LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Samanta Šumskaitė
Anolito poveikis dermatofitui Microsporum canis in vitro
Antifungal effect of Anolyte on dermatophyte Microsporum canis in
vitro
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovė: doc. dr. Marija Ivaškienė
2 DARBAS ATLIKTAS DR. L. KRIAUČELIŪNO SMULKIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Anolito poveikis dermatofitui
Microsporum canis in vitro“
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Samanta Šumskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba yra taisyklinga.
Indra Rakauskienė
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
doc. dr. Marija Ivaškienė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS DR. L. KRIAUČELIŪNO SMULKIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
doc. dr. Birutė Karvelienė
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas) vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas lekt. dr. Gediminas Gerulis
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS ANALIZĖ ... 10 1.1. Gyvūnų dermatofitija ... 101.1.1. Microsporum canis paplitimas aplinkoje ... 10
1.1.2. Dermatofitozės Microsporum canis patogenezė ir klinikiniai simptomai ... 12
1.1.3. Dermatofito Microsporum canis diagnostikos metodai ... 13
1.2. Dermatofitozės, sukeltos Microsporum canis grybelio, konservatyvaus gydymo priemonės ... 16
1.2.1. Vietinis dermatofitozės gydymas ... 16
1.2.2. Sisteminis dermatofitozės gydymas ... 17
1.2.3. Sisteminio dermatofitozės gydymo šalutiniai poveikiai ... 17
1.2.4. Vakcinacija prieš dermatofitozę ... 18
1.2.5. Grybelio Microsporum canis naikinimas aplinkoje ... 18
1.3. Alternatyvios priemonės kovoje su M. canis ... 19
1.4. Elektrochemiškai aktyvuotas vanduo – anolitas ... 20
1.4.1. Elektrochemiškai aktyvuoto vandens – anolito sąvybės ir gamybos technika ... 20
1.4.2. Anolitas kaip antiseptinė medžiaga ... 22
1.4.3. Anolitas kaip dezinfekcinė priemonė ... 22
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 25
3.TYRIMO REZULTATAI ... 28
3.1 Anolito ir priešgrybinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum canis nustatymas diskų difuzijos metodu ... 28
3.2 Anolito ir priešgrybinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum canis nustatymas difuzijos į agarą (įdubų) metodu ... 29
3.3 Anolito ir priešgrybinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum canis nustatymas taikant modifikuotą daugybinių makro praskiedimų metodą ... 32
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 33
IŠVADOS ... 35
4
ANOLITO POVEIKIS DERMATOFITUI MICROSPORUM CANIS IN VITRO
Samanta Šumskaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Dermatofitija yra viena labiausiai paplitusių odos infekcinių ligų tarp naminių augintinių. Yra išrastas platus spektras vaistų, skirtų grybinėms odos ligoms gydyti, tačiau išoriškai naudojami sintetiniai preparatai dažnai sukelia odos dirginimą, o sistemiškai naudojami vaistai pasižymi šalutiniu poveikiu virškinimo trakto ir kepenų veiklai. Be to, daugėja pranešimų apie mikroskopinių grybų atsparumą daugeliui rinkoje esamų vaistų nuo grybų. Dėl šių priežasčių kyla susidomėjimas alternatyviomis natūraliomis medžiagomis, pasižyminčiomis priešgrybiniu poveikiu ir kartu nesukeliančiomis šalutinio poveikio organizmui bei neteršiančiomis aplinkos toksinėmis liekanomis. Anolitas yra pakankamai nauja medžiaga, skirta antiseptikai, kuri kelia vis didesnį susidomėjimą dėl savo antimikrobinių savybių.
Šio darbo tikslas buvo ištirti anolito priešgrybines savybes mikroskopiniam grybui
Microsporum canis in vitro bei palyginti anolito priešgrybinį poveikį su maistinės acto rūgšties,
joduoto povidono, salicilo spirito ir chlorheksidino poveikiu. Šiam tikslui įvykdyti buvo atliktas tyrimas pasitelkiant 3 skirtingus metodus. Modifikuotu daugybinių makro praskiedimų metodu buvo nustatyta anolito minimali slopinamoji koncentracija (MSK) M. canis grybui, kuri siekė 0,05 proc. Lyginant anolito priešgrybinį poveikį M. canis grybui su kitomis gerai žinomomis priešgrybinėmis medžiagomis buvo atlikti diskų difuzijos ir difuzijos į agarą (įdubų) metodai. Nustatyta, kad vertinant anolito priešgrybinį poveikį difuzijos į agarą metodu, vidutinė slopinamoji zona siekė 15,07 ±0,3mm. Lyginant anolito priešgrybinį poveikį modifikuotu daugybinių makro praskiedimo metodu M. canis grybui su kitomis priešgrybinėmis medžiagomis nustatyta, kad chlorheksidinas, salicilo spiritas bei acto rūgštis pasižymėjo silpnesnėmis slopinamosiomis savybėmis nei anolitas. O joduotas povidonas pasižymėjo stipresnėmis M. canis slopinamosiomis savybėmis nei anolitas. Tiriant anolito priešgrybinį poveikį diskų ir difuzijos į agarą metodais nustatyta, kad visos tirtos medžiagos pasižymėjo stipresnėmis priešgrybinėmis savybėmis nei anolitas.
Remiantis atliktu tyrimu, galime daryti išvadą, kad anolitas galėtų būti naudojamas kaip priešgrybinė priemonė, kurią verta nagrinėti toliau ir ištirti ar ši medžiaga būtų tinkama naudoti kaip antiseptikas.
5 Raktažodžiai: anolitas, Microsporum canis, dermatofitija, antiseptika
6
ANTIFUNGAL EFFECT OF ANOLYTE ON DERMATOPHYTE MICROSPORUM
CANIS IN VITRO
Samanta Šumskaitė
Master‘s Thesis
SUMMARY
Fungi is one of the most common skin infection disease among pets. A wide range of drugs have been proposed to treat fungal skin infections. Still topical synthetic preparations often cause skin irritation, while systemic medications have side effects on gastrointestinal and liver functioning. Besides, there are increasing reports of resistance to microscopic fungi to many antifungal drugs on the market. For these reasons, there is a growing interest in alternative natural substances that have antifungal effects and at the same time do not cause side effects on the body and do not pollute the environment with toxic residues. Anolyte is a new substance in veterinary and human medicine that is of growing popularity due to its healing qualities.
The present assay aimed to determine the effect of anolyte to microscopic fungi Microsporum
canis in vitro and to compare the antifungal activity of anolyte with that of acetic acid, iodine
povidone, salicyl alcohol and chlorhexidine. For this purpose 3 methods were performed. A modified multi-macro dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of anolyte for M. canis, which was 0.05 %. Disk diffusion and agar diffusion methods were performed to compare the antifungal effect of anolyte on M. canis with other well-known antifungal substances. The average inhibitory zone was found to be 15.07 ±0,3mm when evaluating the antifungal activity of the anolyte by the agar diffusion method. The comparison of the antifungal effect of anolyte with other antifungal substances confirmed that chlorhexidine, salicyl alcohol and acidic acid had weaker inhibitory efficacy on M. canis than anolyte. Iodine povidone had more robust M. canis inhibitory efficacy than anolyte. When studying the antifungal effect of anolyte by the disk diffusion and agar diffusion method, it was found that all tested substances had more potent antifungal efficacy than anolyte.
Based on our research, we can conclude that anolyte could be used as an antifungal agent that needs further investigation in the application of anolyte as an antiseptic.
7
SANTRUMPOS
DNR – deoksiribonukleorūgštis ECA – elektrocheminė aktyvacija FeLV – kačių leukemijos virusas FIV – kačių imunodeficito virusas HClO – hipochlorinė rūgštis
MALDI‐TOF MS – matricos pagalba atliekama lazerio desorbcijos jonizacijos masių spektrometrija MRSA – meticilinui atsparus auksinis stafilokokas
mV – milivoltas, matavimo vienetas NaCl – natrio chloridas
Nano- ESI- MS – nanoelektroninio purškimo jonizacija ORP – oksidacijos ir redukcijos potencialas
per os – vartojama per burną
PGR – polimerazinė grandininė reakcija
8
ĮVADAS
Dermatofitozė yra odos infekcija, kurią sukelia keletas keratofilinių mikroskopinių grybų rūšių. Ši infekcija sukelia įvairias plaukų slinkimo formas, papules, randus, žvynelius, šašus, eritemas, plaukų folikulų užsikimšimus, hiperpigmentaciją ir išvaizdos pasikeitimus augant nagams (3). Tai sunki ir paplitusi odos liga šunims ir katėms. Katės yra pagrindinis Microsporum canis rezervuaras, todėl dažniausiai ši liga plinta per kates (1). Ši liga ypač pavojinga, nes yra zoonozinė. Dermatofitozės sukelia odos pažeidimus ne tik gyvūnams, bet ir žmonėms (1). Yra aprašyta daugiau nei 30 mikroskopinių grybų rūšių, kuriomis užsikrečia gyvūnai ir žmonės. Dažniausias šunų ir kačių grybelinės infekcijos sukėlėjas yra dermatofitas Microsporum canis. Dermatofitozių paplitimas skiriasi priklausomai nuo klimato ir vietinio dermatofitų paplitimo (1).
Gydant grybelių sukeltas infekcijas veterinarinėje medicinoje dažniausiai naudojami priešgrybeliniai vaistai yra azolai (mikonazolas, enilkonazolis, ketokonazolas, klimbazolas), terbinafino hidrochloridas bei grizeofulvinas. Šie vaistai pasižymi ne tik gydomuoju, tačiau ir šalutiniu poveikiu. Gydant šiais vaistais gali pasireikšti niežulys, odos paraudimas, prasta savijauta, pykinimas, anoreksija, eisenos anomalijos, taip pat teratogeninis poveikis (1). Didėjant atsparumui įvairiems priešgrybiniams vaistams, atsiranda vis didesnis poreikis naujiems saugesniems vaistams (32, 33).
