Naujų biologiškai aktyvių spiro junginių sintezė mikrobangų metodu ir priešgrybelinių savybių tyrimas

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

Vaistų chemijos katedra

Liudas Šlepikas

FF V kurso studentas

Naujų biologiškai aktyvių spiro junginių sintezė mikrobangų

metodu ir priešgrybelinių savybių tyrimas

MAGISTRO DIPLOMINIS DARBAS

Mokslinis vadovas

prof. habil. dr. E. Tarasevičius

KAUNAS 2009

SANTRAUKA

Naujų biologiškai aktyvių spiro junginių sintezė mikrobangų metodu ir priešgrybelinių savybių tyrimas.

FF V kurso studentas Liudas Šlepikas

Mokslinis vadovas prof. habil. dr. E. Tarasevičius

Kauno medicinos universitetas, Farmacijos fakultetas, Vaistų chemijos katedra.Kaunas; 2009.

Darbo tikslas – Sintezuoti ir identifikuoti naujus spiro darinius, mikrobangų metodu, turinčius

heterociklinės bei aromatinės struktūros potencialius farmakoforus, atlikti sintezuotų spiro junginių priešgrybelinio aktyvumo tyrimus in vitro.

Tyrimo metodika. Atlikta naujų biologiškai aktyvių spiro junginių sintezė mikrobangų metodu.

Nustatytos naujų sintezuotų spiro junginių fiziko-cheminės savybės instrumentinės analizės metodais: elementinė analizė bei IR spektroskopija. Atliktas priešgrybelinio aktyvumo tyrimas in vitro panaudojant „uţnuodytos lėkštelės metodą“.

Rezultatai. Sintezuota 12 naujų 3-spiro[indol-tiazolidino] ir 3-spiro[indol-triazolo] fragmentą

turintys spiro junginiai su heterocikliniais bei aromatiniais pakaitais, modifikuotu mikrobangų sintezatoriumi. Mikrobangų metodu spiro junginių susidarymo reakcijos laikas 10-15 minučių, gauti junginiai 75-90% išeiga. Elementinės analizės bei IR spektroskopijos metodais identifikuota struktūra bei nustatyta sintezuotų spiro junginių fiziko-cheminės savybės. Biologinio aktyvumo tyrimai parodė, kad aktyviausi prieš Candida albicans, Candida glabrata, Microsporum canis, Penicillium spp, Aspergillus

fumigatus, Scedosporium apiospermum yra spiro junginiai savo struktūroje turintys nitrotiazolo

fragmentą. Atlikus priešgrybelinio aktyvumo tyrimus in vitro, nustatyta, kad du sintezuoti spiro junginiai (ST-9, ST-10) stabdo grybelių augimą. Išsiplėtimo diametras (cm) po 168 valandų augimo: Microsporum

canis- ST-9, ST-10 junginiai slopino augimą, Penicillium spp- 0.8cm ir 0.6cm, Aspergillus

fumigatus-0.7cm ir 0.6cm, Scedosporium apiospermum-0.6cm ir fumigatus-0.7cm. Spiro junginys ST-9 aktyvesnis prieš

Candida albicans nei prieš C. glabrata, o spiro junginio ST-10 aktyvumas vienodas prieš abu Candida albicans, C. glabrata grybelius. Lyginant junginių ST-9 bei ST-10 struktūrą galima daryti išvadą, kad

aktivesnis prieš Penicillium sp, Aspergillus fumigatus pelėsinius grybelius yra naujai sintezuotas spiro junginys ST-10 su aminotriazlo ciklu, tačiau prieš Scedosporium apiospermum pelėsinį grybelį aktyvesnis yra ST-9 tiazolidino ciklą turintis spiro junginys.

Išvados. Remiantis gautais tyrimų rezultatais, galima teigti, kad 3- spiro[indol-tiazolidino] bei 3-

spiro[indol-triazolo] dariniai pasiţymi priešgrybeliniu (fungistatiniu) aktyvumu.

SUMMARY

Microwave assisted synthesis and antifungal research of new biologically active spiro compounds

Faculty of Pharmacy V course student Liudas Šlepikas Tutor Eduardas Tarasevičius, Professor, D. Sc. habil.

Department of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Kaunas University of Medicine. Kaunas; 2009.

Aim of the study. Microwave assisted synthesis and identification of new biologically active spiro compounds, containing heterocyclic and aromatic substitutes as pharmacoforic units. Research on antifungal activity of new synthesized spiro compounds in vitro.

Methods. Identification of the structure of new synthesized spiro compounds was performed according to infrared spectroscopy and elemental analysis. The research on antifungal activity of new synthesized spiro compounds in vitro was performed with poison plate technique. Results. 12 new spiro 3-spiro[indole-thiazolidine] and 3-spiro[indole-triazole] containing heterocyclic and aromatic substitutes as pharmacoforic units have been synthesized. According to IR spectra and elemental analysis the structure of spiro compounds was confirmed. The structures of the most active spiro compounds contain nitrothiazole substitutes, and are active against Candida albicans, Candida glabrata, Microsporum canis, Penicillium spp, Aspergillus fumigatus, Scedosporium apiospermum. ST-9 spiro compound is more active against Candida albicans than C. glabrata and ST-10 spiro compound shows equal activity against Candida albicans and C. glabrata. Comparing the spiro compounds ST-9 and ST-10, compound ST-10 shows higher activity against Penicillium sp, Aspergillus fumigatus, but against Scedosporium apiospermum spiro compound ST-9 is more active.

Conclusions. According to the results of this research 3- spiro[indole-thiazolidine] and 3- spiro[indole-triazole] are potentially active antifungal (fungistatic) compounds.

Keywords. Spiro compounds, Microwave assisted synthesis, Antifungal active compounds.

SANTRUMPOS

BMR –Branduolinis magnetinis rezonansas

CD (ang. Circular dichroism) Cirkuliarinis dichroizmas DCC-N,N'-Dicikloheksilkarbodiimidas

DMFA- Dimetilformamidas

ESC- Efektyvioji skysčių chromatografija

MW ( ang. Microwave) Mikrobangų spinduliuotė PTFE- Politetrafluoretilenas

Turinys

Įvadas ... 6

1. Literatūros apţvalga ... 8

1.1. Grybų, jų sukeliamų ligų įvairovė bei grybelines infekcijas skatinantys veiksniai .... 8

1.2. Grybelinės infekcijos ... 9

1.3. Biologiškai aktyvūs spiro junginiai ... 10

1.4. Fitoaleksinai ... 11

1.5. Mikrobangų sintezės metodas ... 14

1.6. Mikrobangų sintezatorių moduliai ... 17

1.7. Spiro junginių sintezė, panaudojant mikrobangų metodą ... 19

2. Eksperimentinė dalis ... 24

2.1. Spiro junginių sintezė, mikrobangų metodu, panaudojant modifikuotą mikrobangų sintezatorių, gautų junginų grynumo įvertinimas ir identifikavimas. ... 24

2.1.1. Mikrobangų sintezatorius sukūrimas ... 24

2.1.2. Spiro junginių sintezė mikrobangų metodu. ... 25

2.1.3. Spiro junginių grynumo įvertinimas ir identifikavimas ... 30

2.2. Sintezuotų junginių biologinių parametrų įvertinimas ... 34

2.3. Sintezuotų junginių priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas ... 40

2.3.1. „Uţnuodytos lėkštelis metodas“ ... 40

2.3.2. Tyrimams naudotos grybų kultūros ... 40

2.3.3. Tyrimams naudota terpė bei jos paruošimas ... 41

2.3.4. Tiriamųjų junginių 1000 ppm koncentracijų paruošimas ... 41

2.3.5. Terpės su tirpikliais paruošimas... 41

2.3.6. Standarto (amfotericino B) 1000 ppm koncentracijų paruošimas ... 41

2.3.7. Grybelio uţsėjimo procedūra ... 42

2.3.8. Priešgrybelinių rezultatų įvertinimas ... 42

2.3.9. Spiro junginių aktyvumo įvertinimas... 42

Išvados ... 48

Literatūra ... 50

Įvadas

Darbo aktualumas:

Pastaraisiais dešimtmečiais sparčiai besivystant farmacijos pramonei, dėl gausaus priešbakterinių preparatų naudojimo, išsivystė atsparumas antibiotikams bei dezinfekcinėms medţiagoms. Naujų antibiotikų klasių įvedimas į praktiką per pastaruosius 30 metų tapo globali problema, todėl ekspertai prognozuoja artėjančią antibiotikų krizę. Nepaisant gerėjančios medicininės prieţiūros, tobulesnių maisto ir geriamo vandens ruošimo technologijų, pastarąjį dešimtmetį sergamumas uţkrečiamomis ligomis nemaţėja. Dėl minėtų prieţasčių Europos Sąjungoje bei kitose išsivysčiusiose pasaulio šalyse vis didesnis mokslininkų dėmesys skiriamas naujų priešmikrobinių junginių paieškai ir jau esamų tobulinimui[1].

Literatūros duomenimis indolo grupės dariniai pasiţymi plačiu biologiniu aktyvumu [2,3]. Junginiai, struktūroje turintys indolo farmakoforą, pasiţymi priešmikrobiniu ir priešgrybeliniu aktyvumu[4].

Susidomėta indolo dariniais, sujungtais su heterocikliniais dariniais, kurie savo struktūroje turi C-3 spiro jungtį [5-7]. Spiro[indol-tiazolidinai] viena iš labiausiai tyrinėjamų 3-spiro indolo grupės darinių dėl plataus biologinio aktyvumo: priešuţdegiminio [60], fungistatinio [8], bakteriostatinio [9,10]. Spiro junginiai plačiai paplitę alkaloiduose [11], laktonuose ar terpenoiduose [11].

