. Apskaičiuota koncentracija 0,4 mg/ml.
Analizė
Analitės nustatymui naudojama atvirkštinių fazių ESC skyrimo metodika, atitinkanti Europos farmakopėjos 04/2008:1827 straipsnį, pakeitus detekcijos būdą [33]. Detekcijai naudojamas garinantysis šviesos sklaidos detektorius (angl. ELSD), kurio azoto dujų srautas – 2,5 ml/min; garintojo temperatūra – 55 °C; jautris – 4.
Eliuavimo metodas – izokratinis eliuavimas. Kaip judri fazė naudojama trijų eliuentų sistema: tetrahidrofuranas , metanolis , vanduo (10:20:70 V/V/V).(Atitinka Europos Farmakopėjos 04/2008:1827 straipsnį). Judrios fazės tėkmės greitis – 1.0 ml/min (Atitinka Europos Farmakopėjos 04/2008:1827 straipsnį). Kaip nejudri fazė buvo naudojamas oktilcililo silikagelis (5µ).Naudotas bandinio injekavimo tūris – 10 µl. Kolonėlės temperatūra – 25ºC. Analizės trukmė 25 min. Terpenolaktonai nustatomi pagal jų sulaikymo laiką, lyginant jį su etalonų sulaikymo laiku: ginkgolidas A – apie 14 min, ginkgolidas B – apie 17 min, ginkgolidas C – apie 10 min, bilobalidas – apie 11min.
Kiekybinis terpenolaktonų nustatymas
Kiekinis terpenolaktonų nustatymas atliktas išorinio standarto metodu naudojantis kalibracinėmis kreivėmis, kurios sudarytos naudojant šešis kiekvienai identifikuotai analitei tapataus etalono skiedimus. Etaloniniai junginiai tirpinami vandenyje.
39
3.2 Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas
3.2.1 Metodikos optimizavimas
Optimizavimo pagrindu pasirinkta metodika nurodyta Europos Farmakopėjos 04/2008:1827
straipsnyje. Optimizavimo metu metodika pritaikyta turimai laboratorinei įrangai: pasirinkta kolonėlė, garinatysis šviesos sklaidos detektorius ir jo parametrai, injekcijos tūris, kiekybinio nustatymo metodika.
Chromatografinės kolonėlės vidinio diametro pasirinkimas: Europos Farmakopėjoje nurodytas kolonėlės vidinis diametras – 4 mm. Mūsų pasirinktos kolonėlės vidinis diametras 4,6 mm. Šis diametras atitinka Europos Farmakopėjoje nurodytas 25 proc. nuokrypio ribas (3 – 5 mm), todėl papildomų tyrimų, pagrindţiančių pasirinkimą, nereikia.
Tyrimui pritaikytas garinantysis šviesos sklaidos detektorius. Garinantysis šviesos sklaidos detektorius yra pranašesnis uţ refraktometrinį detektorių, nes bazinė linija yra stabilesnė, suderinamas su tetrahidrofuranu ir gradientai, maţi tirpiklių pikai ir geresnis jautrumas [38]. Pasirinktas Alltech 3300 detektorius, kurio šviesos šaltinis yra lazerinis diodas, todėl jis pranašesnis uţ polichromatinės šviesos šaltinius turinčius detektorius. Nustatyta, kad pasirinktam objektui (sausam, kiekybiškai įvertintam ginkmedţio ekstraktui ir vaistinio praparato GINKOBIL kapsulėms) optimalus azoto dujų srautas yra 2,5 ml/min. , išgarintojo temperatūra – 55 °C.
Injekcijos tūrio optimizavimas: Europos Farmakopėjos straipnyje nurodytas injekcijos tūris – 100 µl. Kadangi nurodytas injekcijos tūris pritaikytas refraktometrui, optimizavimo metu jis buvo sumaţintas. Naudojant garinantįjį šviesos sklaidos detektorių buvo pasirinktas optimalus 10 µl injekcijos tūris.
Kiekybiniam tyrimui Europos Farmakopėjos 04/2008:1827 straipsnyje nurodomas lyginamasis metodas pakeistas gradavimo grafiko metodu taikant logaritminį kalibravimą, kurio matematinės lygties išreika – dvigubas logaritmas: log y= log x+b, kai analitės smailės plotas išreiškiamas y, o analitės kiekis – x. Logaritminis kalibravimas pasirinktas dėl detektoriaus savybių. Šis kalibravimas nereikalauja matematinio pagrindimo. Kalibracinės kreivės nubrėţtos panaudojant etaloninių junginių šešių skirtingų koncentracijų tirpalus.
Tiesinė kalibravimo lygtis netinka dėl garinančio šviesos sklaidos detektoriaus savybių. Ši lygtis atitinka matematinę funkciją y=ax+b. Y ašyje nurodomas smailės plotas, o x ašyje – analitės kiekis mg/ml. Taip išreiškiama smailės ploto priklausomybė nuo analičių kiekio mėginiuose. Ginkgolido B
tiesinės kalibracinės kreivės (15 pav.) koreliacijos koeficientas R2
=0,894273. Bilobalido tiesinės
kalibracinės kreivės koreliacijos koeficientas R2=0.937976 (16 pav.). Kad galima būtų taikyti tiesinę
kalibracijos lygtį, koreliacijos koeficientas turėtų būti R2
≥0,99. Kai koreliacijos koeficientas ≤ 0,99, paneigiamas pritaikytos metodikos tiesiškumas.
40
15 pav. Ginkgolido B tiesinė lygties Y = 2.19·106+106 X kalibracinė kreivė
16 pav. Bilobalido tiesinės lygties Y = 1.12·106+107 X kalibracinė kreivė
Kadangi tiesinė lygtis gradavimo grafikui sudaryti netinkama, kalibracinei kreivei sudaryti galima naudoti antro laipsnio ar logaritmines lygtis.
Antro laipsnio kalibracinės kreivės lygtis atitinka y=ax 2
+bx+c matematinę finkciją. Ginkgolido
B kalibracinės kreivės lygties koreliacijos koeficientas R2=0,994901. Bilobalido kalibracinės kreivės
41
17 pav. Ginkgolido B antro laipsnio lygties Y = 7,30·106+006 X2 + 8,54·106+105 X kalibracinė kreivė
18 pav. Bilobalido antro laipsnio lygties Y = 5,99·106+106 X2 + 4,19·106+106 X kalibracinė kreivė
Antrojo laipsnio lygtis terpenolaktonų gradientiniam grafikui nubrėţti yra tinkama, nes koreliacijos koeficientas ≥ 0,99. Tačiau logaritminė kalibracija pasirinkta atsiţvelgiant į tai, jog šios kalibracijos priklausomybė tiesinė ir jai nereikia papildomo statistinio pagrindimo (19 pav., 20 pav.). Ginkgolido B ir bilobalido kalibracinių kreivių koreliacijos koeficientas ≥ 0,99.