Kaip alternatyva jau išrastiems vaistams nuo dermatofitozės Microsporum canis, galėtų būti anolitas. Paskutinį dešimtmetį yra tyrinėjamas anolito, kaip dezinfekcinės ir antiseptinės medžiagos, pranašumas gyviems organizmams. Anolitas pasižymi baktericidinėmis savybėmis, turi aukštą oksidacijos potencialą, kuris siekia nuo +800 mV iki +1200 mV (25,42). Ši medžiaga galėtų būti efektyvi priešgrybinė priemonė, kadangi jis yra antiseptikas, pasižymintis veiksmingu antimikrobiniu poveikiu, organizmo tolerancija ir saugumu (22). Tyrimai atskleidė, jog anolitas yra efektyvus daugeliui bakterijų rūšių, įskaitant ir sporomis besidauginančius grybelius (23). Anolitas pasižymi veiksmingu priešuždegiminiu ir antiparazitiniu poveikiu; padidina žaizdų oksigenizaciją ir suardo bioplėveles (29,24), kurias gamina mikroorganizmai, įskaitant Staphylococcus aureus ir
Pseudomonas aeruginosa (22). Šio tyrimo tikslas – ištirti Lietuvoje gaminamą anolitą, nustatyti jo
poveikį vienam dažniausių patogeninių dermatofitozių sukelėjų Microsporum canis, palyginti jo poveikį su įprastomis priešgrybinėmis medžiagomis. Tokių tyrimų ir palyginamosios analizės Lietuvoje tirta dar nebuvo.
9 Darbo tikslas: ištirti anolito priešgrybines sąvybes mikroskopiniam grybui Microporum canis in
vitro.
Darbo uždaviniai
:
1. Taikant modifikuotą daugybinių makro praskiedimų metodą, nustatyti anolito minimalią
Microsporum canis slopinamąją koncentraciją;
2. Nustatyti anolito poveikį dermatofitui Microsporum canis diskų difuzijos ir difuzijos į agarą (įdubų) metodais;
3. In vitro sąlygomis palyginti anolito poveikį dermatofitui Microsporum canis su kitomis priešgrybinėmis medžiagomis: joduotu povidonu, chlorheksidinu, salicilo spiritu ir acto rūgšties tirpalu.
10
1. LITERATŪROS ANALIZĖ
1.1. Gyvūnų dermatofitija
1.1.1. Microsporum canis paplitimas aplinkoje
Dermatofitozė – keratinizuotų audinių, plaukų, nagų, odos paviršinio sluoksnio infekcija, kurią sukelia dermatofitiniai mikroskopiniai grybai (1). Dažniausiai smulkių gyvūnų dermatofitozių sukėlėjams priklauso Microsporum, Trichophyton ir Epidermophyton gentys (5). Microsporum canis dermatofitozė yra pavojinga odos liga, ji priskiriama zoonozėms, nes ja gali užsikrėsti ne tik gyvūnai, bet ir žmonės (3). Tyrimai parodė, jog Microsporum canis nėra normali gyvūnų odos grybelinės mikrobiomos dalis (2). Ji yra viena dažniausiai pasitaikančių dermatofitozių šunims ir katėms (7).
Microsporum canis yra paplitęs visame pasaulyje, daugiausiai Europoje, rytų Viduržemio jūros
regione ir Pietų Amerikoje. Šis organizmas buvo rastas ir daugelyje kitų naminių ir laukinių gyvūnų (2). Laukiniai ir naminiai gyvūnai: kupranugariai, arkliai, ožkos, avys ir triušiai, taip pat laikomi
Microsporum canis nešiotojais. Microsporum canis grybelis sukelia pavienius protrūkius žmonėms,
pavyzdžiui, Kanadoje buvo pranešta daugiau nei 1000 žmonių atvejų per 8 metus užsikrėtus šia dermatofitoze. Buvo pranešama apie infekcijas veterinarijos klinikose, slaugos namuose ir mokyklose. Microsporum canis yra vienas geriausiai žinomų žmonių Tinea capitis, Tinea corporis ir
Tinea manum sukėlėjų įvairiose pasaulio geografinėse vietovėse (8).
Irane 2017 metais atliktame dermatofitozių tyrime aprašyta 1011 gyvūnai įtariami užsikrėtę skirtingomis dermatofitozėmis (292 šunys, 229 katės, 168 arkliai, 100 kupranugarių, 98 karvės, 60 voverių, 37 paukščiai, 15 avių, 6 ožkos, 5 triušiai ir 1 lapė). Patvirtini 553 užsikrėtimo dermatofitozėmis atvejai: Microsporum canis buvo daugiausiai šunims ir katėms paplitęs grybelis;
T. verrucosum rasta daugiausiai užsikrėtusių karvių ir kupranugarių; Didžiausias skaičius gyvūnų,
užsikrėtusių T. mentagrophytes var. mentagrophytes, buvo avys, ožkos ir egzotinių rūšių gyvūnai;
M. equinum – daugiausia užsikrėtę arkliai ir M. gallinae – paukščiai (16).
Microsporum canis infekcija yra viena labiausiai paplitusių zoonozių visame pasaulyje (4).
Dermatofitozės žmonėms taip pat sukelia odos pažeidimus, kurie paprastai greitai sugyja stiprų imunitetą turintiems asmenims, tačiau žmonėms, turintiems imunosupresiją, gydymas dažnai užtrunka ilgai (1). Izraelyje 2018 metais atliktame tyrime mokslininkai aprašė Microsporum canis protrūkį karinėje bazėje. Daugelis infekuotų karių darbo metu turėjo tiesioginį kontaktą su lauke gyvenančiomis katėmis, o ypač karinės sargybos metu dirbę asmenys. Patvirtinti 53 iš 502 užsikrėtimo šiuo patogenu atvejai. Tyrimas atskleidė, jog kariai užsikrėtė nuo karinėje bazėje gyvenančių Microsporum canis užsikrėtusių kačių (1 pav. b) (10). Italų mokslininkų 2017 metais atliktas tyrimas parodė, jog vaikams yra dažnas Microsporum canis grybelis Tinea capitis sukelėjas,
11 kuris pasireiškia stipriais uždegiminiais pažeidimais ant odos (1 pav. a) (Tinea corporis ir Tinea
faciei). Tyrime teigiama, jog vaikai dažniausiai užsikrečia nuo kačių, o didžiausią predispoziciją
susirgti šia liga turi vaikai nuo 6 mėnesių iki 10 –12 metų amžiaus (2,36).
Tyrimas taip pat atskleidė, jog aplinka yra svarbus rodiklis, lemiantis grybelinių infekcijų paplitimą (2). Grybeliai gamina artrosporas, kurios pasižymi dideliu atsparumu sausoje aplinkoje ir išgyvena joje iki 12 mėn. Vis dėlto, drėgnoje aplinkoje sporos yra trumpalaikės. Aukšta temperatūra (100oC) artrosporas sunaikina. Artrosporos labai tvirtai prisitvirtina prie audinių keratino. Kontakto
būdu artrosporos yra perduodamos iš užsikrėtusių ar subkliniškai infekuotų gyvūnų, dažniausiai kačių, bet pasitaiko ir šunų bei kitų gyvūnų rūšių. Užsikrėtusių gyvūnų plaukų stiebai labai trapūs ir plauko dalys, turinčios artrosporų, yra infekcijos šaltinis. Kitas rizikos faktorius yra gyvūno supažindinimas su nauja aplinka. Netiesioginis kontaktas taip pat yra vienas rizikos faktorių, kadangi grybelis lengvai plinta su dulkių dalelėmis nuo daiktų (7). Grybelio artrokonidijos gali išsilaikyti aplinkoje ištisus mėnesius ir net metus, ypač kai jos įsiterpusios plauko folikule ar odoje, ant grindų, sienų ir objektų, skirtų gyvūnų priežiūrai: ant šukų, plaukų mašinėlių, gyvūnų pataluose. Taip pat ant namų apyvokos daiktų: sofų, lovų, kėdžių ir kitų baldų, kurie gali būti užteršti šiuo patogenu. Infekcijos sukėlėjo nukenksminimas aplinkoje yra svarbus veiksnys siekiant sumažinti pakartotinės infekcijos riziką ir gydymo trukmę gyvūnams. Antiseptikai skirti produktai turėtų būti kuo mažiau toksiški, nedirginantys ir tinkami naudoti ant odos (7).
Kitame tyrime, atliktame Kanados mokslininkų, buvo tirtas dermatofitozių paplitimas pasaulyje. Šiame tyrime teigiama, jog 0,71 proc. šunų ir 3,6 proc. kačių buvo užsikrėtę dermatofitozėmis. Didžiojoje Britanijoje atliktame tyrime dermatofitozės apėmė 0,53 proc. šunų ir 1,3 proc. kačių. Europoje 50–90 proc. visų dermatofitozių šunims ir katėms sukėlė Microsporum
canis (1).