Triazolo dariniai pasiţymi plačiu priešvirusiniu, priešvėţiniu, priešbakteriniu, priešgrybeliniu biologiniu aktyvumu. Daugelis biologiškai aktyvių junginių (ribovirinas, vorozolas, letrozolas, anastrozolas) savo struktūroje turi 1,2,3 bei 1,2,4- triazolo fragmentą.

Tiazolo-tiazolino-tiazolidino dariniai uţima svarbią vietą biologiškai aktyvių junginių tarpe. Visa eilė antibakterinių, prieštuberkuliozinių, priešpirmuoninių, priešgrybelinių, priešvirusinių junginių, antidotų turi savo sudėtyje tiazolo arba jo hidrintų darinių farmakoforus - gamtiniai ir sintetiniai penicilinai, cefalosporinai, monobaktamai. Tiazolo dariniai, turintys –N-C-S- grandinę savo struktūroje, pasiţymi priešgrybeliniu aktyvumu[12], tačiau literatūroje maţai duomenų apie tiazolidino spiro darinius.

Kauno medicinos universiteto Vaistų chemijos katedroje jau daugelį metų sintezuojami tiazolidino dariniai, tiriamas jų priešmikrobinis ir priešgrybelinis aktyvumas. Šioje srityje dirbę Lietuvos mokslininkai Eduardas Tarasevičius, Faustas Malinauskas, Raimondas Radţiūnas,

Rimantas Pečiūra, Vilma Petrikaitė [13] sintezavo keleta šimtų 2- ir 5-pakeistų tiazolidino darinių, pasiţyminčių priešmikrobiniu ir kitokiu biologiniu aktyvumu.

Darbo tikslas – sintezuoti biologiškai aktyvius spiro tiazolidino bei triazolino ciklą turinčius junginius mikrobangų metodu, panaudojant modifikuotą mikrobangų sintezatorių, įvedant heterociklinės bei aromatinės struktūros pakaitus, kaip potencialius farmakoforus, ištirti sintezuotų junginių pagrindines fizikines savybes (lyd. t., Rf, IR spektrai), atlikti naujai sintezuotų junginių priešgrybelinio aktyvumo tyrimus in vitro.

Ekspermentinio darbo uždaviniai:

1. Pasirinkti tinkamiausius spiro junginių sintezės metodus, mikrobangų metodu, panaudojant modifikuotą mikrobangų sintezatorių.

2. Sintezuoti ir identifikuoti naujus spiro darinius mikrobangų metodu, įvedant į jų molekulės, heterociklinės bei aromatinės struktūros potencialius farmakoforus.

3. Apskaičiuoti sintezuotų junginių biologinius parametrus, panaudojant „OSIRIS Property Explorer“ programą.

4. Ištirti pagrindines fizikines naujų junginių savybes (lyd. t., Rf, IR spektrai).

5. Atlikti sintezuotų junginių priešgrybelinio aktyvumo tyrimus in vitro panaudojant mielių, pelėsinių bei dermatofitinių grybelių atstovus.

Magistrinio darbo apimtis ir struktūra

Magistrinį darbą sudaro įvadas, literatūros apţvalga, eksperimentinė dalis (tyrimų metodai), tyrimų rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas (72 literatūros šaltiniai). Pateikta 8 lentelės ir 42 paveikslų. Magistrinio darbo apimtis 60 puslapių.

1.

Literatūros apžvalga

1.1. Grybelių, jų sukeliamų ligų įvairovė bei grybelines infekcijas skatinantys veiksniai Šiuo metu ţinoma daugiau kaip 100000 grybų rūšių, iš kurių apie 400 yra patogeniški ţmonėms [14].

Grybelinės infekcijos daţniausiai sukeliamos įvairių mielių ir pelėsių [15]. Mielių ląstelės yra sferinės ar elipsės formos, 3 - 15 µm diametro (1 paveikslėlis). Mielės paprastai dauginasi pumpuravimosi būdu [16].

Pelėsiai auga 2 - 10 µm diametro vamzdelio formos, išsišakojusiomis ląstelėmis, vadinamomis - hifais (2 paveikslėlis). Visi grybai sudaro sporas, kurios gali būti pernešamos tiesioginiu kontaktu ar per orą [16]:

1 pav. Elipsės formos mielinis grybelis - Candida albicans.

2 pav.Pelėsinis grybelis - Aspergillus niger (liofilizato nuotrauka).

Gebėjimas augti kaip pelėsis ar kaip mielės priklausomai nuo aplinkos temperatūros vadinasi dimorfizmu. Šia savybe pasiţymi kai kurie patogeniniai grybai, augdami kaip mielės 37 °C ir kaip pelėsis 25°C [17].

Grybelines infekcijas skatinantys veiksniai:

- Endogeniniai - lėtinės odos, nagų, plaukų ligos, gydymas vietiniais bei sisteminiais imunosupresiniais vaistais, sisteminės ligos, gydymas citostatikais, cukrinis diabetas, periferinė neuropatija.

- Egzogeniniai - drėgnas klimatas, gausus prakaitavimas, uţdaros avalynės ir drabuţių dėvėjimas, įvairios traumos.

1.2. Grybelinės infekcijos

Ţmogui grybelines infekcijas sukelia mikroskopiniai patogeniniai grybeliai: - Dermatofitai

- Pelėsiai - Mielės

Dermatofitai - grybeliai, sukeliantys odos, plaukų ir nagų infekcijas. Infekcijos, sukeltos dermatofitų, vadinamos dermatofitozėmis. Skirtingai nuo kitų grybų, kaip maisto šaltinį dermatofitai naudoja keratiną. Mikroskopinių grybų sukeltos infekcijos (mikozės) skirstomos į paviršines, poodines ir sistemines. Paviršines odos infekcijas, apimančias odos raginį sluoksnį, plaukus, nagus, daţniausiai sukelia dermatofitai. Dermatofitiją sukelia Microsporum, Trichophyton ir Epidermophyton genčių patogeniniai grybeliai. Dermatofitų sukeliamos ligos yra uţkrečiamos ir perduodamos nuo vieno asmens kitam asmeniui. Paprastai šie grybeliai patenka ir įsiterpia paviršiniame, t. y. raginiame odos, plaukų ir nagų sluoksnyje ir į gilesnius audinius daţniausiai nesiskverbia. Patekę į šiuos suragėjusius, negyvus audinius, grybeliai ima augti ir daugintis.

Literatūroje pateikiama vis daugiau duomenų apie padidėjusį ţmonių susirgimų skaičių mikroskopinių grybų sukeltomis infekcijomis [18-20]. M. Canis daţnai išskiriamas iš sergančių dermatofitija ţmonių mėginių. Infekcijos šaltinis daţniausiai būna sergantys ir kliniškai sveiki gyvūnai-nešiotojai, ektoparazitai, įvairūs apyvokos daiktai, uţteršti dermatofitų sporomis.

Mielės - daţniausias mielių infekcijų sukėlėjas yra Candida albicans. Candida grybelių rūšies sąvoką suformulavo ir juos pirmasis išskyrė 1839 metais mokslininkas B. Langebeck. T. Berg 1848 metais išskyrė Candida sukėlėją iš ţmogaus audinių sekreto. Candida pavadinimas patvirtintas tik 1939 metais trečiame pasauliniame mikrobiologų kongrese. Candida šeimos atstovai yra saprofitai ir paviršinių grybelinių infekcijų sukėlėjai, tačiau susidarius palankioms sąlygoms, kada normali floros pusiausvyra sutrikusi, Candida šeimos atstovai (C. albicans, C. krusei, C. glabrata) gali sukelti sunkias grybelines ligas. Candida albicans - natūralios nosiaryklės ir virškinamojo trakto mikrofloros atstovas.

Pelėsiai- Aspergillus rūšys gyvena mus supančioje aplinkoje. Kadangi Aspergillus sporų yra visur, daţniausiai uţsikrečiama įkvėpus sporų į plaučius, bet galima uţsikrėsti ir per ţaizdas. Daţniausiai aspergilioze serga pacientai, intensyviai gydomi citotoksiniais vaistais arba

sergantys leukoze. Daţniausiai grybelines ligas sukelia A. fumigatus, A. niger ir A. flavus. Kai kurie Aspergillus šeimos atstovai gamina aflotoksinus, kurie gali uţkrėsti pašarų kultūras.

1.3. Biologiškai aktyvūs spiro junginiai

1900 metais mokslininkas Bayer susintetino pirmąjį „spiraną“ - biciklinį junginį, turintį vieną bendrą anglies atomą [21]. Anuomet terminas spirociklanai buvo naudojamas apibūdinant tokios stuktūros junginius. Dabar spiro junginiai apibūdinami kaip bicikliniai organiniai junginiai kai du identiški ar neidentiški ţiedai sujungti vienu, bendru, anglies atomu.

Spiro junginiais paskutiniuoju metu labai susidomėta, dėl jų struktūros bei biologinio poveikio [22-28]. Dėl asimetrinių spiro anglies jungčių atsirandantis chirališkumas vienas iš svarbiausių biologinio aktyvumo kriterijų spiro klasės junginiuose [29].

Spiro junginiai plačiai paplitę alkaloiduose [11], laktonuose ar terpenoiduose [12]. Spiro-oksiindolo dariniai pasiţymi labai plačiu biologiniu aktyvumu- priešbakteriniu, priešvėţiniu, priešgrybeliniu [30-33].

Spiroketaliai bei spiroacetaliai rodo stiprų citotoksinį aktyvumą prieš ţmogaus vėţines ląstelių linijas [34]. Spiroketaliai saponaceolidai (1) pasiţymi priešvėţiniu aktyvumu prieš 60 ţmogaus vėţio ląstelių linijų [35]. Spiroacetalis (2) susidaro iš estrono bei biologiškai aktyvaus mikotoksino- talaromicino B [36]bei taip pat pasiţymi citostatiniu poveikiu:

O O OH H H H O OH O O OH O _R 3 R₂ O O R₁ (1) (2) N H (3)

3 pav. Biologiškai aktyvūs spiro junginiai.

Sintetinis junginys (3), turinti 2,2'-spiro[adamantano] fragmentą, pasiţymi priešvirusiniu poveikiu [37].

Dideliu priešgrybeliniu poveikiu pasiţymi grizeofulvinas (4), kuris, išskirtas iš Penicillium griseofulvum ir iš keturių grizeofulvino stereoizomerų, tik vienas yra aktyvus:

(4) O O Cl O O O O

4 pav. Priešgrybelinis spiro junginys – grizeofulvinas.

Neseniai sintezuota naujų spiro junginių, pasiţyminčių priešbakteriniu bei priešgrybeliniu biologiniu aktyvumu. Girija S. ir bendraautorių [38] sintezuotų junginių (1) pagrindą sudaro spiro[azetidino-2,3'-indolinas]. Atlikti biologiniai aktyvumo tyrimai prieš E.coli, P.aeruginosa. Gautieji spiro junginiai pasiţymėjo priešbakteriniu aktyvumu. Govindasami Periyasami [39] gautų ketokarbazolodispiropyrolidino (2) darinių aktyvumas prieš S. aureus buvo didesnis uţ tetracikliną, kuris naudotas, kaip standartas. Ketti ir bendraautoriai [40] atliko biologinio aktyvumo tyrimus prieš grybelį Candida albicans naujai sintezuoto junginio (3), kurie parodė aukštą gautojo junginio aktyvumą:

N N O R O N H O O O N H R N S O O NH₂ C₁₂H₂₅ (1) (2) (3)

5 pav. Naujai sintezuoti spiro junginiai.

1.4. Fitoaleksinai

Dėl biologinio, fizinio ar cheminio streso kryţmaţiedţių (Brassicaceae) šeimos augalai išskiria antrinius metabolitus - fitoaleksinus ( ang. phytoalexins), kurie vaidina svarbų vaidmenį augalams apsiginant nuo mikroorganizmų [41,42]. Literatūros duomenimis paskutinių dešimtmečių moksliniai tyrimai parodė, kad fitoaleksinai pasiţymi priešmikrobiniu [43], priešgrybeliniu [43], priešvėţiniu aktyvumu [44]. Spiro indolo bei spiro oksindolo dariniai

daţniausiai sudaro struktūrinį fragmento pagrindą fitoaleksinų grupės junginiuose, kurių izoliuota virš 50 [44], ir kurie susidarę iš triptofano ar jo metabolitų [45]:

N H COOH NH₂ H N H N-OSO₃-K+ S-beta-D-gliukoze S H COOH NH₂ H N H NCS COOH NH₂ H H₃CS N H NH S SCH₃ N H N S SCH₃ O N H N S SCH₃ L-cysteinas L-triptofanas L-metioninas brasininas ciklobrasininas spirobrasininas kiti fitaleksinai gliukobrasicinas indol-3-ilmetil izotiocianatas

6 pav. Fitoaleksinų biosintezė Brassicaceae šeimos augaluose [45].

Spiro fitoaleksinų išskirta ir identifikuota pakankamai daug. Paminėtini keletas šios klasės atstovų - spirobrasininas, metoksibrasininas, metoksispirobrasinolis:

N H N S SCH₃ O N N S SCH₃ OCH₃ OH N N S SCH₃ O OCH₃

Spirobrasininas Metoksispirobrasininas Metoksispirobrasinolis

Spirobrasininas egzistuoja dviejų diastereomerinių izomerų pavidalu: N H N S SCH₃ O (S)-(-)-Spirobrasininas N H N S SCH₃ O (R)-(+)-Spirobrasininas

8 pav. Spirobrasinino diastereomerai.

Nors 1987 metais pirmą kartą išskirtasiš P. cichorii fitoaleksinas- spirobrasininas [46], tačiau tik neseniai jis buvo susintetintas ir nustatyta jo stereocheminė struktūra [47,48], kuri patvirtinta 1H BMR [49], bei chiralinė ESC [50]:

9 pav. 1H BMR spirobrasinino spektras [49]: A- recematinis mišinys; B- recematinis mišinys, turintis solvatuojančio agento TFAE; C- sintetinis S enantiomeras, turintis TFAE; D- žiediniskopūstas, turintis TFAE.

10 pav. Chiralinė analizė [50] (±) spirobrasinino. Sąlygos: „Sumichiral OA-4700” chiralinė kolonėlė, mobilioji fazė, i-PrOH-dichloroetanas-heksanas (2:8:90); tėkmės greitis, 1.5ml/min; (a) CD (ang. Circular dichroism) detekcija esant 308nm, (b) UV detekcija esant 308nm.

Spiro junginių erdvinė struktūra patvirtinta šiuolaikinės analizės metodais [51]. Literatūros duomenimis [52] atlikti tyrimai rodo, kad dėl chromoforinės -N=C-SCH3 jungties bei

indolinės dalies, judančios pagal laikrodţio rodyklę bei pereinamojo dipolio momento, atsiranda S konformacijos chirališkumas:

11 pav. Gamtoje sutinkamo spirobrasinino erdvinė struktūra.

1.5. Mikrobangų sintezės metodas

Per pastaruosius keletą dešimtmečių mokslininkai susiduria su kliūtimi sintezuoti naujus biologiškai aktyvius junginius klasikiniais organinės chemijos metodais. Daţniausios kliūtys - lėta reakcijų eiga, maţa galutinio produkto išeiga, didelis priemaišų kiekis. Pagrindiniai būdai, kuriais galima aktyvuoti cheminės reakcijas pateiktoje lentelėje 1 lentelėje [53]:

1 lentelė :cheminių reakcijų aktyvacijos būdai.

Sužadinimo tipas Sąlygos

Pjiezo chemija Šiluminė chemija Garso chemija Elektro chemija Foto chemija Mikrobangų chemija Aukštas slėgis Šildymas Garso šaltinis ir skystis

Pralaidi terpė Chromoforas(ai)

Polinė terpė, terpėje esantys jonai

1986 metais Gedey su bendraautoriais [54] publikavo pirmąjį darbą, kaip paspartinti šildymo procesą, panaudojant mikrobangų metodą. Vėliau pasirodė daugiau kaip keli tūkstančiai darbų, susijusių su mikrobangų metodo panaudojimu organinėje sintezėje. 10 paveikslėlyje pavaizduotas elektromagnetinių bangų spektras [55]:

Ilgosios bangos Radio bangos IR UV x-spinduliai Gama spinduliai

Bangos ilgis (m)

Daznis (Hz) Mikrobangos

12 pav. Mikrobangos yra tarp IR ir radio bangų diapazone. Kadangi kai kurios bangos tarp 1 ir 25 cm yra naudojamos telekomunikacijoje bei radaruose, todėl tik tam tikro dažnio bangos (915, 2450, 5800 ir 22125MHz ) yra naudojamos komerciniams, buitiniams bei moksliniams tikslams [55].

Kiekviena polinė molekulė apibūdinama elektriniu dipoliniu momentu p=ql. Čia dipolio petys l, kartu ir vektorius p nukreiptas nuo neigiamų elektros krūvių centro link teigiamų elektros krūvių centro. Elektromagnetiniame lauke sukeliami šiluminiai procesai atsiranda dėl keletos prieţasčių. Molekulės, atsidūrusios elektriniame lauke, išsirikiuoja tam tikra tvarka [56]. Kintant elektriniam laukui, molekulių vibracija kinta, orientuojantis pagal elektrinį lauką. 12.2 cm bangos ilgio ir 2450 MHz daţniu, vibruodamos 4.9×109 _{kartų per sekundę molekulės labai greitai}

trinasi, susirikiuojant ir vėl persirikiuojant, tokiu būdu sukuriamas didelis vidinis įšilimas, dėl molekulinės trinties bei dielektrinės netekties tangδ [56]:

13 pav. Dipolinės molekulės vibruojančiame elektriniame lauke.

Išsiskiriantis šio proceso šilumos kiekis yra tiesiogiai susijęs su medţiagos molekulių gebėjimu virpėti, veikiant elektriniam laukui, todėl dėl molekulių vibracijos bei trinties, medţiagos temperatūra gali smarkiai pakilti iki 10 °C per 1 sekundę greičiu.

Klasikinis būdas organinėje sintezėje suţadinti reakcijas naudojant šilumą, kuri perduodama daţniausiai panaudojant alyvos, smėlio ar vandens voneles. Šis procesas palyginti lėtas ir daugeliu atveju neefektyvus, perduodant energiją reakcijos sistemai, kuri priklauso nuo šiluminiui laidumui skirtingų medţiagų. Be to reakcijos indo temperatūra visada aukštesnė uţ reakcijos mišinio temperatūrą. Panaudojant mikrobangų metodą gaunamas tiesioginis poveikis visame cheminės reakcijos mišinyje (tirpiklis, reagentai, katalizatoriai) dėl mikrobangų spinduliuotės energijos absorbcijos. Kadangi daţniausiai reakcijos indas padarytas iš mikrobangoms pralaidţios medţiagos (borosilikatino stiklo, kvarco ar teflono), tai, veikiant mikrobangų spinduliuote, nesusidaro gradientinis temperatūros skirtumas, kaip, pavyzdţiui, šildant alyvos (vandens) vonelėje. Todėl nesusidaro ant indo sienelės karštos reakcijos, dėl kurių

paviršiuje gali skilti medţiagos, dalyvaujančios reakcijoje, o jei cheminei reakcijai atlikti naudojami katalizatoriai – deaktyvuotis [57]:

14 pav. Temperatūrų skirtumas (Kelvinais), veikiant mikrobangų spinduoliuote (kairėje) ir šildant klasikine alyvos vonia (dešinėje): mikrobangų spinduliuotės veikiama reakcijos mišinio temperatūra kyla visu tūriu tuo tarpu klasikiniu būdu, šildant alyvos vonia, reakcijos mišinys pirmiausia šyla, kontaktuodamas su stiklinio indo sienelės paviršiumi [57].