1 pav. a - vaikas užsikrėtęs Microsporum canis (2), b - karys užsikrėtęs Microsporum canis (10) nuotraukose matoma Tinea corporis
12 1.1.2. Dermatofitozės patogenezė ir klinikiniai simptomai
Klinikiniai dermatofitozių simptomai atspindi ligos patogenezę: ji užkrečia keratinizuotas struktūras. Tai sukelia įvairias plaukų slinkimo formas: papules, randus, žvynelius, šašus, eritemas, plaukų folikulų užsikimšimus, hiperpigmentacijas ir išvaizdos pasikeitimus augant nagams. Įprastai žaizdos yra asimetriško apskritimo formos, rausvo atspalvio (3). Katės yra pagrindinis Microsporum
canis rezervuaras, todėl dažniausiai ši liga plinta per kates (1). Inkubacinis Microsporum canis
laikotarpis yra 1– 3 sav. Per šį laikotarpį grybo hifai auga išilgai plauko stiebo, pažeidžia raginį sluoksnį ir folikulą. Grybelio hifai gamina sporas, kurios formuoja storą sluoksnį aplink plauko stiebą. Kadangi dermatofitai yra jautrūs aukštai temperatūrai, jie negali kolonizuoti gilesnių odos audinių arba pačio plauko folikulo. Todėl plaukai auga įprastai, tačiau lūžta ties odos paviršiumi. Grybelio metabolizmo produktai sukelia uždegiminę odos reakciją aplink užkrėstą plotą (7). Dažniausiai gyvūnams susirgus šia Microsporum canis dermatofitoze pasireiškia alopecija (plaukų slinkimas) (2 pav. b), lūžinėjantys plaukai, pleiskanojimas (2 pav. a), šašai, papulės, eritemos, tokios kaip odos hiperpigmentacija (1, 7). Odos niežėjimas, nors nėra dažnas simptomas, pasireiškia priklausomai nuo uždegimo stiprumo (9). Odos pažeidimai yra maži, dažniausiai 4 – 6 cm skersmens (7). Dažniausiai žaizdos formuojasi snukio srityje, ant ausų ir aplink burną (1). Žaizda gali būti viena, arba jų gali būti daugiau, išsidėsčiusių visame kūne, įskaitant ir distalines kūno dalis: kojas (2 pav. c) ir uodegą. Ligos vystymosi eigoje infekcija gali progresuoti ir kitose kūno srityse, pavyzdžiui, letenose. Daugeliui kačių, gyvenančių higieniškomis sąlygomis, šios žaizdos yra laikinos ir išnyksta per kelias savaites. Imunosupresiniams gyvūnams (turintiems nusilpusį imunitetą) infekcija gali sukelti granuliomatozinį dermatitą kartu su bakterine infekcija.
Retais atvejais uždegiminė reakcija sukelia mazgines granuliomatozės reakcijas, pažeidžiančias odą ir išsausinančias odos paviršių (3 pav. a). Taip vadinamos pseudomicetomos dažniau pastebimos Persų veislės katėms, kartais kartu su klasikinėmis žaizdomis (7). Pseudomicetoma yra atipinė
2 pav. a– kai kurioms katėms (ypač suaugusioms) vienintelis dermatofitozės požymis gali būti pleiskanojanti oda (7); b – Matoma žiedinė alopecija, sukelta Microsporum canis infekcijos katei (7); c - Microsporum canis žaizda šuniui (1)
13
Microsporum canis dermatofitozės forma, kuri invazuoja į paodį ir tikrąją odą. Šiai ligai būdingi
vienas ar keli iškilę gumbeliai, atsirandantys įvairiose gyvūno kūno vietose (3 pav. b) (13, 35). Kalbant apie šunis, Jorkšyrų veislės šunys turi didžiausią predispoziciją sirgti paviršine ir poodine dermatofitine Microsporum canis infekcija. Aprašyti tyrimai, kuriuose 23,6 proc. šunų, diagnozuotų užsikrėtus Microsporum canis, buvo Jorkšyrų veislės terjerai. Keletas tyrimų apibūdina dermatofitozės ir hiperadrenokorticizmo ryšį šunims: 6 šunims, užsikrėtusiems dermatofitozėmis, buvo diagnozuota ir šios gretutinės ligos: leišmanioze buvo užsikrėtę 4 šunys, erlichioze ir cukriniu diabetu – po 1 šunį. Katės, sergančios FIV (kačių imunodeficito virusu) arba FeLV (kačių leukemijos virusu), nors serga įvairesnėmis saprofitinių grybų infekcijos sukeltomis ligomis, tačiau nebūtinai yra nešiotojos (1). Aukštos temperatūros ar apetito stokos nepastebima (7). Diferencinėms diagnozėms priskiriamos bakterinės infekcijos, autoimuninės ligos, tokios kaip alopecija ir ektoparazitai, tokie kaip, pvz.: Demodex spp (1).
1.1.3. Dermatofito Microsporum canis diagnostikos metodai
Kadangi Microsporum canis grybelio sukelta dermatofitozė yra užkrečiama infekcinė liga, tikslus grybelio rūšies identifikavimas yra būtinas faktorius norint paskirti tinkamą priešgrybelinį gydymą, nustatyti infekcijos šaltinį, epidemijos protrūkių valdymą ir tuo būdu užkirsti kelią pakartotinai infekcijai (15). Diagnostiniai testai, skirti gyvūnų dermatofitozėms nustatyti, taikomi priklausomai nuo infekcijos stadijos, taikyto ar netaikyto gydymo, mėginių ėmimo, vietos, iš kurios imamas mėginys, diagnostikos priemonių kiekio. Dermatofitozėms nustatyti nėra vieno „auksinio standarto“. Diagnostinius tyrimus verta pradėti išanalizavus gyvūno ligos anamnezę ir atlikus klinikinę apžiūrą (37,15). Tolimesnei diagnostikai svarbu panaudoti vienas kitą papildančius testus, pvz.: Vudo lempą ir tiesioginį plaukų ar pleiskanų tyrimą, naudojant „dantų šepetėlio“ metodą. Diagnozuojant grybinės kilmės infekcijas taip pat svarbu kontroliuoti reakciją į paskirtą gydymą.
3 pav. a– Microsporum canis sukeltas granulomatozinis dermatitas šuniui (1);
14 Kitais atvejais, esant mazginėms ar netipinėms infekcijos formoms, yra taikoma biopsija dažant specialiais dažais, skirtais grybeliui tirti (38).
Klinikinės apžiūros metu, įtariant dermatofitozę, yra atliekama odos palpacija dienos šviesoje tam, kad būtų lengviau surasti žaizdas ir jas stebėti iš arčiau. Žaizdos, kurios randamos klinikinės apžiūros metu gyvūnui užsikrėtus Microsporum canis padermėmis, dažniausiai būna įvairiose vietose: snukio srityje, ant lūpų, aplink akis, ausis, ausų ribose, ant pirštų, vidinėse kojų srityse, ant alkūnių ir uodegos. Svarbu atkreipti dėmesį, kad tai folikulinė liga ir negydytoms katėms būdinga alopecija, pleiskanojimas, krešulių formavimasis ir eritema (15).
Atlikus klinikinį tyrimą, naudojama Vudo lempa gyvūnui apšviesti (4 pav. a, b). Kai plaukai su
Microsporum canis hifais yra apšviečiami Vudo lempa, grybeliu užsikrėtusi vieta šviečia gelsvai žalia
spalva. Fluorescenciją sukelia triptofano metabolitai, kuriuos gamina kai kurios dermatofitų rūšys. Gali būti gaunami klaidingai teigiami ir klaidingai neigiami rezultatai, dažniausiai naudojant netinkamą įrangą ar trūkstant patirties, nepakankamai tiksliai pasitelkiant techniką (2). Šis diagnostikos metodas nėra labai jautrus. Maždaug 50 proc. Microsporum canis padermių fluorescuoja, o kiti dermatofitai nefluorescuoja visai, todėl rezultatai, gauti atlikus tyrimą Vudo lempa, turėtų būti palyginami su kitais testais, pvz.: tiesioginiu tyrimu ir kultūra (7, 2).
Mikroskopinis tyrimas yra vienas dažniausiai naudojamų testų tiriant grybelio hifus ir artrokonidijas, mikroskopuojant išrautą plaukų kuokštelį (7). Dermatoskopija – yra naudingas klinikinis tyrimas nustatant plaukų struktūrą ir (arba) tiesioginio tyrimo būdu. Šis tyrimas skirtas ištirti, ar gyvūno plaukuose, pleiskanose yra grybo hifų (37). Tyrimo specifika: plaukai naudojant pincetą išpešami plaukų augimo kryptimi. Tada plaukai ar pleiskanos išmirkomos mineraliniame aliejuje (37, 15). Plaukai mikroskopuojami padidinus x4 arba x10 (5 pav. a, b), o Vudo lempa yra
4 pav. a- Microsporum canis diagnostika pasitelkiant Vudo lempą. Fluorescencinės zonos matomos ant katino snukio (7);
15 laikoma virš mikroskopo. Jei gyvūnas yra užsikrėtęs Microsporum canis grybeliu, matomi blyškūs ir platesnio skersmens plaukai, palyginus su sveikais. Mikroskopuojant plaukus padidinus x40 matomos artrosporos. Kruopščiai atliekama Microsporum canis diagnostika parodo didelius mikroskopinio grybo sporų kiekius ant plaukų paviršiaus dar iki sporoms invazuojant plauko stiebą (15).
Dermatofitozės diagnozė, pagrįsta tiesiogine mikroskopija ir klinikinio mėginio kultūra, ne visada gali būti tiksli, kadangi tyrimo metodui trūksta specifiškumo. Remiantis tik klinikine išvaizda, net apie 50 proc. dermatofitozių yra nustatoma neteisinga diagnozė. Tiksli laboratorinė diagnozė yra svarbi norint suteikti tikslų gydymą (17). Specifiškesnis dermatofitozės tyrimo būdas – tai molekulinės technikos, tokios kaip PGR (polimerazės grandininė reakcija), kurios skirtos nustatyti dermatofitų DNR. PGR dermatofitozės testas suteikia greitus rezultatus per 1– 3 darbo dienas (6). Teigiamas PGR rezultatas gali reikšti aktyvią infekciją, užsikrėtimą nuo fomito nešiotojų ar negyvybingais grybiniais organizmais po sėkmingo gydymo (38).
Kitas, tikslesnis testas, naudojamas nustatyti dermatofitų rūšį, yra Sabūro agaro selektyvinių terpių panaudojimas. Diagnostikos eiga: plaukai ir (ar) pleiskanos yra surenkamos nuo žaizdos kraštų, vėliau žaizda švelniai dezinfekuojama (siekiant išvengti didesnio žaizdos užsiteršimo). Įtariant subklinikinę ligos formą arba pasyviai užsikrėtus, rekomenduojama bandinio vietą 5 min patrinti steriliu šepetėliu. Vėliau tiriamoji medžiaga pasėjama ant Sabūro selektyvinės terpes. Pasėta selektyvinė terpė inkubuojama 37o C temperatūroje apie 5 d. Diagnozė nustatoma mikroskopinio
tyrimo būdu užaugus kolonijoms (7).
Rečiau naudojamas dermatofitozės diagnostikos tyrimas yra biopsija – histologinis audinių ištyrimas. Mokslinėje literatūroje yra aprašyti trys atvejai, kai pasitelkus biopsijos tyrimą buvo diagnozuota Microsporum canis infekcija. Pirmasis atvejis buvo susijęs su negyjančia žaizda ar
a
b
5 Pav. a- Microsporum canis makrokonidijos, matomos mikroskopu (1);
b- Microsporum canis užkrėsti plaukai matomi mikroskopuojant (užkrėsti plaukai yra blyškesni ir platesni nei sveiki) (37)
16 mazgeliu (kerionas, pseudomicetoma, micetoma). Antrasis atvejis – esant lėtinio pobūdžio žaizdoms snukio srityje įtariant lakštinę pūslinę (Pemfigus foliaceus) šunims ir trečiasis atvejis aptikus gyvūnams neįprastas žaizdas (3).
Įprasti metodai dažnai yra sudėtingi. Tiksliai dermatofito diagnozei nustatyti reikalingi dideli laiko ir patirties ištekliai. Yasmine H. Tartor ir kt. mokslininkai 2019 metais atliktame tyrime atliko PGR, MALDI‐TOF MS (matrix‐assisted laser desorption/ionisation time of flight mass spec‐ trometry) ir Nano‐ESI‐MS (nano‐electrospray ionisation mass spectrometry) analizę nustatant
Microsporum canis, Trichophyton verrucosum ir T. mentagrophytes padermes.
Ši technika gali žymiai pagreitinti dermatofito identifikacijos laiką. Real-time PGR (polimerazinė grandininė reakcija) yra labai jautrus ir 2–4 sav. greitesnis testas nei klinikinės dermatofitinės kultūros skirtos nustatyti dermatofito rūšį (15).
MALDI‐TOF MS yra nebrangi, automatizuota sistema, kuri veikia itin dideliu greičiu ir tinka dermatofito augimui kultūroje nustatyti dar iki pasirodant rūšiai būdingiems morfologiniams požymiams. Tai lemia greitus ir tikslius rezultatus. Dėl šios universalios sąvybės, MALDI-TOF MS buvo įdiegtas daugelyje mikrobiologinių laboratorijų. Naudojant MALDI‐TOF MS buvo identifikuota Microsporum canis, tačiau T. violacium, T. verrucosum ir T. mentagrophytes identifuota nebuvo. Nano-ESI-MS tiksliai nustatė visas tris grybelių rūšis. Kaip ir tikėtasi, buvo nustatyti potencialūs grybelių išskiriamų proteazių virulentiškumo požymiai. Jie buvo palyginti su visomis grybelių rūšimis. Buvo aptiktos endoproteazės priklausančios metaloproteazių, subtilizino ir aspartiko proteazėms. Ištirtos egzoproteazės yra aminopeptidazės, dipeptilpeptidazės ir karboksipeptidazės. Microsporum canis padermė turi tris imunogeninius proteinus, sideroforo geležies, transporter mirB, proteazės inhibitorius, plazminės membranos proteolipidą 3 ir aneksiną (15).
1.2. Dermatofitozės, sukeltos Microsporum canis grybelio, konservatyvaus
gydymo priemonės
1.2.1. Vietinis dermatofitozės gydymas
Microsporum canis infekcija perduodama tiesioginio kontakto būdu esant kontaktui su
infekuota oda, kailiu ar užsikrėtusiais gyvūnais. Vietinio gydymo tikslas yra sumažinti infekcijos užkrečiamumo ir zoonotinę riziką siekiant dezinfekuoti užkrėstą odą (1). Vietinė terapija yra būtina gydymo dalis, nes tai yra vienintelis būdas sunaikinti grybelio sporas ant kailio. Sisteminė terapija naikina sporas tik plauko folikule (37). Vietinis gydymas skiriamas mikonazolu, enilkonazolu, terbinafinu, klimbazolu, ketokonazolu (1). Karen A. Moriello 2016 metais JAV paskelbtame „Journal of Feline Medicine and Surgery“ aprašytas ištirtas in vitro šampūnų veiksmingumas naikinant
17
Microsporum canis ir Trichophyton grybelio rūšis. Tyrimui panaudota sporų suspensija gauta iš Microsporum canis infekuotų kačių plaukų ir pleiskanų. Taip pat tyrime naudoti šampūnai, kurių
sudėtyje yra mikonazolo, ketokonazolo, klimbazolo ir 7 proc. konc. vandenilio peroksido. Pagaminta
Microsporum canis ir Trichophyton sporų suspensija ir šampūnai su veikliosiomis medžiagomis
buvo maišomi santykiu 1:10, 1: 5 ir 1:1, siekiant užtikrinti vienodą sporų pasiskirstymą produkte. Sterilia kilpele 0,1 ml tiriamosios medžiagos buvo pasėta ant grybui skirtų lėkštelių tolygiai paskirstant medžiagą. Tyrimas buvo pakartotas mažinant šampūnų koncentraciją nuo tiriamojo produkto 1:10 konc. iki 1: 5 ir 1: 1 koncentracijų. Tyrimo metu pastebėta, jog visose tirtose terpėse su dermatofito sporomis ir tiriamosiomis medžiagomis buvo slopintas dermatofito augimas. Šio tyrimo rezultatai parodė kad priešgrybeliniai šampūnai su mikonazolu, ketokonazolu ir 7 proc. vandenilio peroksidu pasižymi veiksmingu priešgrybeliniu poveikiu Microsporum canis ir
Trichophyton dermatofitams ir gali būti tinkamas pasirinkimas kaip gyvūno plaukų dezinfekcijos
priemonė (9).
1.2.2. Sisteminis dermatofitozės gydymas
Sisteminis priešgrybelinis gydymas yra nukreiptas į užkrėsto gyvūno aktyvią grybelinės infekcijos ir dauginimosi vietą. Siekiama pašalinti infekciją, sumažinant riziką ant gyvūno kūno daugintis grybelio sporoms ir toliau plisti pažeidimams (1). Dažniausiai naudojami sisteminiai priešgrybeliniai vaistai prieš Microsporum canis yra griseofulvinas, itrakonazolas, ketokonazolas, flukonazolas, terbinafino hidrochloridas (1, 18). Veiksmingiausiais ir saugiausiais pripažinti yra terbinafinas ir itrakonazolas (1). Nors tai gana brangus vaistas, itrakonazolas yra pirmasis pagal pasirinkimą preparatas kačių dermatofitozei gydyti. Šio vaisto veikimas yra panašus į ketokonazolo ir terbinafino, tačiau jis pasižymi didesne tolerancija katėms (7). Nors yra gana brangus, griseofulvinas taip pat yra efektyvus, tačiau jis gali sukelti didesnį potencialų šalutinį poveikį lyginant su itrakonazolu ir terbinafinu (1).
1.2.3. Sisteminio dermatofitozės gydymo šalutiniai poveikiai
Konservatyvus Microsporum canis dermatofitozės gydymas pasižymi ne tik teigiamu, bet ir neigiamu poveikiu gyvūnų sveikatai. Nors itrakonazolas pasižymi didesne tolerancija katėms, tačiau buvo aprašyti atvejai, kuomet jis sukėlė anoreksiją, taip pat jo nerekomenduojama skirti vaikingoms patelėms. Kaip alternatyva šitam vaistui yra terbinafinas. Šis vaistas naudojamas oraliai (7). Tačiau gydymas terbinafinu katėms gali pasireikšti teratogeniniu poveikiu, taip pat gali sukelti niežulį, prastą savijautą, anoreksiją, eisenos anomalijas, odos paraudimą, vėmimą (1,7). Ketokonazolas ir flukonazolas pasižymi mažiau veiksmingomis gydymo galimybėmis. Ketokonazolas turi didesnį šalutinio poveikio potencialą: katėms gali sukelti padidėjusią kalcio ir albumino koncentraciją, tai
18 sukelia odos išsausėjimą ir svorio kritimą. Šuniukams gali pasireikšti pykinimas. Bandomųjų tyrimų metu ketokonazolas pasižymėjo teratogeniniu poveikiu sumažindamas testosterono produkciją laboratoriniams žiurkių patinėliams. Laktacijos periodu taip pat nepatartina naudoti gydymo šiuo vaistu, kadangi ketokonazolas pašalinamas su pienu (1). Katės yra ypač jautrios ketokonazolo sukeliamam šalutiniam poveikiui. Šis vaistas katėms sukelia kepenų intoksikaciją, anoreksiją, vėmimą, viduriavimą ir steroidinių hormonų sintezės slopinimą (7). Griseofulvinas nėra dažnas pasirinkimas, tačiau kai kuriose šalyse dar yra naudojamas Microsporum canis dermatofitozei gydyti. Griseofulvinas sukelia didelį spektrą šalutinių poveikių: anoreksiją, vėmimą, viduriavimą ir kaulų čiulpų slopinimą, ypač Siamo, Himalajų ir Malaizijos Abisinijos katėms. Griseofulvino naudojimas yra kontraindikuotinas jaunesniems nei 6 savaičių amžiaus kačiukams ir vaikingoms patelėms, nes yra teratogeninis, ypač pirmosiomis nėštumo savaitėmis. Keliose pranešimuose teigiama, jog FIV infekcija lemia kačių griseofulvino sukeltą kaulų čiulpų supresiją. Todėl prieš gydymą katės turėtų būti ištirtos dėl šios infekcijos. Vis dėlto, pasirinkus Microsporum canis dermatofitozės gydymą šiuo vaistu, būtina atlikti bendrą kraujo tyrimą, norint nustatyti galimą kaulų čiulpų supresiją. Atsižvelgiant į tai rekomenduojama rinktis efektyvesnius ir saugesnius vaistus (7).