Konkrečios medţiagos (pvz. tirpiklio) šiluminės charakteristikos mikrobangų poveikyje priklauso nuo dielektrinių savybių [57]. Medţiagos gebėjimas elektromagnetinę energiją transformuoti į šiluminę tam tikrame bangos daţnyje ir temperatūroje yra nusakomas netekties faktoriumi tangδ ir vadinamas dielektrinės netekties tangδ. Šis netekties faktorius tangδ išreiškiamas kaip konstanta tangδ= ε’’/ε’, kur ε’’yra dielektrinė netektis, kuri parodo elektromagnetinės spinduliuotės, virstančios šiluma efektyvumą. ε’ yra dielektrinė konstanta molekulių, gebančių poliarizuotis elektriniame lauke [58]. Tirpiklius būtų galima sugrupuoti į tris grupes: daug (tangδ>0.5), vidutiniškai (tangδ 0.1-0.5), maţai (tangδ<0.1), absorbuojančius mikrobangų energiją. Pagrindinių organinių tirpiklių dielektrinės konstantos bei netekties faktoriai pateikti 2 lentelėje [58].

2 lentelė:Dielektrinė konstanta ir dielektrinės netekties tangδ kai kuriems organiniams tirpikliams ( 2450 MGz, 20 °C) [68].

Tirpiklis Dielektrinė konstanta Dielektrinės netekties tangδ Heksanas Anglies tetrachloridas Benzenas Chloroformas Acto rūgštis Etilo acetatas Tetrahidrofuranas Metileno chloridas Acetonas 1.9 2.2 2.3 4.8 6.1 6.2 7.6 9.1 20.6 0.091 0.174 0.059 0.047 0.042

Etanolis Metanolis Acetonitrilas Dimetilfomamidas DMSO Skruzdžių rūgštis Vanduo 24.6 32.7 36 36.7 47 58 80.4 0.054 0.941 0.659 0.062 0.161 0.722 0.123

Kaip pavyzdį dieletrinės netekties tangδ svarbos būtų galima pateikti etanolio ir acetono veikimą mikrobangų spinduliuote. Šių tirpikių dielektrinės konstantos labai panašios (etanolio- 24.6, acetono- 20.6) tačiau jų dieletrinės netekties tangδ skiriasi ( etanolio-0.054, acetono- 0.042), todėl veikiant mikrobangomis etanolis per trumpesnį laiką pasiekią aukštesnę temperaturą, nes absorbuoja geriau nei acetonas mikrobangų energiją [58]:

Laikas (s)

Etanolis

Acetonas

15 pav. Temperatūros kitimas etanolio ir acetono veikiant 150W galios mokrobangų spinduliuote.

Tokie tirpikliai, kaip anglies tetrachloridas, heksanas, dioksanas, turėdami maţas dielektrinės konstantos reikšmes, yra daugiau ar maţiau pralaidūs mikrobangoms [59]. Akcentuotina, kad tirpiklius, turinčius maţas tangδ reikšmes, visgi galima naudoti organinėje sintezėje, šildymui mikrobangų spinduliuote, nes reakcijos mišinys paprastai turi polinių, joninių junginių, todėl nepolėje terpėje tokios polinės grupės ar jonai padidins mikrobangų spinduliuotės absorbciją.

1.6. Mikrobangų sintezatorių moduliai

Organinėje sintezėje naudojami dviejų tipų mikrobangų reaktoriai: multimodulinis ir monomodulinis [60]:

Magnetronas

Magnetronas Reakcijos indelis

16 pav. Multimodulinis bei monomodulinis mikrobangų sintezatoriaus modulis [70].

Paprasčiausias yra multimodulinis reaktoriaus tipas, kitaip dar ţinomas kaip buitinė mikrobangų krosnelė. Nors ir buitinės mikrobangų krosnelės yra populiarios ir gana nebrangios, tačiau jų panaudojimas mikrobangų sintezatoriams turi keleta trūkumų. Pirmiausiai elektrinio lauko pasiskirstymas yra netolygus (nehomogeniškas). Jis pasiskirsto tik tam tikrose reaktoriaus vietose. Magnetrono darbas būna nepastovus - tam tikrais laiko tarpais generuodamas mikrobangas jas skleidţia į reaktorių, kitais laiko tarpais jis nedirba, todėl mikrobangos nėra generuojamos. Dėl šių prieţasčių sintezės reakcijas paprastai gana sunku atkartoti. Norint gauti gerą atkartojamumą yra naudojami sudėtingesni bei brangesni monomoduliniai reaktoriai. Šiose reaktoriuose fokusuojamos elektromagnetinės bangos yra tolygiai nukreipiamos į reaktorių, kur yra reakcijos indelis. Magnetronas šiuo atveju dirba tolygiai ir pastoviai, generuodamas mikrobangas [60].

Literatūros duomenimis mikrobangų spinduliuotė yra plačiai taikoma ne tik organinėje sintezėje, atliekant stereoselektyvias chemines reakcijas, per trumpą laiką gaunant grynesnius junginius su didele išeiga, bet ir kitose mokslo srityse (bandinio mineralizacijai, mineralizacijos proceso pagreitinimui, ekstrakcijai ir t.t.) [61]. Panaudojus mikrobangas, gaunama visapusė nauda: maţiau teršiama aplinka (ang. green-chemistry), nes maţiau sunaudojama pradinių reagentų, gaunama didesnė išeiga bei medţiagos būna grynesnės taip pat vykdoma betirpiklė sintezė (anl. solvent-free), sumaţinama toksinių tirpiklių naudojimas [61].

1.7. Spiro junginių sintezė, panaudojant mikrobangų metodą

Daugiakomponentės reakcijos, naudojant mikrobangų metodą, sparčiai auganti vaistų chemijos sritis [36]. Šios reakcijos, naudojant mikrobangų metodą, turi daug pranašumų prieš klasikines pakopines sintezes, nes tokio tipo reakcijose reaguoja vienu metu trys ar daugiau reaktantų, iš kurių gaunamas galutinis produktas [62].

Ţemiau pateikiama literatūros apţvalga mikrobangų metodo panaudojimui spiro junginių sintezėje.

Literatūroje aprašomas klasikinis spiro[indolo-tiazolidinono] susidarymas, naudojant aukštos virimo temperatūros nepolinius tirpiklius (tolueną ar benzolą), pašalinant reakcijos metu susidariusį vandenį ar naudojant vandenį sugeriančius absorbentus [63,64] (bevandenį ZnCl2,

Na2SO4), bei naudojant reakcijos aktyvatorius, tokius kaip DCC [65] ar Hünig‘o bazę [66]:

N H O O

+

17 pav. Klasikinis spiro junginių gavimas.

Tačiau šis procesas pakankamai lėtas, trunkantis iki 24 valandų, o galutinis spiro junginys gaunamas maţa išeiga (~50%) bei maţo grynumo [66]. Tačiau reakcijos sąlygas pakeitus ne klasikiniu šildymo būdu, o veikiant mikrobangų spinduliuote, gaunamas galutinis produktas 85-90% išeiga, o reakcijos laikas sutrumpėja iki 5-15 minučių [51]:

N H O O _{R NH} 2

+

+

18 pav. Spiro junginių gavimas mikrobangų metodu.

2006 metais publikuotame darbe [51] autoriai nagrinėja galimu spiro junginių susidarymo mechanizmą. Pirmiausia, kondensuojantis izatinui (1) ir 3-aminotriazolui (2), susiformuoja in

anglies-azoto dvigubos jungties merkapto grupė, kur yra galimybė vienam iš dviejų nukleofilinių azotų reaguoti su merkapto acto rūgšties karboksiline grupe, susidarant penkianariui spiro[indol-tiazolidinui] (6) arba septinianariui spiro[indol-tiadiazepinonui] (7):

NH O O

+

+

19 pav. Penkianario spiro junginio susiformavimas.

Nustačius gautojo junginio kristalografinę struktūrą, paaiškėjo, kad reakcija vyksta regioselektyviai susidarant penkianariui spiro[indol-tiazolidinui], o septinianaris ciklas nesusidaro [51]:

20 pav. Rentgeno kristalografiniu metodu patvirtina spiro struktūra.

Spiro junginių susidarymo reakcijos mechanizmą nagrinėjo autoriai Anshu Dandia, Ruby Singh [51].Specifinis ne terminis mikrobangų poveikis reakcijos mechanizmui susijęs su greičiu nukleofilinės atakos imininės anglies-azoto dvigubos jungties merkapto grupe. Tarpinė būsena (II) yra labiau polinė nei pradinė būsena (I) dėl susidariusio dipolio, todėl tarpinės būsenos stabilizacija, veikiant mikrobangoms, dėl dipolio-dipolio sąveikos padidėjimo, pasireiškia aktivacijos energijos sumaţėjimu. Taip pat specifinis mikrobangų efektas stebimas antroje reakcijos pakopoje, kur spiro ciklizacija vyksta taip pat per tarpinę dipoliarinę būseną (III), susidarant palankiai sąveikai su elektriniu lauku [51]:

N Het S H O OH N Het S H O OH δ (I) (II) δ N Het S O OH H N Het S C O OH H δ δ (III)

Dėl asimetrinio spiro anglies atomo spiro[indol-tiazolidinas] turi 2 diastereomerus S ir R, kurie literatūros duomenimis [51] susidaro santykiu 3:1.

N H O S N O R N H O S N O R (S)-(-)- diastereomeras (R)-(+)- diastereomeras 22 pav. S ir R diastereomerai.

Panašiai reakcija vyksta vietoje merkapto acto rūgšties panaudojus tiosemikarbazidą [67], tačiau vietoje tiazolidino ciklo susidaro amino triazolino ciklas ir išsiskiria H2S:

+

₊

23 pav. spiro[indol-triazolo] susidarymas.