1.2.4. Vakcinacija prieš dermatofitozę
Nors priešgrybinės vakcinos neapsaugo nuo užsikrėtimo pasireiškimo, vis dėlto vakcina gali būti naudojama kaip papildoma terapijos priemonė (9). Didelio pasisekimo sulaukė profilaktinės ir terapinės vakcinos galvijams ir kailiniams gyvūnams. Tenka pripažinti, saugios ir veiksmingos vakcinos katėms sukurta dar nėra. Naudojant (profilaktinę ir terapinę) vakciną katėms prieš
Microsporum canis buvo atlikti ir paskelbti keli tyrimai. Eksperimento metu panaudota negyva
„Microsporum canis ląstelės sienelė“ sukėlė humoralinį imunitetą eksperimento katėms. Deja, šis organizmo atsakas į vakciną neapsaugojo kačių nuo galimybės užsikrėsti šia dermatofitoze. Vakcinacija nėra rekomenduojama gydymo priemonė katėms (7).
1.2.5. Grybelio Microsporum canis naikinimas aplinkoje
Pagrindinis aplinkos nukenksminimo tikslas yra pašalinti infekcijas sukeliančias medžiagas iš aplinkos ir sumažinti klaidingai teigiamų mikroskopinių grybų kultūrų potencialą. Infekcinės medžiagos gali augti ir daugintis tik plaukuose ir ant odos (37). Namų aplinkoje, kurioje gyvena viena ar kelios katės, pakanka mechaninio dulkių ar plaukų pašalinimo iš aplinkos. Tačiau gyvūnų veislynuose ar prieglaudose aplinkos dezinfekcija yra ypač svarbi. Didžioji dalis dezinfekantų, vadinamų „fungicidiniais“, veikia prieš grybelio micelį arba makrokonidijas, bet ne artrosporas (7). Veismingiausiai artrosporas iš aplinkos naikina 1:33 kalkių siera, 0,2 proc. enilkonazolas, nuo 1:10
19 iki 1:100 buitinis chloro baliklis. Enilkonazolo dūmų fumiganto galima įsigyti daugelyje Europos šalių. Visi paviršiai turėtų būti išvalyti pasirenkant vieną iš šių tirpalų.
1.3. Alternatyvios priemonės kovoje su Microsporum canis
Populiariojoje literatūroje galima rasti pranešimų apie alternatyvių gydymo metodų taikymą dermatofitozėms gydyti. Alternatyvūs dermatofitijos gydymo metodai taikomi naudojant natūralias medžiagas, kurios dažnai pasižymi dideliu efektyvumu ir yra alternatyva įprastiems sintetiniams vaistams. Augaluose randama gausybė įvairių veikliųjų medžiagų: fenolių, kumarinų, flavonoidų, taninų, saponinų, alkaloidų, terpenų ir kt. Šios medžiagos pasižymi ir antibakteriniu ir priešgrybiniu veikimu (26). Vienas iš alternatyvios medicinos pavyzdžių kovojant su mikroskopiniais grybais yra iš augalų išgauti eteriniai aliejai – koncentruoti natūralūs hidrofobiniai skysčiai (39, 43) ( dažniausiai lakieji aromatiniai junginiai) (21). Augaluose gaminami antriniai metabolitai: terpenoidai (limonenas, terpinenas), alkoholiniai junginiai (linalolis, mentolis), aldehidai (benzalaldehidai, kamparas) ir įvairios rūgštys taip pat pasižymi fungicidinėmis sąvybėmis (31). Mokslinėje literatūroje aprašomas tyrimas, kuriame buvo nustatyta, jog eukalipto, anyžių, gvazdikėlių, bergamočio, sibirinio kėnio, citrinų ir arbatmedžio eteriniai aliejai turi priešgrybinių sąvybių. Stipriausiu priešgrybiniu veikimu kovoje prieš Trichophyton rubrum ir Micosporum canis dermatofitus, pasižymėjo gvazdikėlių, Sibiro kėnio, arbatmedžio ir citrinų eteriniai aliejai. Tiriant diskų difuzijos metodu inhibitorinės zonos vid. buvo nuo 29,5 mm iki 85,0 mm (39). Prancūzų mokslininkų „Medicinos mikologijos žurnale“ aprašomas daugybinių mikro praskiedimų metodu ištirtas paprastojo čiobrelio, paprastojo raudonėlio, kvapiojo rozmarino, žvaigždinio anyžiaus ir citrinmedžio eterinių aliejų poveikis 11 Microsporum
canis padermėms, išskirtoms iš užsikrėtusių kačių. Stipriausiu fungicidiniu poveikiu esant MSK
pasižymėjo paprastasis čiobrelis ir paprastasis raudonėlis. Jų MSK svyravo nuo 0,025 iki 0,1 proc. ir nuo 0,025 iki 0,05 proc. Kaip ir kitus vaistus, taip ir eterinius aliejus gyvūnų gydymui (o ypač katėms), reikia rinktis atsižvelgiant į kai kurių medžiagų toksiskumą. Gydant kates per os čiobrelių eteriniu aliejumi pasireiškė medžiagos toksiškas poveikis (21). Natūralioms alternatyvioms medžiagoms galima priskirti ir alavijo gelį (11), bičių pikį (12), kanapių aliejų (19) bei naują priešgrybinę medžiagą – anolitą.
20
1.4. Elektrochemiškai aktyvuotas vanduo – anolitas
1.4.1. Elektrochemiškai aktyvuoto vandens – anolito sąvybės ir gamybos technika
Anolitas – skaidrus, be nuosėdų skystis, turintis rūgšties arba chloro kvapą, jo pH <7. Rūgštinis vanduo pasižymi baktericidinėmis savybėmis, jis sulėtina medžiagų apykaitą (metabolizmą), truputį sumažina kraujospūdį, dezinfekuoja medicininius instrumentus, įvairius indus, patalpas. Taip pat efektyviai dezinfekuoja žaizdas (25).
Elektrochemiškai aktyvuotas vanduo gaunamas naudojant elektrocheminį reaktorių, kurį sudaro 2 elektrodai, anodas ir katodas. Anodinės ir katodinės kameros yra atskirtos jonams pralaidžia membrana. Elektrocheminio aktyvavimo (ECA) metu praskiestas druskos tirpalas „suaktyvinamas“ jį pilant į anodinę ir katodinę kameras. Manoma, kad kiekvienoje iš jų ant elektrodų vyksta pagrindinės cheminės reakcijos, kai jais yra leidžiama vienpolė nuolatinė srovė. Elektrochemiškai aktyvuotas vanduo (ECA) pasižymi oksidacijos redukcijos potencialu (ORP) nuo +800 iki 1200 mV. Anolitas yra oksidatorius, atsirandantis dėl laisvųjų radikalų mišinio. Katodinėje kameroje susidaro vandenilis kartu su kitomis reaktyviomis medžiagomis (daugiausiai antioksidantai), tačiau jame pagamintas vanduo pasižymi ribotu antimikrobiniu veikimu. Priešingai nei katodo, anodo kameroje sukuriama aplinka, kuri pralenkia mikrobinių procesų veikimo ribas. Panardinus į anodo kameros tirpalą mikroorganizmus, jie yra veikiami galingų oksidatorių, kurie labai efektyviai suriša mikrobų struktūrinių junginių elektronus, skaidydami biocheminius ryšius, kas lemia mikroorganizmų disfunkciją. Be to, manoma, jog aukšta ORP aplinka sukuria nesubalansuotą osmosiškumą tarp jonų koncentracijų tirpale ir vienaląsčiuose organizmuose, dar labiau pažeisdama jų membranų struktūras. Padidėjus mikroorganizmo ląstelių membranos poringumui, oksiduojančios ECA dalelės difuzijos būdu difunduoja į ląstelės citoplazmą ir galiausiai inaktyvuoja ląstelės viduje esančius baltymus, lipidus ir nukleino rūgštį. Dėl to ląstelė, pavyzdžiui, bakterija, praranda savo funkcionalumą (42). Anolito gamybą vaizduoja prototipinis elektrocheminis elementas pavaizduotas 6 paveikslėlyje.
21 Elektrocheminis vandens aktyvavimas apima vandens ir pridėtų druskų elektrinių potencialų ekspoziciją. Kai įdedama NaCl druska, pirminis ECA gamybos produktas yra hipochloritas. Vykstant sudėtingoms cheminėms reakcijoms elektrocheminio reaktoriaus viduje gaminamas metastabilus tirpalas, sudarytas iš kelių reaktyvių jonų ir laisvųjų radikalų, įskaitant ozoną, vandenilio peroksidą, chlorą, vandenilio chloridą, hipochlorito rūgšties, vandenilio chlorido rūgšties ir vandenilio jonus. Pirmasis hipochlorito gamybos etapas ir jo metu vykstančių cheminių reakcijų seka yra pavaizduota 7 paveikslėlyje (42).
J. Helme ir kt. Mokslininkų 2010 m. atliktame tyrime buvo naudojamas elektrocheminis reaktorius, pritaikytas pagaminti kelis skirtingus tirpalus. Visi šie tirpalai pasižymėjo antimikrobinėmis savybėmis. Visuose tirpaluose buvo nedideli hopochlorito, hipochlorito rūgšties ir hipochlorinės rūgšties kiekiai. ECA elektrocheminio aktyvavimo metu praskiestas druskos tirpalas turėjo skirtingas sudedamųjų medžiagų koncentracijas (40). Sėkminga neutralios, tačiau labai aukšto lygio veiksmingos antimikrobinės medžiagos gamyba gali būti įvairiai pritaikoma, pavyzdžiui, odos ir gleivinių dezinfekcijai (40). Viena svarbiausių šarminio vandens sąvybė – gydomoji, rūgštinio vandens – baktericidinis poveikis (25).
6 pav. Anolito gamybos modelis. Nr. 1 pažymėta anodas, nr. 2 - katodas, nr. 3 - jonams pralaidi membrana (42)
7 pav. Hipochlorito gamybos eiga (42) Anolitas su aukštu
oksidacijos potencialu
Katolitas su aukštu redukcijos potencialu
22 1.4.2. Anolitas kaip antiseptinė medžiaga
HClO (hipochlorinė rūgštis) 300 arba 500 mg/l yra tinkamas antiseptikas, skirtas naudoti ant žaizdų arba ant gleivinės (pvz.: gydyti nudegimus arba opas ar endodontinėms procedūroms atlikti). Per 5–10 min pasireiškia jo efektyvumas. Mažesnės koncentracijos sumažino mikrobinę galią, ypač per ilgesnį laikotarpį. Vis dėlto HClO pasižymi nedideliu toksiškumu medžiagai, ant kurios yra naudojamas, tačiau kai kuriais atvejais vis tiek yra naudingas, pvz.: kaip burnos skalavimo skystis. HClO yra labai efektyvus ir atsparus bioplėvelei. Gali būti naudojamas ant sveikos odos kaip priešoperacinis antiseptikas 5 min laikotarpiu (taip pat infekuotoms žaizdoms, bet tik tuomet, jei nesukeliamas skausmas pacientui ir nepakenkiama gydymui).
Hipochlorinė rūgštis (HClO) yra antiseptikas, pasižymintis veiksmingu antimikrobiniu poveikiu, organizmo tolerancija ir saugumu. Hipochlorinę rūgštį taip pat natūraliai gamina ir žmogaus kraujo ląstelės – neutrofilai. Šios rūgšties veikimo mechanizmas: pažeidžia bakterijos membraną ir jos sienelę (22). Dėl savo mažo molekulinio dydžio ir elektrinio krūvio trūkumo, neigiamo krūvio bakterijų paviršius jos neatstumia (2). Hipochlorinė rūgštis yra efektyvi daugeliui bakterijų rūšių, įskaitant ir sporomis besidauginančius grybelius (23,34). Ši rūgštis taip pat mažina lėtinių žaizdų skausmą ir nemalonų kvapą, pasižymi veiksmingu priešuždegiminiu ir antiparazitiniu poveikiu, padidina žaizdų oksigenizaciją ir suardo bioplėveles (29,24). Bioplėvė yra kelių mikrobų rūšių bendrija, apsupta matrikso sudaryto iš polisacharidų. HClO yra labai atsparus antimikrobinėms medžiagoms ir šeimininko imuniniam atsakui (30). Todėl prieš naudojant šį antiseptiką žaizdoms gydyti, jo poveikis turėtų būti įvertintas atsižvelgiant į jo veiksmingumą ne tik įvairiems mikroorganizmams, bet ir bioplėvelei, kurią gamina mikroorganizmai, įskaitant Staphylococcus
aureus ir Pseudomonas aeruginosa. Dėl savo naudingų savybių HClO plačiai naudojamas valyti ir
gydyti lėtines žaizdas (kurios neišgyja iki aštuonių savaičių), ypač diabetines pėdų opas, kojų venų opas ar krūtinkaulio žaizdas po vainikinių kraujagyslių operacijų (24). HClO taip pat gali būti naudojamas siekiant padėti išvengti odos hipertrofinių pakitimų (pragulų) po traumų, operacijų. Pasauliniu mastu paplitęs mikroorganizmų rezintentiškumas antibiotikams sumažino antibiotikų vartojimą ir padidino susidomėjimą medžiagoms, kurios nepasižymi kryžminiu atsparumu (tolerancija antimikrobinėms medžiagoms, atsirandanti veikiant panašiai veikiančioms medžiagoms). Medicinoje naudojamos skirtingos HClO rūšys. Veterinarijoje ir medicinoje taikomi skirtingi molekulinės sintezės ar stabilizavimo metodai, todėl yra naudojamos labai skirtingos hipochlorinės rūgšties koncentracijos (22).
1.4.3. Anolitas kaip dezinfekcinė priemonė
Lyginant anolitą su įprastomis dezinfekcijai skirtomis medžiagomis, jis pasižymi ypač dideliu veiksmingumu. Siūloma daug galimų šios medžiagos panaudojimo būdų: ligoninės, įprasto geriamojo
23 vandens dezinfekcijai, biologinei deaktyvacijai (40). In vitro buvo atliktas antimikrobinis jautrumas prieš ECA anolitą (elektrochemiškai aktyvuotą vandenį) tiriant neseniai iš kiaulių išskirtas
Aeruginosa pleuropneumoniae bakterijas ir MRSA (meticilinui atsparų auksinį stafilokoką). Šis
tyrimas parodė, kad labai mažos ECA anolito koncentracijos vandenyje yra veiksmingos užmušant tiek A. pleuropneumoniae, tiek MRSA. Tyrimo metu atjunkytų paršelių laikymo patalpa buvo išpurškiama dezinfekciniais aerozoliais 3–5 minučių intervalu per 5 val. Praėjus pirmai valandai nuo išpurškimo pradžios, buvo pastebėtas bendras bakterijų skaičiaus patalpoje sumažėjimas, kuris po antrosios valandos dar sumažėjo ir siekė > 97 proc., po trečios valandos > 99,4 proc., o po ketvirtos valandos – iki 99,8 proc. Po 5 valandų bakterijų fermos aplinkoje sumažėjo iki 99,99 proc. EO vanduo, kurio pH yra neutralus, pavyzdžiui, anolitas, suteikia papildomą saugos lygį, kuris nekenkia jo efektyvumui. Kaip ir tikėtasi, EO vanduo oksidacinių reakcijų metu naikina bakterijas, skaidydamas kovalentinį ryšį baltymuose. Buvo nustatyta, kad sunaikinti A. pleuropneumoniae bakterijoms reikia mažesnės ECA anolito koncentracijos. Šiek tiek didesnės ECA koncentracijos buvo reikalingos sunaikinti MRSA (20).
Buvo atliktas palyginamasis tyrimas: jame tirtas medžiagų antibakterinis poveikis dantų kanalų dezinfekcijai. Tyrimo tikslas buvo išsiaiškinti elektrochemiškai aktyvuoto vandens (ECA) antimikrobinį veiksmingumą prieš Enterococcus faecalis lyginant su dažniausiai naudojamomis dantų kanalų dezinfekcinėmis medžiagomis. Buvo naudoti 48 išrauti dantys apie 15 mm ilgio ir 3 dezinfekcinės medžiagos, kurios buvo suskirstytos į grupes (A, B, C): ECA (elektrochemiškai aktyvuotas vanduo) – A grupė, 1 proc. natrio hipochloridas – B grupė, C grupė – 3 proc. natrio hipochloridas, D – distiliuotas vanduo. Atlikus tyrimą, buvo nustatyta, jog ECA vanduo yra netoksiškas, labiau biologiškai suderinamas, nebrangus, lengvai prieinamas, turi stiprų antibakterinį poveikį. Jis gali būti naudojamas kaip šaknies kanalo drėkinimo tirpalas. Tyrimo metu nustatyta, jog antibakterinis ECA vandens efektyvumas buvo panašus į natrio hipochlorito tirpalo prieš
Enterococcus faecalis. Neutralizuotas ECA vanduo yra laikomas naudingesniu dėl savo biologinio
suderinamumo ir ilgesnio tinkamumo laiko (23). Pateiktame tyrime naudotas neutralus anolito tirpalas, kurio pH 6,81 (41). Kitame tyrime, kuriame buvo palygintas antimokrobinis aktyvumas tarp chloro ir aerozoliuoto natrio hipochlorito, chloro dioksido ir elektriškai aktyvuotų tirpalų – buvo padaryta išvada, kad ECA vanduo buvo geresnė dezinfekcinė medžiaga nei sodos hipochloritas (27). Esant sterilioms sąlygoms šviežiai paruoštas ECA vanduo pasižymėjo aukštu aktyvumu visiems mikroorganizmams. ECA vanduo mažiau nei per 2 minutes sumažino mikroorganizmų kiekį iki 99,999 proc. Taip pat dauguma tyrėjų teigė, kad ECA vanduo yra potenciali antimikrobinė medžiaga. Buvo pranešta, kad jo klinikinis panaudojimas yra efektyvus, o tai sutapo ir su šiuo tyrimu (41, 28). Kitame tyrime mokslininkas A. J. Helme ir kt. palygino baktericidinį ECA vandenį ir 2,5 proc. sodos hipochlorito tirpalą. Atlikus tyrimą buvo padaryta išvada, jog baktericidinis ECA vanduo buvo 4
24 kartus efektyvesnis nei turimas komercinis 2,5 proc. sodos hipochlorito tirpalas (41, 40). 1 Lentelėje aprašyti 2011 metais atliktame tyrime išskirta ECA vandens privalumai ir trūkumai (42).
Privalumai Trūkumai
Platus antimikrobinio veikimo spektras Reikalingos pradinės išlaidos generatoriui Greitas dezinfekcijos laikas Reikalinga generatoriaus priežiūra ir naudojimo
įgūdžiai
Nebrangus, on site or in situ generation Ribotas galiojimo laikas
Lengvai prieinama žaliava Inaktyvuotas dėl organinio įkrovimo Ribotas toksiškumas, nekenkia aplinkai ECA gali būti korozinis
25
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto dr. L. Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikoje Eksperimentinės ir klinikinės farmakologijos laboratorijoje. Tyrimas truko nuo 2019 m. spalio iki 2020 m. spalio mėn. Dermatofitas M. canis buvo išskirtas iš X veterinarijos klinikos pacientų plaukų mėginių, kurie turėjo dermatofitozės klinikinių simptomų. Iš viso buvo išskirtos 6
M. canis padermės. Gauti plaukų mėginiai buvo pernešti ant Sabūro agaro (Sabouraud CAF Agar) ir
auginti aerobinėmis sąlygomis 7–11 dienų, 29 oC temperatūroje termostate (TERMOSTAT TC-80M-2).
Tyrimui naudotos medžiagos: įmonėje UAB „Artecona“ eksperimentiškai pagamintas anolitas, Salicilo spiritinis odos tipalas (1 proc. 100 ml tirpalas, Laboratoriums Kosmetyczne CANEXPOL Sp. z o o, Minsk Mazowiecki, Lenkija), Betadine odos tirpalas (10 proc. 120 ml, joduotas povidonas 100mg/ml, EGIS Pharmaceuticals PLC, Vengrija), maistinė acto rūgštis (9 proc., AB ACTAS, Lietuva), burnos skalavimo skystis ORAFLUX CHLORXEKSIDINE (0,12 proc. chlorheksidino, ir 0,12 proc. natrio fluorido, 250 ml, Actavis Group PTC, Islandija). Medžiagos ir vaistai buvo laikomi laikantis gamintojo nurodymų.