Autoriai nurodo, kad reakcija vyksta pirmiausia susiformuojant in situ 3-indolyliminui (šifo bazei) (3), kondensuojantis izatinui (1) ir 3-aminotriazolui (2). Tolimesnė tarpinio junginio (5) nukleofilinė ataka imininės anglies-azoto dvigubos jungties amino grupe, atskylant H2S ir

NH N O NH N N N H₂ NH S NH₂

+

24 pav. Spiro junginio susidarymo reakcijos mechanizmas.

Literatūros duomenimis per pastaruosius kelis dešimtmečius susidomėjimas mikrobangų panaudojimu organinėje sintezėje ţenkliai išaugo. Šis naujas metodas pritaikomas reakcijų eigai paspartini, ieškant naujų biologiškai aktyvių, struktūrų. Struktūros modifikacija panaudojant mikrobangų metodą ieškant potencialių biologiškai aktyvių junginių viena perspektyviausių vaistų chemijos sričių.

2.

Eksperimentinė dalis

1. Spiro junginių sintezė, mikrobangų metodu, panaudojant modifikuotą mikrobangų sintezatorių, gautų junginų grynumo įvertinimas ir identifikavimas.

2. Sintezuotų junginių biologinio rodyklių įvertinimas, remiantis „OSIRIS Property Explorer“ programa.

3. Sintezuotų junginių priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas prieš mielių, pelėsinių bei dermatofitinių grybelių atstovus.

2.1. Spiro junginių sintezė, mikrobangų metodu, panaudojant modifikuotą mikrobangų sintezatorių, gautų junginų grynumo įvertinimas ir identifikavimas.

2.1.1. Mikrobangų sintezatorius sukūrimas

Mes modifikavome buitinę mikrobangų krosnelę, sukurdami laboratorinį mikrobangų sintezatorių, remiantis literatūros duomenimis [68-71]:

5

6

25 pav. Mikrobangų sintezatoriaus principinė schema: 1- magnetronas, 2- reakcijos mišinys su magnetu dengtu PTFE, 3- aliuminio lėkštė, 4- magnetinė maišyklė, 5- cirkuliuojantis vanduo, 6- kietas absorbentas mikrobangės viduje.

Modifikuojant buvo pragręţta skylė viršutinėje krosnelės dalyje ir pro ją patalpintas tarpinis stiklinis vamzdelis, kurio apatinis galas sujungtas su apvaliadugne kolba (10-50 ml), o viršutinis galas sujungtas su grįţtamuoju vandens šaldytuvu. Tarp stiklinio vamzdelio ir mikrobangų krosnelės korpuso likęs tarpas buvo uţpildytas klijais, apsaugant nuo mikrobangų nuotėkio. Mikrobangų krosnelės šoninėje sienelėje buvo pragręţtos dvi skylės, pro kurias patalpintas stiklinis „U“ formos vamzdelis. Pro jį tekantis vanduo sugeria energijos perteklių ir neleidţia magnetronui perkaisti.. Mikrobangų krosnelės apačioje iškirpta apvalios formos skylė ir sujungta su magnetine maišykle Magnetinės maišyklės metalinis paviršius buvo izoliuotas aliuminio folija ir apvalios formos aliuminine lėkšte. Visi sujungimai tarp magnetinės maišyklės ir mikrobangų krosnelės buvo izoliuoti klijais, vengiant atvirų metalinių paviršių bei mikrobangų nuotėkio. Mikrobangų sintezatoriaus viduje talpinamas nedidelis kiekis kieto absorbento (aliuminio oksido), kuris sugeria energijos perteklių, ilgai veikiant magnetronui.

2.1.2. Spiro junginių sintezė mikrobangų metodu. Bendra reakcijų schema

NH O O

₊

N N N N S NO₂ N S N SH _N S S O N S NO₂ Cl Cl Cl NH Kur R :

27 pav. spiro[indol-tiazolidino] ir spiro[indol-triazolo] sintezė.

(1,2,4-triazol-4-il)-4'H-spiro[indol-3,2'-[1,3]tiazolidin]-2,4'(1H)-dionas (ST-1), 3'-(6-nitro-1,3-benztiazol-2-il)-4'H-spiro[indol-3,2'-[1,3]tiazolidine]-2,4'(1H)-dionas (ST-3), (5-sulfanil-1,3,4-thiadiazol-2-il)-4'H-spiro[indol-3,2'-[1,3]tiazolidin]-2,4'(1H)-dionas (ST-5), 3'-(4-okso-2-tiokso-1,3-tiazolidin-3-il)-4'H-spiro[indol-3,2'-[1,3]tiazolidin]-2,4'(1H)-dionas 7), 3'-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-4'H-spiro[indol-3,2'-[1,3]tiazolidin]-2,4'(1H)-dionas 9), 3'-[(2,4,6-trichlorofenil)amino]-4'H-spiro[indol-3,2'-[1,3]tiazolidin]-2,4'(1H)-dionas (ST-11):

A. 10 mmol izatino (1.47 g.) ir 10 mmol atitinkamo heterociklinio ar aromatinio amino gerai sumaišoma ir įpilama 5 ml EtOH (ST-1, ST-5, ST-7), 10 ml EtOH (ST-9) ar 5 ml EtOH ir 5 ml DMF (ST-3, ST-11). Kolbutė sujungiama su grįţtamuoju vandens šaldytuvu ir veikiama mikrobangomis 400 W galia 8 minutes ( ST-1, ST-3, ST-5, ST-7) ar 10min. (ST-9, ST-11). Po kelių minučių rakcija prasideda: reakcijos mišinys uţverda, pakinta spalva į sodriai tamsią raudoną. Reakcija monitoruojama plonasluoksne chromatografija ( tirpiklių sistema acetonas:petroleteris/ 50:50). Kai reakcija įvyksta (8-12 min.), į reakcijos mišinį kolbutėje įlašinama 10 mmol merkapto acto rūgšties (0.69 g., ρ= 1.325 g/cm3). Sujungus su vandens šaldytuvu, veikiama mikrobangmų spinduliuote 4 minutes, monitoruojama plonasluoksne chromatografija (tirpiklių sistema acetonas:petroleteris/ 50:50), kol įvyksta reakcija. Susidaręs reakcijos produktas kristalinamas iš EtOH. Reakcijų išeigos, lydymosi temperatūros ir elementinės analizės duomenys pateikti 3 lentelėje. IR spektrai pateikti 4 lentelėje.

B. 10 mmol izatino (1.47 g.) ir 10 mmol atitinkamo heterociklinio ar aromatinio amino gerai sumaišoma ir įpilama 5 ml EtOH (ST-1, ST-5, ST-7), 10 ml EtOH (ST-9) ar 5 ml EtOH ir 5 ml DMF (ST-3, ST-11), įlašinama 10 mmol merkapto acto rūgšties (0.69 g., ρ= 1.325 g/cm3). Kolbutė sujungiama su grįţtamuoju vandens šaldytuvu ir veikiama mikrobangomis 400 W galia 12 minučių ( 1, 3, 5, 7) ar 14 min. (9,

ST-11). Po keliu minučių rakcija prasideda: reakcijos mišinys uţverda, pakeičia spalvą į sodriai tamsią raudoną, kuri po kurio laiko pereina į šviesesnę. Reakcija monitoruojama plonasluoksne chromatografija (tirpiklių sistema acetonas:petroleteris/ 50:50). Susidaręs reakcijos produktas kristalinamas iš EtOH. Reakcijų išeigos, lydymosi temperatūros ir elementinės analizės duomenys pateikti 3 lentelėje. IR spektrai pateikti 4 lentelėje.

3 lentelė: 3-pakeistų spiro[indol-tiazolidino] junginių charakteristikos.

N H O S N O R Junginio Nr. R Išeiga (%)/ reakcijos laikas (min) Lyd. t. (ºC) Mol. formulė (Mr) Elementinė analizė Apskaičiuota/ rasta(%) Rf reikšmė (Acetonas: Petroleteris 1:1) N % S % ST-1 N N N 85/12 173-175 C12H9N5O2S 287.29 24.38 24.22 11.16 11.18 0.82 ST-3 N S NO_{2 76/ 12 255-257} C17H_398.41 10N4O4S2 14.06 13.99 16.10 16.15 0.77 ST-5 N S N SH 83/12 215-217 C12H8N4O2S3 336.41 16.65 16.87 28.59 28.10 0.80 ST-7 N S S O 90/12 205-207 C13H9N3O3S3 351.42 11.96 12.06 27.37 27.14 0.78 ST-9 N S NO₂ 88/14 245-248 C13H8N4O4S2 348.35 16.08 15.98 18.41 18.66 0.76 ST-11 Cl Cl Cl NH 73/14 257-259 C16H10Cl3N3O2 S 414.69 10.13 10.31 7.73 7.98 0.74

4 lentelė: Spiro[indol-tiazolidino] junginių IR spektrai: Junginio Nr. IR (KBr) (cm-1) ST-1 3350-3250 ( NH), 2970, 2895 ( C-H), 1730, 1700 ( C=O) ST-3 3390-3280 ( NH), 2940, 2893 ( C-H), 1720, 1630 ( C=O) ST-5 3315–3200 ( NH), 2925, 2820 ( C-H), 1745, 1720 ( C=O) ST-7 3295–3205 ( NH), 2980, 2880 ( C-H), 1700, 1690 ( C=O) ST-9 3325-3265 ( NH), 2955 2875 ( C-H), 1730, 1700 ( C=O) ST-11 3335-3180 ( NH), 3045, 2805 ( C-H), 1725 1690( C=O) - 5'-amino-4'-(4H-1,2,4-triazol-4-il)-2',4'-dihidrospiro[indol-3,3'-[1,2,4]triazol]-2(1H)-onas (ST-2), 5'-amino-4'-(6-nitro-1,3-benztiazol-2-il)-2',4'-dihidrospiro[indol-3,3'-[1,2,4]triazol]-2(1H)-one (ST-4), 5'-amino-4'-(5-sulfanil-1,3,4-tiadiazol-2-il)-2',4'-dihidrospiro[indol-3,3'-[1,2,4]triazol]-2(1H)-one (ST-6), 5'-amino-4'-(4-okso-2-tiokso-1,3-tiazolidin-3-il)-2',4'-dihidrospiro[indol-3,3'-[1,2,4]triazol]-2(1H)-onas (ST-8), 3'-(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)-2',4'-dihidrospiro[indol-3,3'-[1,2,4]triazol]-]-2(1H)-onas (ST-10), 5'-amino-4'-[(2,4,6-trichlorofenil)amino]-2',4'-dihidrospiro[indol-3,3'-[1,2,4]triazol]-2(1H)-onas (ST-12):