Agaras mikroskopinių grybų išskyrimui buvo paruoštas pagal gamintojo reikalavimus. Buvo ištirpinta 65,5 g Sabūro agaro 1 litre išgryninto vandens. Paruoštas tirpalas buvo kaitintas maišant, kol visai ištirps, vėliau autoklavuotas 118 °C temperatūroje apie 15 min. Atvėsintas agaras po 20 ml buvo išpilstytas į stiklines Petri lėkšteles.
26
Tyrimo schema pavaizduota 8 paveiksle. Priešgrybinis visų tirtų medžiagų poveikis buvo tirtas 3 metodais: diskų difuzijos, įdubų ir modifikuotu daugybinių makro praskiedimų metodu.
Dermatofitų kultūra buvo išgryninta persėjimui naudojant dūrio metodą. Išskirta dermatofito kultūra 14 – 21 dieną kultivuota termostate aerobinėmis sąlygomis 29 ±0,5°C temperatūroje. Keturiolikos dienų kolonija buvo padengta 12,5 ml steriliu fiziologiniu tirpalu ir švelniai kelis kartus
27 Pastero pipetės galu perbraukta siekiant suardyti dermatofito kolonijos vientisumą, atskirti hifus ir konidijas nuo kolonijos agaro paviršiaus. Ši suspensija buvo perpilta į sterilų mėgintuvėlį, palikta 15 min nusėsti stambioms dalelėms. Skystis nuo mėgintuvėlio viršaus pipete buvo nutrauktas į kitą mėgintuvėlį ir 10 s maišytas Vortex V-1 plus maišykle.
Difuzijos į agarą (įdubų) metodas buvo naudojamas su anolitu (UAB „Artecona“). Agare daromos įdubos (9 mm diametro), į įdubas įlašinta tiriamoji medžiaga (0,1 ml). Tiriamosios cheminės medžiagos difunduoja į agarą, slopina ant agaro paviršiaus pasėto mikroskopinio grybo Microsporum
canis augimą ir aplink įdubą susiformuoja skaidri zona.
Tiriamųjų medžiagų priešgrybinėms savybėms nustatyti naudoti 6 mm filtrinio popieriaus diskai. Sterilūs filtrinio popieriaus diskai išmirkyti 0,02 ml kiekvienu tiriamuoju tirpalu ir sudėti ant sustingusio agaro su pasėtais Microsporum canis mikromicetais. Petri lėkštelės su pasėtomis
Microsporum canis kultūromis ir tiriamosiomis medžiagomis kultivuotos termostate 29oC temperatūroje. Po 4 d. stebėtos susidariusios zonos. Visų zonų sritys (diametras, mm), kuriuose slopintas Microsporum canis augimas, išmatuotas liniuote. Jei aplink diskus skaidri zona nesusidarė (0 mm), daryta išvada, kad tiriamasis mikroskopinis grybas atsparus tiriamajai medžiagai.
Norint nustatyti anolito minimalią M. canis slopinamąją koncentraciją (MSK), buvo naudotas modifikuotas daugybinių makro praskiedimų metodas. Tirtos anolito koncentracijos: 0,5 proc., 0,05proc., 0,005 proc., 0,0005 proc. Nustačius anolito MSK, jo efektyvumas buvo lyginamas su kitomis priešgrybinėmis medžiagomis. Jos buvo tirtos 0,05 ir 0,005 proc. koncentracijomis. Šio metodo metu skirtingo praskiedimo priešgrybinės medžiagos buvo tiesiogiai maišomos su M. canis sporomis. Pastarųjų koncentracija visuose mišiniuose buvo 20 proc. Po 5 min tiesioginio kontakto laiko kiekvieno praskiedimo mišinys 3 lašais buvo persėtas ant Sabūro mitybinės terpės paviršiaus. Atlikta po 5 pakartojimus. Stebimas sporų augimas arba slopinimas.
Statistinė duomenų analizė atlikta kompiuterine programa IMB SPSS Statistics 25. Skaičiuotas vidurkis, standartinė paklaida, patikimumumas, Stjudento T-test testai.
28
3.TYRIMO REZULTATAI
3.1 Anolito ir priešgrybinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui
Microsporum canis nustatymas diskų difuzijos metodu
Diskų difuzijos metodo rezultatai pateikti 9 paveiksle. Anolitas tiriant diskų difuzijos metodu slopinamųjų zonų grybui M. canis nesudarė visai. Tiriant diskų difuzijos metodu acto rūgštis sudarė didžiausią zoną vid. 22,46 ±0,4mm, tačiau ji statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo joduoto povidono 20,15 ± 0,4mm (p>0,05), todėl galime teigti, kad abiejų medžiagų stiprumas buvo panašus. Joduotas povidonas statistiškai reikšmingai skiriasi ir yra stipresnis už salicilo spiritą 13,92 ±0,3mm (p<0,0001) ir chlorheksidiną (p<0,001). Chlorheksidinas sudarė mažiausią slopinamąją zoną 7,92mm ±0,1mm ir ji buvo statistiškai reikšmingai mažesnė už salicilo spirito (p<0,0001) ir joduoto povidono (p<0,0001). Visos priešgrybinės medžiagos sudarė nelygaus apskritimo M. canis slopinimo zonas (10 pav.). 20.15 22.46 13.92 7.92 0 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 Joduotas povidonas 10% Acto rūgštis 9% Salicilo spiritas 1% Chlorheksidinas 0.12% Anolitas 100%*
M. Canis slopinimo zonų dydis, mm
a c
9 pav. Visų tirtų medžiagų vidutinių M. canis slopinimo zonų palyginimas tirtas diskų difuzijos metodu
*400-500ppm a, b, c statistiškai reikšmingai skyrėsi
a b
29
3.2 Anolito ir priešgrybinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui
Microsporum canis nustatymas difuzijos į agarą (įdubų) metodu
Įdubų metodo rezultatai pateikti 11 paveiksle. Šiuo metodu stipriausiomis M. canis slopinamosiomis savybėmis pasižymėjo acto rūgštis vid. 28,34 ±0,3mm. Silpniausiomis slopinamosiomis savybėmis pasižymėjo anolitas vid. 15,07 ±0,3mm. Chlorheksidinas ir salicilo spiritas sudarė panašaus diametro M. canis slopinamąsias zonas, atitinkamai 19,11 ±0,4mm ir 17,56 ±0,2mm. Joduotas povidonas buvo antras pagal stiprumą po acto rūgšties ir sudarė vid. 23,90 ±0,6 mm diametro slopinamąją zoną.
Anolito sudarytos M. canis slopinimo zonos statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo acto rūgšties (p<0,001) ir juodoto povidono (p<0,001) sudarytų zonų ir buvo mažesnės. Anolito sudarytos M. canis slopinimo zonos taip pat buvo mažesnės už chlorheksidino ir salicilo spirito, taip pat statistiškai reikšmingai skyrėsi: chlorheksidinas (p<0,001), salicilo spiritas (p<0,001).
Taip pat difuzijos į agarą metodu ištirta, jog anolitas ir kitos tirtos priešgrybinės medžiagos taip pat sudarė netaisyklingo apskritimo formos slopinamąsias zonas (12 pav.)
10 Pav. Tiriant diskų difuzijos metodu padarytos nuotraukos, kuriose matomos skirtingų priešgrybinių medžiagų slopinimo ribos: a- joduotas povidonas, b- acto rūgštis (nuotraukos autorės)
30 23.90 28.34 17.56 19.11 15.07 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 Joduotas povidonas 10% Acto rūgštis 9% Salicilo spiritas 1% Chlorheksidinas 0.12% Anolitas 100%*
M. Canis slopinimo zonų dydis, mm
b
b
*400-500ppm a, b, c statistiškai reikšmingai skyrėsi
a
a a c
11 pav. Visų tirtų medžiagų vidutinių M. canis slopinimo zonų palyginimas, tirtas įdubų metodu metodu
31
12 pav. Tiriant įdubų metodu padarytos nuotraukos. Petri lėkštelėse matomos nelygios skirtingų priešgrybinių medžiagų slopinimo zonų ribos: a- anolitas
b-salicilo spiritas, c- joduotas povidonas, d- chlorheksidinas, e- acto rūgštis f- kontrolė (nuotraukos autorės)
a
c
b
d
e
f
32
3.3 Anolito ir priešgrybinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui
Microsporum canis nustatymas taikant modifikuotą daugybinių makro
praskiedimų metodą
Tyrime naudotas 400 – 500 ppm anolitas. Atliekant modifikuotą daugybinių makro praskiedimų metodą anolito maišymui su Microsporum canis sporomis buvo naudotos skirtingos anolito koncentracijos 0,5, 0,05, 0,005, 0,0005 proc. Nustatyta, kad anolito minimali slopinamoji koncentracija (MSK) yra 0,05 proc. Kokybiškai įvertinto kiekvienos tirtos anolito koncentracijos
Microsporum canis augimo rezultatai pateikiami 2 lentelėje.
2 lentelė. Skirtingų anolito koncentracijų poveikis Microsporum canis grybeliui
Nustačius anolito MSK, toliau buvo tirtos kitos priešgrybelinį poveikį turinčios antiseptinės priemonės tokiomis pat koncentracijomis. Jų efektyvumas buvo lyginamas su anolitu. Kaip matome 3 lentelėje, acto rūgštis tokiomis pat koncentracijomis buvo neefektyvi. Chlorheksidinas ir salicilo spiritas, esant 0,05 proc. koncentracijai, Microsporum canis sporų augimą slopino, tačiau ne visiškai. Anolitas buvo efektyvesnis, nors galima spėti, kad šių antiseptinių medžiagų MSK yra panaši į anolito. Joduotas povidonas slopino ir esant 0,005 proc. koncentracijai. Tai rodo, kad joduotas povidonas yra efektyvesnis už anolitą, kuris esant tokiai koncentracijai Microsporum canis sporų slopinti nepajėgia.