A. 10 mmol izatino (1.47 g.) ir 10 mmol atitinkamo heterociklinio ar aromatinio amino gerai sumaišoma ir įpilama 5 ml EtOH (ST-2, ST-8, ST-10), 10 ml EtOH (ST-6) ar 5 ml EtOH ir 5 ml DMF (ST-4, ST-12). Kolbutė sujungiama su grįţtamuoju vandens šaldytuvu ir veikiama mikrobangomis 400 W galia 8 minutes ( ST-2, ST-4, ST-6, ST-8, ST-10) ar 10 min. (ST-12). Po kelių minučių reakcija prasideda: reakcijos mišinys uţverda, pakeičia spalvą į sodriai tamsią raudoną. Reakcija monitoruojama plonasluoksne chromatografija ( tirpiklių sistema acetonas: petroleteris/ 50:50). Kai reakcija įvyksta (8-12 min), į reakcijos mišinį kolbutėje suberiama 10 mmol (0.91 g.) tiosemikarbazido. Sujungus su vandens šaldytuvu veikiama mikrobangomis 2-4 minutes, monitoruojama plonasluoksne chromatografija ( tirpiklių sistema acetonas:petroleteris/ 50:50) bei švino popierėliumi (kuris pajuoduoja dėl išsiskiriančio H2S), kol įvyksta reakcija. Susidaręs reakcijos

produktas kristalinamas iš EtOH. Reakcijų išeigos, lydymosi temperatūros ir elementinės analizės duomenys pateikti 5 lentelėje.. IR spektrai pateikti 6 lentelėje

B. 10 mmol izatino (1.47 g.), 10 mmol (0.91 g.) tiosemikarbazido ir 10 mmol atitinkamo heterociklinio ar aromatinio amino gerai sumaišoma ir įpilama 5 ml EtOH (ST-2, ST-8, ST-10), 10 ml EtOH (ST-6) ar 5 ml EtOH ir 5 ml DMF (ST-4, ST-12). Kolbutė sujungiama su grįţtamuoju vandens šaldytuvu ir veikiama mikrobangomis 400 W galia 10 minučių ( ST-2, ST-4, ST-6, ST-8, ST-10) ar 12 min. (ST-12). Po kelių minučių reakcija prasideda: reakcijos mišinys uţverda, pakeičia spalvą į sodriai tamsią raudoną ir reakcijos mišinys išsikristalina. Reakcija monitoruojama plonasluoksne chromatografija ( tirpiklių sistema acetonas:petroleteris/ 50:50) bei švino popierėliumi (kuris pajuoduoja dėl išsiskiriančio H2S), kol įvyksta reakcija. Susidaręs reakcijos produktas kristalinamas

iš EtOH. Reakcijų išeigos, lydymosi temperatūros ir elementinės analizės duomenys pateikti 5 lentelėje. IR spektrai pateikti 6 lentelėje.

5 lentelė: 3-pakeistų spiro[indol-triazolino] junginių charakteristikos.

NH O N H N N NH₂ R Junginio Nr. R Išeiga (%)/ reakcijos laikas (min) Lyd. t. (ºC) Mol. formulė (Mr) Elementinė analizė Apskaičiuota/ rasta(%) Rf reikšmė (Acetonas: Petroleteris 1:1) N % S % ST-2 N N N 89/12 255-257 C11H10N8O 270.25 41.46 40.97 - 0.83 ST-4 N S NO_{2 78/12 235-237} C16H_381.36 11N7O3S 25.71 26.07 8.41 8.53 0.78 ST-6 N S N SH 85/12 207-209 C11H9N7OS2 319.36 30.70 30.54 20.08 20.25 0.81 ST-8 N S S O 91/12 198-200 C12H10N6O2S 2 334.37 25.13 25.41 19.18 19.69 0.80

5 lentelės tęsinys: 3-pakeistų spiro[indol-triazolino] junginių charakteristikos ST-10 N S NO₂ 90/12 236-238 C12H9N7O3S 331.30 29.59 30.07 9.68 10.13 0.75 ST-12 Cl Cl Cl NH 78/14 249-251 C15H11Cl3N6 O 397.64 21.13 21.41 - 0.73

6 lentelė: Spiro[indol-triazolino] junginių IR spektrai.

Junginio Nr. IR (KBr) (cm-1) ST-2 3420 ( NH2), 1725, 1700 ( C=O), 1620 ( C=N) ST-4 3410 ( NH2), 1760, 1700 ( C=O), 1615 ( C=N) ST-6 3420 ( NH2), 1790, 1700 ( C=O), 1620 ( C=N) ST-8 3435 ( NH2), 1720, 1700 ( C=O), 1610 ( C=N) ST-10 3425 ( NH2), 1715, 1700 ( C=O), 1620 ( C=N) ST-12 3400 ( NH2), 1725, 1700 ( C=O), 1620 ( C=N)

2.1.3. Spiro junginių grynumo įvertinimas ir identifikavimas IR spektrai uţrašyti spektrometru Thermo Nicolet Matson 300 KBr tabletėje.

Elementinė azoto analizė atlikta Kjeldalio metodu panaudojant analizatorių Gerhardt Vapodest 20.

Elementinė sieros analizė atlikta Šionigerio metodu.

Reakcijų eiga ir medţiagų grynumas buvo sekami plonasluoksnės chromatografijos metodu, naudojant „Merck-UV-254“ plokšteles, panaudojant keletą skirtingų tirpiklių sistemų.

Junginių lydymosi temperatūros nustatytos Koflerio lydymosi temperatūros nustatymo aparatu su mikroskopu.

.2.1.3.1 Lydimosi temperatūros nustatymas

Gautų cheminių junginių lydymosi temperatūra nustatoma Koflerio lydymosi temperatūros nustatymo aparatu. Jis yra sudarytas iš mikroskopo, kaitinimo elemento, ir termometro.

Nedidelis kiekis medţiagos yra uţdedamas ant objektyvinio stiklelio, kuris prieš tai yra nuvalomas acetonu ir išdţiovinamas. Ant jo yra dedamas kitas nuvalytas ir išdţiovintas stiklelis. Stikleliai yra suspaudţiami ir medţiaga yra sutrinama, kad neliktų stambių kristalų. taip paruoštas mėginys yra patalpinamas ant objektyvinio stalelio, kuris yra šildomas kaitinimo elementu. Į objektyvinį stalelį yra įstatomas termometras, kuriuo yra fiksuojama temperatūra. Cheminės medţiagos pasikeitimai yra stebimi pro okuliarą.

Lydymosi pradţia yra fiksuojama tuomet, kai pasirodo pirmasis apskritas lašas, o pabaiga - kai išsilydo visi kristaliukai. Taip pat buvo stebima ir skilimo temperatūra, nes gautieji junginiai turi savybę ne lydytis, o pakeisti spalvą, t.y. skilti. Plika akimi buvo stebimi medţiagų spalviniai kitimai į juodą ar juodai rudą ir fiksuojamos skilimo temperatūros.

Duomenys yra pateikti 3 ir 5 lentelėje.

.2.1.3.2 Plonasluoksnė chromatografija Chromatografijos atlikimo sąlygos:

Chromatograma yra daroma ant „Merck-254“ plokštelių, kurių matmenys 20x20 cm2

ar 30x30 cm2.

Chromatograma yra patalpinama į stiklinę kamerą 50x50x50 cm3 Tirpiklių sistema yra naudojama pasirinktinai :

- acetonas:petroleteris (1:1) - acetonas:petroleteris (2:1)

- acetonas:petroleteris:heksanas (2:1:1)

Šios sistemos parinktos eksperimentiškai. Nustatyta, kad jose aiškiai išsiskiria priemaišų dėmės.

- Ryškinimui naudojama jodo garų kamera taip pat stebimos junginių dėmės UV šviesoje.

- Tiriamosios medţiagos tirpiklis parenkamas priklausomai nuo jos tirpumo. Daţniausiai etanolio ir acetono mišinys.

- Chromatografija atliekama kylančiuoju metodu.

Chromatografijos atlikimo metodika:

Tirpiklių sistema yra paruošiama dar prieš darant chromatogramą ir supilama į chromatografavimo kamerą. Jos pilamas toks kiekis, kad susidarytų 0,5-1,0 cm sluoksnio storis. Kameros vidinės sienelės yra padengiamos filtriniu popieriumi, kad kamera tolygiau įsisotintų tirpiklio mišinio garais (priekinė sienelė nedengiama). Paliekama 20-30 min. Tuo metu yra daromi tiriamųjų medţiagų tirpalai. Jie yra uţnešami 1mm diametro stikliniu kapiliariuku ant starto linijos, kuri yra ţymima 1,5-2 cm nuo plokštelės apatinio ir šoninio kraštų. Atstumas tarp tiriamųjų medţiagų yra daromas apie 1 cm. Uţnešus ant plokštelės tiriamąją medţiagą, jos tirpiklis yra nugarinamas kambario temperatūroje ar naudojant oro srovę. Taip išdţiovinus vėl pakartotinai uţnešamas toks pats kiekis medţiagos ir vėl dţiovinama. Šalia tiriamųjų medţiagų yra dedami ir liudytojų tirpalai.