Koncentracija,
proc. 0,5 0,05 0,005 0,0005
Poveikis M.
canis Slopinimas Slopinimas Augimas Augimas
Nr. Antiseptinė medžiaga Koncentracija, proc. Poveikis
1. Anolitas 0,05 0,005 Slopina Auga 2. Acto rūgštis 0,05 0,005 Auga Auga 3. Joduotas povidonas 0,05 0,005 Slopina Slopina 4. Chlorheksidinas 0,05 0,005 Silpnai auga Auga 5. Salicilo spiritas 0,05 0,005 Silpnai auga Auga 6. Kontrolė - Auga
3 lentelė. Skirtingų koncentracijų antiseptinių medžiagų poveikis Microsporum canis dermatofitui
33
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Iki šiol mums prieinamuose moksliniuose straipsniuose nebuvo nustatytos anolito priešgrybinės savybės dermatofitui Microsporum canis įdubų arba diskų metodu. Šiuos rezultatus galima palyginti tik su kitomis priešgrybinėmis medžiagomis bei anolito antibakteriniu poveikiu.
Mūsų atlikto tyrimo metu, modifikuotu daugybiniu makro praskiedimų metodu buvo nustatyta minimali anolito slopinamoji koncentracija (MSK) 0,05 proc. Mokslinėje literatūroje aprašoma, jog Odorcic, S. ir kt. mokslininkų atliktame tyrime hipochlorinė rūgštis 0,01 proc. buvo veiksminga naudojant „in vitro time kill“ metodą. Buvo matomas žymus mieliagrybių: Candida albicans ir
Candida Parapsilosi bei pelėsių: Acremonium kiliense, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Fusarium solani ir Mucor indicus sumažėjimas iki 99,99 proc. per 60 sekundžių (44). Veiksmingas
skirtingas hipochlorinės rūgšties koncentracijas, žinoma, lemia skirtinga mikroorganizmų prigimtis. Pagrindinius skirtumus tarp mūsų ir šio tyrimo rezultatų galėjo lemti skirtingi mikroorganizmai, skirtingas kontakto laikas tarp patogeno ir anolito bei pačios metodikos skirtumai.
Šiame tiriamajame darbe tiriant Microsporum canis slopinamąsias zonas įdubų metodu stipriausiomis priešgrybinėmis savybėmis pasižymėjo acto rūgštis. Nuo seno manoma, kad acto rūgštis puikiai tinka naikinti mikroskopinius grybus, tačiau mums prieinamuose moksliniuose straipsniuose tokie tyrimai atlikti nebuvo. Daugiausiai tyrimų yra atlikta apie acto rūgšties poveikį bakterijoms. N. Pangrasit ir kt. mokslininkai įdubų metodu tyrė acto rūgšties, pieno, lauro ir kaprilo rūgščių antimikrobinį poveikį patogenams: Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli ir Krebsiella spp.. Buvo lyginamos visų tirtų medžiagų
MSK. Acto rūgštis pasižymėjo didesniu antimikrobiniu poveikiu daugumai patogenų, lyginant su kitomis rūgštimis. Tiriant įdubų metodu, acto rūgštis sudarė didesnę slopinamąją zoną visiems tirtiems patogenams palyginti su kitomis tirtomis rūgštimis. Acto rūgšties sudarytos zonos siekė nuo 19,55 ±2,90mm iki 43,6 ±0,60mm. Acto rūgšties MSK sudaryta slopinamoji zona Staphylococcus
epidermidis bakterijoms sudarė 28,3 ±2,03mm zoną ir buvo labai panaši į mūsų tirtame tyrime
difuzijos į agarą metodu gautą 28,3 ±0,3mm M. canis slopinamąją zoną (45). Remiantis abiejų tyrimų rezultatais galima teigti, jog įdubų metodu atsiskleidusios acto rūgšties antimikrobinės savybės įrodo, kad acto rūgštis – tikrai stipri antimikrobinė medžiaga.
J. Fu ir kt. mokslininkai diskų metodu nustatė 7 skirtingų komercinių burnos skalavimo skysčių inhibitorinę slopinamąją zoną prieš Candida albicans ir Candida krusei padermes. Vienas iš tirtų burnos skalavimo skysčių buvo chlorheksidino (0,12 proc.) burnos skalavimo skystis. Mūsų darbo metu lygiai tokios pačios koncentracijos (0,12 proc.) chlorheksidino tirpalas taip pat buvo tirtas diskų difuzijos metodu. Fu ir kt. mokslininkų tyrime diskų difuzijos metodu gauta chlorheksidino Candida
34
albicans zona, kuri buvo 18,6 ±3,5mm ir Candida crusei 14,8 ±0,8mm. Mūsų tyrimo metu tiriant
diskų difuzijos metodu chlorheksidino sudaryta M. canis slopinamoji zona buvo gerokai mažesnė 7,92 ± 0,1mm. Tokį skirtumą galėjo lemti tai, kad J. Fu mokslininkų tyrime naudotas kitos firmos gamybos chlorheksidinas bei tirti skirtingi mikroorganizmai. Taip pat skirtingus rezultatus galėjo lemti nevienodas diskelių prisotinimas ir žmogiškasis faktorius (46). Kitame N. Salim. ir kt. mokslininkų tyrime buvo tirtas chlorheksidino poveikis 79 Candida spp. padermėms daugybinio mikro praskiedimo metodu. Ši medžiaga parodė priešgrybelinį poveikį visoms tirtoms padermėms: chlorheksidino MSK svyruoja nuo 0,78 mg/l (0,000078 proc.) iki 6,25 mg/l (0,00062 proc.) (47); Mūsų atliktame tyrime modifikuotu daugybinių makro praskiedimų metodu chlorheksidino tirpalui esant 0,05 proc. konc., jis nepilnai slopino M. Canis sporas. Mūsų tyrimo metu chlorheksidino tirpalas pasižymėjo silpnesnėmis priešgrybinėmis sąvybėmis.
35
IŠVADOS
1. Anolitas diskų difuzijos metodu nesudarė Microsporum canis slopinamosios zonos. Difuzijos į agarą (įdubų) metodu buvo sudaryta vid. 15 ±0,2mm diametro slopinamoji zona.
2. Taikant modifikuotą daugybinių makro praskiedimų metodą nustatyta, kad anolito Microsporum
canis minimali slopinanti koncentracija yra 0,05 proc.
3. Nustatyta, kad vienodos koncentracijos (0,05 ir 0,005 proc.) priešgrybines medžiagas maišant kartu su Microsporum canis sporomis anolitas veikė stipriau už acto rūgštį, chlorheksidiną ir salicilo spiritą, tačiau silpniau už joduotą povidoną, kuris Microsporum canis slopino ir 0,005 proc. koncentracijos.
36
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Boehm, T. M. S. A., & Mueller, R. S. Dermatophytose bei Hund und Katze – ein Update. Tierärztliche Praxis Ausgabe K: Kleintiere / Heimtiere. 2019; 47(04): p. 257–268.
2. Pasquetti, M., Min, A., Scacchetti, S., Dogliero, A., & Peano, A. Infection by Microsporum canis in Paediatric Patients: A Veterinary Perspective. Veterinary Sciences. 2017; 4(4): p. 46.
3. Moriello, K. A., Coyner, K., Paterson, S., & Mignon, B. Diagnosis and treatment of dermatophytosis in dogs and cats. Veterinary Dermatology. 2017; 28(3): p. 266–268.
4. Espinosa‐Hernández, V., Saunte, D. A systematic review of worldwide data on tinea capitis: Analysis of the last 20 years. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 2020; p. 3. 5. Frymus T, Gruffydd-Jones T, Pennisi MG, Addie D, Belák S, Boucraut-Baralon C, Egberink H, Hartmann K, Hosie MJ, Lloret A, Lutz H, Marsilio F, Möstl K, Radford AD, Thiry E, Truyen U, Horzinek MC. Dermatophytosis in cats: ABCD guidelines on prevention and management. J Feline Med Surg. 2013; 15(7): p. 598-604.
6. Jacobson LS, McIntyre L, Mykusz J. Comparison of real-time PCR with fungal culture for the diagnosis of Microsporum canis dermatophytosis in shelter cats: a field study. J Feline Med Surg. 2018; 20(2): p.103-107.
7. Frymus, T., Gruffydd-Jones, T., Pennisi, M. G., Addie, D., Belák, S., Boucraut-Baralon, C., Horzinek, M. C. Dermatophytosis in Cats. Journal of Feline Medicine and Surgery. 2013; 15(7): p. 598– 604.
8. Abastabar M, Jedi A, Guillot J, Ilkit M, Eidi S, Hedayati MT, Shokohi T, Daie Ghazvini R, Rezaei-Matehkolaei A, Katiraee F, Javidnia J, Ahmadi B, Badali H. In vitro activities of 15 antifungal drugs against a large collection of clinical isolates of Microsporum canis. Mycoses. 2019; 62(11): p. 1069-1078.
9. Moriello, K. A. In vitro efficacy of shampoos containing miconazole, ketoconazole, climbazole or accelerated hydrogen peroxide against Microsporum canis and Trichophyton species. Journal of Feline Medicine and Surgery. 2016; 19(4): p. 370 - 374.
10. Brosh-Nissimov, T., Ben-Ami, R., Astman, N., Malin, A., Baruch, Y., & Galor, I. An Outbreak of
Microsporum canis infection at a military base associated with stray cat exposure and
person-to-person transmission. Mycoses. 2018; 61(7); p. 472–476.
11. Khaing T. A. Evaluation of the Antifungal and Antioxidant Activities of the Leaf Extract of Aloe vera (Aloe barbadensis Miller). World Academy of Science, Engineering and Technology. 2011; 75: p. 610- 612.