Kuomet visiškai išgarinami tirpikliai, chromatografinė plokštelė yra patalpinama į chromatografavimo kamerą ir stebimas tirpiklių sistemos kilimas. Kai tirpiklių sistema pakyla apie 15-20 cm (priklausomai nuo naudojamos plokštelės), chromatograma yra išimama ir dţiovinama traukos spintoje kambario temperatūroje ar oro srove.

Dėmės išryškeja jodo kameroje.

Chromatogramai išdţiūvus matuojamas medţiagos nueitas kelias ir skaičiuojama Rf reikšmė. Tiriamųjų medţiagų Rf reikšmės lyginamos su liudytojų Rf reikšmėmis.

Rf apskaičiuojama pagal šią formulę: Rf=a/h

kur a – nueitas tiriamosios medţiagos kelias h – tirpiklių sistemos nueitas kelias. Duomenys yra pateikti 3 ir 5 lentelėje

.2.1.3.3 Sieros procento nustatymas Šionigerio metodu Bario chlorato tirpalo gamyba:

Mikroanalizinėmis svarstyklėmis atsveriama 0,9868 g. bario karbonato, išdţiovinto 105ºC. Atsveriama ant aliuminio folijos ir supilama per piltuvėlį į 1l matavimo kolbą. Į kolbą įlašinama 2 g. 57% perchlorato rūgšties, kurios lyginamasis svoris 1,500 g/cm3

, V= 1,3ml. Aliuminio folija, ant kurios buvo sveriamas bario karbonatas, praplaunama 10ml distiliuoto vandens ir į matavimo kolbą įpilama dar 10 ml distiliuoto vandens. Kolbos turinys maišomas, kol ištirpsta bario karbonatas, įlašinant dar 5 lašus perchlorato rūgšties. Po to įpilama 80 ml distiliuoto vandens, ir tirpalas praskiedţiamas etanoliu iki 1 l ţymės. Tirpalo pH~ 3.

Sieros kiekio nustatymas:

Pasveriamas tikslus kiekis analizuojamos medţiagos (apie 0,003-0,005 g.). Sveriama ant specialios formos bepelenio filtro mikroanalitinėmis svarstyklėmis. Kiekvienos tiriamos medţiagos sveriama po 3 mėginius. Filtras su tiriama medţiaga sulankstomas.

Paruošiamos kolbos su šlifais. Į kolbas pripilama po 4ml distiliuoto vandens ir įlašinama po 4 lašus 30% perhidrolio. Sulankstytas bepelenis filtras įdedamas tarp platininės vielos gabaliukų, pritvirtintų prie kolbos kamščio. Kolbos pripildomos deguonimi, bepelenis filtriukas padegamas ir sudeginamas uţdarius kolbas deguonies aplinkoje. Kolbos sudedamos į purtyklę ir purtoma apie 30min, kol išsisklaido kolboje susidaręs rūkas. Kolbos sienelės ir platinos vielos tinklelis praplaunami 16ml acetono. Tirpalas titruojamas 0,005 M bario chlorato tirpalu, įlašinus indikatorių: 3 lašus 0,2% vandenilio torino tirpalo ir 2 lašus 0,0125% vandenilio metileno mėlio tirpalo. Titruojama kol tirpalo spalva iš melsvai ţalsvos pasikeičia į ţalsvai roţinę.

Sieros kiekis procentais tiriamajame junginyje nustatomas pagal formulę:

S%=n x M x V x F x 100 / a

kur n – sieros atomų skaičius junginio molekulėje; M – bario chlorato molinė koncentracija;

V – titravimui sunaudotas bario chlorato tirpalo kiekis ml; F – faktorius

.2.1.3.4 Azoto kiekio nustatymas Kjieldalio metodu

Grūstuvėje sutrinama 1 katalitinė tabletė (5,3 g.) ir sumaišoma su tiksliai pasverta analizuojama medţiaga (100 mg). Šis mišinys suberiamas į mineralizacijos kolbą ir pripilama 7 ml koncentruotos sieros rūgšties.

Iš pradţių atliekamas dţiovinimas, kuris trunka 15 minučių esant 250ºC temperatūrai. Po šio proceso vykdoma mineralizacija, kuri trunka 1 valandą esant 410ºC temperatūrai. Gautas mineralizatas atšaldomas iki kambario temperatūros.

Toliau atliekamas distiliavimas pripilant 70 ml 40% natrio šarmo tirpalą ir veikiant vandens garais. Distiliatas surenkamas į atskirą indą kur yra pripilta 50 ml 3% H3BO3 ir įlašinta

3 lašų indikatoriaus kongo raudonojo. Titruojama su 0,1 N H2SO4 kol tirpalo spalva pakinta į

violetinę spalvą.

Procentinis azoto kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:

N%=sunaudoto titranto tūris ml ×1400 / pavyzdžio svoris

Azoto procento nustatymo rezultatai pateikti 3 ir 5 lentelėje

.2.1.3.5 Sintezuotų junginių IR spektrai

1.5 mg tiriamos medţiagos ir 0.3 gramai kalio bromido grūstuvėlėje sutrinama iki smulkių miltelių. Gautas mišinys perkialiamas į specialų presą, skirta KBr tablečių formavimui. 5 mintutes veikiant vakuumui iš specialaus KBr tablečių preso išsiurbiamas oras. KBr tabletė su tiriamąja medţiaga formuojama presuojant. Gauta KBr tabletė su tiriamąja medţiaga įdedama į specialų stovelį IR spektrometre. IR spektrai sintezuotų junginių pateikti 4 ir 6 lentelėse bei priede.

2.2. Sintezuotų junginių biologinių parametrų įvertinimas

Biologinio junginių aktyvumo prognozė atlikta, panaudojant „OSIRIS Property Explorer“ programą [72]. Pagrindiniai parametrai, pagal kuriuos programa analizuoja cheminę struktūrą yra šie:

- cLogP apskaičiavimas - Tirpumo logS apskaičiavimas - Molekulinė masė

- Molekulių fragmentų nuspėjimas, atsiţvelgiant į įvairias rinkoje esančių veikliųjų medţiagų struktūras.

- Bendras „vaistų“ atitikmens rezultatas

cLogP junginio reikšmė, kuri yra logoritmas, išreikštas santykiu tarp n-oktanolio ir vandens cLog(coktanolio/cvandens) ir labai paplitęs junginio hidrofiliškumo matavimui. Maţas

hidrofiliškumas ir aukšta cLogP vertė pasireiškia nedidele absorbcija ar praeinamumu. Įrodyta, kad lengvai besiabsorbontuojantys junginiai turi cLogP ≤5.

28 pav. Apskaičiuotas cLogP vertės pasiskirstymas tarp daugiau kaip 3000 prekyboje esančių veikliųjų medžiagų.

Junginio tirpumas vandenyje svarbi absorbcijos ir pasiskirstymo charakteristika. Paprastai maţas tirpumas pasireiškia prasta absorbcija. Tirpumas gali būti išreikštas logS (mol/l):

29 pav. Daugiau kaip 80% prekyboje esančių veikliųjų medžiagų turi logS, kuris daugiau - 4.

Molekulinės masės pasiskirstymas tarp prekyboje esančių veikliųjų medţiagų pateiktas 28 paveiksle, kuriame matyti, kad molekulinės masės ribos yra nuo ~100 iki ~1000, tačiau daugiausia junginių, kurių molekulinė masė yra 250-400 ribose.

30 pav. Daugiau nei 80% eančių prekyboje veikliųjų medžiagų molekulinė masė yra žemesnės nei 450.

Molekulių fragmentų nuspėjimas, atsiţvelgiant į įvairias veikliųjų medţiagų struktūras, yra apskaičiuojamas lygtimi, įvertinant fragmentų struktūras, kurios yra ieškomoje struktūroje:

Fragmentų sąrašas sukurtas išanalizavus 3300 prekyboje esančių veikliųjų medţiagų bei 15.000 Fluka cheminių reagentų kataloge esančių junginių struktūros fragmentus.

Junginio, kaip potencialaus „vaisto” vertė yra apskaičiuojama lygtimi, kuri sujungia, bendrą „vaistų” atitikmens rezultatą, molekulių fragmentų nuspėjimą, cLogP, logS, molekulinę masę bei toksiškumo rizikos įvertinimą:

ds- junginio, kaip „vaisto“ vertė, si- kontribucija, apskaičiuojama iš cLogP, logS molekulinės

masės, „vaistų“ atitikmens rezultato reikšmių. Antros lygties parametrai a ir b yra intervalai cLogP (1, -5), logS (1, 5), molekulinė masė (0.012, -6) ir „vaistų“ atitikmens rezultatas (1, 0). ti

yra kontribucija 4 rizikos tipų: 1.0, 0.8, ir 0.6 - maţa rizika, vidutinė rizika, didelė rizika.

Apskaičiuoti biologiniai parametrai cLogP, logS, molekulinės masės, molekulių fragmentų įvertinimas, „vaistų“ atitikmens rezultatų parametrai, naujų sintezuotų spiro junginių, pateikiami 7 lentelėje:

7 lentelė: sintezuotų spiro junginių apskaičiuoti bioliginiai parametrai. Struktūra cLogP Tirpumas

logS Molekulinė masė Molekulių fragmentų įvertinimas „Vaistų“ atitikmens rezultatas N H S N O N N N O 0.29 -5.26 287 5.9 0.69 N H N H N N O N N N NH₂ -0.08 -4.18 270 5.57 0.82

7 lentelės tęsinys N S NO₂ N H S N O O 2.88 -5.43 398 5.71 0.39 N S NO₂ N H N H N N O NH₂ 2.5 -4.35 381 5.5 0.48 N S N SH N H S N O O 2.12 -5.35 336 3.99 0.64 N S N SH N H N H N N O NH₂ 1.74 -4.27 319 3.78 0.77 N S S O N H S N O O 0.13 -3.71 351 5.58 0.82 N S S O N H N H N N O NH₂ -0.24 -2.63 334 5.82 0.9 N S N H S N O O NO₂ 1.5 -4.19 348 6.01 0.8 N S N H N H N N O NH₂ NO₂ 1.12 -3.11 331 5.8 0.89

7 lentelės tęsinys N H S N O O NH Cl Cl Cl 4.0 -5.8 414 4.88 0.18 N H N H N N O NH₂ NH Cl Cl Cl 3.63 -4.72 397 4.31 0.22

Kaip matyti iš duomenų, kurie pateikti lentelėje sintezuotų spiro junginių cLogP reikšmė visiems junginiams yra maţiau uţ 5 ir svyruoja nuo -0.24 ( ST-8) iki 4.00 (ST-11) šie parametrai leidţia manyti, kad naujų spiro junginių hidrofiliškumas pasireikš didele absorbcija ir praeinamumu.

Tirpumo parametrų logS reikšmės sintezuotiems sipro junginiams daugeliu atveju didesnės uţ -4. Tik spiro junginiai ST-7, ST-8, ST-10 atitinka kriterijų, kad logS reikšmė yra didesnė uţ -4, o tai prognozuoja gerą tirpumą, absorbciją bei pasiskirstymą.

Sintezuotų spiro junginių molekulinės masės, kurios pateiktos 7 lentelėje, atitinka apskaičiuotų biologinių parametrų reikšmes ir yra <450, kurios svyruoja nuo 270 (ST-2) iki 414 (ST-11) tai leidţia manyti, kad naujų spiro junginių maţa molekulinė masė lems gerą tirpumą, absorbciją bei praeinamumą.

„OSIRIS Property Explorer“ programos biologinių parametrų apskaičiuoti duomenys, įvertinant struktūrą rodo, kad molekulių fragmentų įvertinimas visų sintezuotų spiro junginių svyruoja nuo 3.78 (ST-6) iki 6.01 (ST-10), tačiau daugeliu atveju ši reikšmė yra apie ~ 5. Šie duomenys, įvertinant struktūrą, prognozuoja, kad heterocikliniai bei aromatiniai fragmentai esantys spiro junginių struktūroje turi įtakos potencialiam biologiniui aktyvumui.

„Vaistų“ atitikmens rezultatas biologinių parametrų apskaičiuoti duomenys įvertinant struktūrą rodo, kad ţemiausios vertės yra junginių ST-11 (0.18) ir ST-12 (0.22), o aukščiausios reikšmės yra junginių ST-2 ( 0.82), ST-7 (0.82), ST-8 (0.9), ST-9 (0.8) ir ST-10 (0.89), tuo remiantis tikimasi iš spiro junginių, kurių „vaistų“ atitikmens rezultatas > 0.8, potencialaus biologinio aktyvumo.

„OSIRIS Property Explorer“ programos biologinių parametrų apskaičiuoti duomenys, įvertinant struktūrą rodo, kad aktyviausi junginiai turėtų butų ST-2, ST-7, ST-8, ST-9, ST-10.

2.3. Sintezuotų junginių priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas

2.3.1. „Užnuodytos lėkštelis metodas“

Priešgrybelinio aktyvumo tyrimams buvo pasirinktas ekspreso metodas junginių pirminiam biologinio aktyvumo įvertinimui. Aktyvumo nustatymui panaudotas „užnuodytos lėkštelės metodas[47]“ (ang. poison plate technique). Akcentuotina, kad metodas tinkamas pelėsiniams grybams. Metodo principą sudaro tiriamojo junginio tam tikros koncentracijos (daţniausiai 500ppm, 1000ppm) paruošimas mitybinėje terpėje. Apvalios (disko) formos grybo kultūros uţnešimas aseptiškai į Petri lėkštelę ant mitybinės terpės su ištirpinta tam tikros koncentracijos tiriamąja medţiaga. Šioje terpėje grybo auginimas vyksta savaitę laiko ir matuojamas tam tikrais laiko tarpais (24 intervalu) pelėsinio grybo išsiplėtimo diametras.

Nors Cadinda albicans bei Candida glabrata nėra pelėsiniai grybeliai, tačiau nuspręsta spiro junginių biologinį aktyvumą tikrinti uţnuodytų lėkštelių metodu, stebint šio grybelio augimą vizualiai.

2.3.2. Tyrimams naudotos grybų kultūros

- Microsporum canis – dermatofitas. - Penicillium spp - pelėsinis grybelis.

- Aspergillus fumigatus – pelėsinis grybelis. - Scedosporium apiospermum - pelėsinis grybelis. - Candida albicans, C. glabrata – mielinis grybelis.

2.3.3. Tyrimams naudota terpė bei jos paruošimas

Tyrimams buvo naudota komercinė, darbui paruošta „Phytone“ mielių ekstrakto terpė (BBLTM

Phytone Yeast Extract Agar), kurios sudėtis (apytikslus kiekis viename litre paruoštos terpės): - Sojos lizato 10.0 g - Mielių ekstrakto 5.0 g - Dekstrozės 40.0 g - Streptomicino 0.03 g - Chloramfenikolio 0.05 g - Agaro 17.0 g

Vienam litrui mitybinės terpės sunaudota 72g “Phytone” mielių ekstrakto agaro. Maišant uţvirinama ir virinama keletą minučių, kol visiškai ištirpsta. Autoklavuojama, esant 121°C 15 minučių.

2.3.4. Tiriamųjų junginių 1000 ppm koncentracijų paruošimas

Mikroanalitinėmis svarstyklėmis pasveriama 125mg tiriamosios medţiagos. Ji ištirpinama 2ml acetono ir 2ml DMSO mišinyje, kuris supilamas į 121ml švieţiai sterilizuotą mitybinę terpę. Gaunama 1000ppm koncentracija, o 125ml gautos mitybinės terpės su tiriamąja medţiaga išpilstoma po ~25ml į penkias Petri lėkšteles.

2.3.5. Terpės su tirpikliais paruošimas

2ml acetono ir 2ml DMSO mišinys supilamas į 121ml švieţiai sterilizuotą mitybinę terpę. 125ml gautos mitybinės terpės su tirpiklio mišiniu išpilstoma po ~25ml į penkias Petri lėkšteles, kurios naudojamos palyginimui.

2.3.6. Standarto (amfotericino B) 1000 ppm koncentracijų paruošimas

Mikroanalitinėmis svarstyklėmis pasveriama 125mg, kaip standarto naudojamo amfotericino B. Jis ištirpinamas 2ml acetono ir 2ml DMSO mišinyje, kuris supilamas į 121ml

švieţiai sterilizuotos mitybinės terpės. Gaunama 1000ppm koncentracija, o 125 ml gautos mitybinės terpės su tiriamąja medţiaga išpilstoma po ~25 ml į penkias Petri lėkšteles.

2.3.7. Grybelio užsėjimo procedūra

Į paruoštas Petri lėkšteles su 1000 ppm tiriamojo junginio koncentracija buvo uţnešama aseptiškai apvalios (disko) formos 5 mm skersmens Microsporum canis, Penicillium spp, Aspergillus fumigatus, Scedosporium apiospermum, o Candida albicans, C. glabrata grybelis buvo uţneštas ant mitybinės terpės su kilpele. Petri lėkštelės savaitę inkubuojamos, esant 25°C. Grybų diskų augimas stebimas vizualiai, bei matuojant grybelių Microsporum canis, Penicillium spp, Aspergillus fumigatus, Scedosporium apiospermum išsiplėtimo diametrą.

2.3.8. Priešgrybelinių rezultatų įvertinimas

24 valandų intervalu stebėti ir 168 valandas auginti grybeliai Microsporum canis, Penicillium spp, Aspergillus fumigatus, Scedosporium apiospermum, matuojant trijų kolonijų diametro vidurkį, kuris pateiktas lentelėse. Paţymėtina, kad Microsporum canis ir Scedosporium apiospermum auga gana lėtai, todėl šių grybelių išsiplėtimo diametras yra maţesnis.

2.3.9. Spiro junginių aktyvumo įvertinimas

Po 24 valandų atlikti pirmieji matavimai. Microsporum canis, Penicillium spp, Aspergillus fumigatus, Scedosporium apiospermum grybelių augimo poţymiai stebimi po 24 valandų, tuo tarpu Candida albicans, C. glabrata grybeliai jau buvo uţaugę. Vizualiai buvo galima stebėti, kad lėkštelėse su spiro junginiais ST-9 ir ST-10 augimas buvo maţesnis nei kitose lėkštelėse su tirtais spiro junginiais. Pastebėtas ST-9 aktyvesnis prieš Candida albicans (29 pav.), o spiro junginio ST-10 aktyvumas vienodas prieš abu Candida albicans, C. glabrata grybelius (30 pav.):

31 pav. C. albicans (viršuje), C. glabrata grybeliai auginti 24 valandas su tiriamuoju junginiu ST-9.

32 pav. C. albicans (viršuje), C. glabrata grybeliai auginti 24 valandas su tiriamuoju junginiu ST-10

Po 48 valandų vizualiai stebimas išlikęs spiro junginio ST-9 aktyvumas prieš Candida albicans (31 pav.), tačiau prieš Candida glabrata grybelį junginys ST-9 pasirodė esąs neaktyvus(32):

33 pav. C. albicans (viršuje), C. glabrata grybeliai lėkštelėje auginti 48 valandas su tiriamuoju junginiu ST-9.

34 pav. C. albicans (viršuje), C. glabrata grybeliai lėkštelėje auginti 48 valandas su tiriamuoju junginiu ST-10.

Dideliu priešgrybeliniu aktyvumu prieš dermatofitą Microsporum canis, pelėsinius grybelius Penicillium spp, Aspergillus fumigatus, Scedosporium apiospermum pasiţymėjo naujai sintezuoti spiro junginiai ST-9 bei ST-10: