Ozonuoto kanapių

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Gabrielė Slavinskienė

Ozonuoto kanapių aliejaus kaip potencialios priešgrybinės

priemonės tyrimas in vitro

In vitro assay of ozonated hemp oil as potential antifungal

agent

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

Darbo vadovė: dr. Marija Ivaškienė

2 DARBAS ATLIKTAS DR. L. KRIAUČELIŪNO SMULKIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Ozonuoto kanapių aliejaus kaip potencialios priešgrybinės priemonės tyrimas in vitro“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS DR. L. KRIAUČELIŪNO SMULKIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE

(aprobacijos data) (klinikos vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.1.1. Mikroskopiniai grybai ir jų paplitimas aplinkoje ... 9

1.1.2. Dermatofitijos patogenezė ir klinikiniai simptomai ... 10

1.1.3. Dermatofitų jautrumo priešgrybinėms medžiagoms nustatymo metodai ... 12

1.2. Dermatofitijos konservatyvios gydymo priemonės ... 13

1.2.1. Pagrindinių priešgrybinių vaistų veikimo mechanizmai ... 13

1.2.2. Konservatyvių dermatofitijos gydymo priemonių trūkumai ... 13

1.3. Dermatofitijos alternatyvios gydymo priemonės ... 14

1.3.1. Eteriniai aliejai ... 15

1.3.2. Alavijo gelis ... 16

1.3.3. Ozonas ... 16

1.4. Kanapių aliejus ... 19

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 21

3. TYRIMO REZULTATAI ... 24

3.1. Ozonuoto kanapių aliejaus poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum canis nustatymas difuzijos į agarą (įdubų) metodu ... 24

3.2. Ozonuoto kanapių aliejaus poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum canis nustatymas diskų difuzijos metodu ... 25

3.3. Vaistinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum canis nustatymas ir palyginimas su ozonuotu kanapių aliejumi ... 27

3.4. Alternatyvių priešgrybinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum canis nustatymas ir palyginimas su ozonuotu kanapių aliejumi ... 31

3.5. Ozonuoto kanapių aliejaus savybių nustatymas ... 32

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 33

IŠVADOS ... 35

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 36 PRIEDAI ... Error! Bookmark not defined.

4 OZONUOTO KANAPIŲ ALIEJAUS KAIP POTENCIALIOS PRIEŠGRYBINĖS PRIEMONĖS

TYRIMAS IN VITRO Gabrielė Slavinskienė Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Didėja naujų priešgrybinių preparatų ir alternatyvų jiems poreikis. Ozonuoti aliejai galėtų būti vienas iš problemos sprendimo būdų, tačiau trūksta mokslinių tyrimų šioje srityje. Šio darbo tikslas nustatyti ozonuoto kanapių aliejaus poveikį mikroskopiniam grybui Microsporum canis in vitro. Šiam tikslui įvykdyti buvo atliktas tyrimas su 6 Microsporum canis padermėmis, tyrimas atliktas diskų difuzijos metodu, naudotos 8 priešgrybinės medžiagos (4 vaistinės, 3 alternatyviosios ir ozonuotas kanapių aliejus) bei kontrolinis kanapių aliejus. Nustatyta, kad ozonuotas kanapių aliejus sudarė 22,19 ±3,3 mm slopinimo zoną. Ši zona buvo didesnė nei kitų atlernatyvių priešgrybinių medžiagų. Taip pat nustatyta, kad tik 3 iš 4 vaistinių medžiagų pasižymėjo stipresnėmis slopinamosiomis savybėmis nei ozonuotas kanapių aliejus. Papildomai buvo atliktas bandymas su ozonuotu kanapių aliejumi difuzijos į agarą (įdubų) metodu. Jo metu nustatyta, kad ozonuotas kanapių aliejus sudarė didesnę nei 100 mm slopinimo zoną.

Naudojant pH metrą nustatyta, kad po ozonavimo stipriai sumažėja pH reikšmė ir galutinis ozonavimo produktas pasižymi rūgštinėmis savybėmis (pH 3,29-3,89). Taip pat nustatyta, kad ozono koncentracija per 3 mėnesius, laikant ozonuotą kanapių aliejų šaldytuve kinta minimaliai (2,2 ±0,4 proc.). Padaryta išvada, kad ozonuotas kanapių aliejus galėtų būti naudojamas kaip priešgrybinė priemonė gyvūnų mikrosporijai gydyti. Jo Microsporum canis slopinimo stiprumas artimas vaistiniams preparatams, pH reikšmė nepalanki dermatofitams augti, o laikant šaldytuve ozono koncentracija išlieka stabili visą gydymo laikotarpį.

5

IN VITRO ASSAY OF OZONATED HEMP OIL AS POTENTIAL ANTIFUNGAL

AGENT

Gabrielė Slavinskienė Master‘s Thesis

SUMMARY

There is a growing need for new antifungal drugs or alternatives. Ozonated oils could be a problem solution, but there is still a lack of scientific research in this field. The aim of the present assay was to determine the effect of ozonated hemp oil to microscopic fungi Microsporum canis in

vitro. To achieve this aim 6 Microsporum canis strains were used in the assay by using disk

diffusion method and 8 antifungals (4 commercial drugs, 3 alternatives and ozonated hemp oil) and a hemp oil as a control. Inhibition zone of ozonated hemp oil was 22.19 ±3.3 mm. It was the largest inhibition zone of all alternative antifungals. It was also found that only 3 out of 4 antifungal drugs had stronger inhibition effect to Microsporum canis than ozonated hemp oil. Agar well-diffusion method with ozonated hemp oil was done in addition. The study found that ozonated hemp oil inhibited more than 100 mm zone in diameter.

Using pH meter was concluded that after ozonation pH value dropped strongly and the final ozonation product had acidic properties (pH 3.29-3.89). It was also established that in 3 months period, holding ozonated hemp oil in the refrigerator ozone concentration change was small (2.2 ±0.4 %). In conclusion, ozonated hemp oil could be used as antifungal agent for microsporidia treatment. Its Microsporum canis inhibition zone is similar to drugs, pH value is aggressive for dermatophytes and while kept in refrigerator it remains almost stable entire treatment time. Keywords: ozone, hemp oil, dermatophytosis, Microsporum canis

6

SANTRUMPOS

ALP – šarminė fosfatazė

ALT – alanino aminotransferazė AST – asparagino aminotransferazė α-SMA – alfa lygiųjų raumenų aktinas IL-1β – interleukinas 1 beta

IL8 – interleukinas 8

KSV – kolonijas sudarantys vienetai log – logaritmas

mRNR – matracinė ribonukleino rūgštis

per os – vartojama per burną

PGR – polimerazinė grandininė reakcija ppm – dalelės milijone dalelių

spp. – rūšys

TGF-β1 – transformuojantis augimo faktorius beta 1 TNFα – auglių nekrozės faktorius alfa

UV – ultravioletiniai spinduliai V – voltas, matavimo vienetas

7

ĮVADAS

Dermatofitai tai mikroskopiniai grybai, sukeliantys odos sluoksnių ir jos darinių infekcijas. Organizmui į juos reaguojant, susidaro matomi odos pažeidimai: alopecija, eritema, papulės, odos lupimasis, šašai, aiškiai ribotos žaizdos su uždegimu periferijoje [1]. Microsporum canis yra dažniausiai išskiriamas dermatofitas iš odos žaizdų turinčių šunų ir kačių [2,3]. Jis taip pat yra dažniausiai išskiriamas dermatofitas iš sveikų šunų ir kačių [4]. M. canis yra zoonotinis dermatofitas, kuriuo užsikrečia ir žmonės. Ši infekcija ypač perduodama vaikams per kates [5].

Veterinarinėje medicinoje gydant dermatomikozes dažniausiai naudojami priešgrybiniai vaistai yra azolai (enilkonazolis, klotrimazolas, ketokonazolas, mikonazolas), grizeofulvinas, piroktono olaminas ir terbinafino hidrochloridas. Šie vaistai sukelia platų spektrą šalutinių poveikių: diarėją, pykinimą, vėmimą, galvos skausmą ir svaigimą, skrandžio skausmus, kepenų ir inkstų pažeidimus, ginekomastijos atsiradimą, kontaktinę alergiją, egzantemą [6-8]. Nors per pastarąjį dešimtmetį atsirado mažiau toksiškų vaistų, padažnėjęs jų naudojimas (terapiniais ir profilaktikos tikslais), sukėlė padidėjusį dermatofitų atsparumą šiems vaistams. Atsparumas visiems plačiai naudojamiems priešgrybiniams vaistams buvo aprašytas tiek laboratorinėmis sąlygomis tiek ir klinikiniuose atvejuose [9,10]. Taigi dabartiniai vaistai turi daug trūkumų. Reikalinga saugesnė, patvaresnė alternatyva.

Kaip natūralesnės, saugesnės alternatyvos galėtų būti eteriniai aliejai ar alavijo gelis (Aloe

vera). Aloe vera pasižymi antibakteriniu poveikių [11] ir silpnu priešgrybiniu veikimu [12]. Iš

eterinių aliejų fungicidinėmis savybėmis pasižymi: eukalipto, anyžių, gvazdikėlių, bergamočių, pelargonijų, sibirinio kėnio, citrinų ir arbatmedžio eteriniai aliejai [13]. Daugelio eterinių aliejų sudėtyje yra fenolių. Nustatyta, kad katės negali tinkamai apdoroti fenolių ir didesni jų kiekiai gali būti toksiški [14]. Katėms galėtų būti saugus pelargonijų eterinis aliejus, kuris pasižymi priešgrybinėmis savybėmis, tačiau savo sudėtyje turi labai mažai fenolių [15].

Kita galima gydymo alternatyva – ozonas. Jau keletą dešimtmečių mokslininkai intensyviai tyrinėja ozono poveikį mikroorganizmams. Jis turi aukštą oksidacinį potencialą – 2,076 V [16], lyginant su chloru – 1,36 V ir deguonimi – 1,23 V [17]. Ozonuotas aliejus yra efektyvi antibakterinė priemonė. Pavyzdžiui, ozonuotam aliejui jautrios Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Micrococcus luteus ir Staphylococcus aureus bakterijos [18]. Nustatyta, kad ozonuotas aliejus

antimikrobiškai veikia efektyviau nei chlorheksidino digliukonatas ar povidono jodas [19]. Pastebėtas ir ozonuoto aliejaus poveikis dermatofitams. Naudojant 0,5 μg/ml koncentracijos ozonuotą aliejų, dermatofitų sporų gamyba sumažėjo 97,05 – 98,71 proc. [20]. Taip pat įrodyta, kad jį saugu naudoti išoriškai [21-24]. Rinkoje esantys komerciniai ozonuoti aliejai skiriasi naudojamu

8 aliejumi ir ozono koncentracija, todėl svarbu ištirti Lietuvoje gaminamą ozonuotą kanapių aliejų, nustatyti jo poveikį pagrindiniam gyvūnų patogeniniam dermatofitui M. canis, palyginti jo poveikį su įprastais Lietuvos rinkoje esančiais priešgrybiniais vaistais ir kitomis alternatyvomis (alavijo geliu, eteriniais aliejais). Tokie tyrimai ir palyginamoji analizė Lietuvoje dar nebuvo daryti.

DARBO TIKSLAS: nustatyti ozonuoto kanapių aliejaus poveikį mikroskopiniam grybui

Microsporum canis in vitro.

DARBO UŽDAVINIAI:

1. Nustatyti ozonuoto kanapių aliejaus poveikį dermatofitui Microsporum canis difuzijos į agarą metodu;

2. Nustatyti ozonuoto kanapių aliejaus poveikį dermatofitui Microsporum canis diskų difuzijos metodu;

3. Palyginti ozonuoto kanapių aliejaus poveikį dermatofitui Microsporum canis su vaistiniais priešgrybiniais preparatais;

4. Palyginti ozonuoto kanapių aliejaus poveikį dermatofitui Microsporum canis su alternatyviomis priešgrybinėmis medžiagomis;

5. Išnagrinėti galimybes ozonuotą kanapių aliejų panaudoti kaip priešgrybinę priemonę mikrosporijai gydyti.

9

1. LITERATŪROS ANALIZĖ

1.1. Mikroskopiniai grybai

1.1.1. Mikroskopiniai grybai ir jų paplitimas aplinkoje

Mikroskopiniai grybai – tai heterotrofiniai eukariotiniai mikroorganizmai, kurių ląstelės nesidiferencijuoja. Jiems priklauso daugialąsčiai filamentiniai pelėsiniai grybai, kurie dar skirstomi į dermatofitus ir ne-dermatofitus. Pastariesiems priskiriami Aspergillus spp., Penicillium spp.,

Alternaria spp., Fusarium spp. ir kiti. Nors jie dažniausiai sukelia maisto produktų ir pašarų ydas,

tačiau gali sukelti ir sveikatos sutrikimus. Pavyzdžiui gyvūnams gali pasireikšti nosies ertmės ir sinusų aspergiliozė (pūlingos išskyros su krauju, čiaudulys) [25]. Kai kurie iš jų gamina antrinius metabolitus, vadinamus mikotoksinais. Įvairūs mikotoksinai gali veikti neurotoksiškai, hepatotoksiškai, nefrotoksiškai, imunosupresiškai, gali sukelti reprodukcijos sutrikimus bei turėti letalinį poveikį [26]. Literatūroje aprašytas atvejis, kuriame nugaišo 60 iš 65 šunų apsinuodijusių

Aspergillus spp. mikotoksinais (aflatoksinais) užkrėstu pašaru. Jiems pasireiškė anoreksija,

hematemezė, melena, kraujavimas iš akių ir ausų [27].

Dermatofitai – mikroskopiniai grybai, galintys sukelti zoonozinę paviršinių odos sluoksnių ir odos darinių infekciją, kuri vadinama dermatofitija. Dermatofitams priklauso trys gentys –

Microsporum, Trichophyton ir Epidermophyton. Smulkiųjų gyvūnų dermatofitija labiausiai

paplitusi šiltesnio klimato valstybėse (Brazilijoje, Čilėje, Italijoje). Vidutinių platumų klimato juostos šalyse kačių sergamumas dermatofitija sudaro 1,3-3,6 proc. visų odos ligų [5]. Programos „Pagauk-Sterilizuok-Paleisk“ metu Italijoje nustatyti 5,5 proc. teigiamų beglobių kačių atvejų dermatofitų atžvilgiu [3]. Analogiškos programos metu Portugalijoje nustatyti 29,4 proc. teigiamų dermatofitų atvejų tarp beglobių kačių [28]. M. canis yra dažniausiai išskiriamas dermatofitas iš odos žaizdų turinčių šunų ir kačių [2, 3]. Jis taip pat yra dažniausiai išskiriamas dermatofitas iš sveikų šunų ir kačių [4]. M. canis išskiriamas ir iš kitų rūšių žinduolių odos mėginių. Atlikus tyrimus Nigerijoje M. canis buvo rastas ožkų, karvių, kiaulių, arklių, triušių odos mėginiuose [29]. Graužikams ir paukščiams M. canis yra mažiau aktualus. Graužikai dažniausiai serga Trichophyton

mentagrophytes sukelta dermatofitija [30], o paukščiai – Trichophyton gallinae, T. rubrum ir T. megnini [31]. Taip pat nustatyti iguanos [32] bei primato siamango [33] užsikrėtimo M. canis

atvejai.

M. canis yra zoonotinis dermatofitas, kuriuo užsikrečia ir žmonės. Ši infekcija ypač

10 užsikrėtimų vyko per kontaktą su augintiniais ir tik 8,7 proc. dėl kontakto su kitais užsikrėtusiais vaikais [34]. Dauguma sukėlėją perdavusių gyvūnų būna asimptomiai [34, 35], todėl išvengti užsikrėtimo itin sudėtinga.

Lietuvoje atlikto tyrimo metu, nustatyta, kad dažniausias žmonių dermatofitozių sukėlėjas yra

Trichophyton rubrum. Jis sukėlė 99 proc. nagų grybelio atvejų. Antroje vietoje M. canis, kuris buvo

dažniausias kūno ir galvos dermatofitozių sukėlėjas [36]. Kai kuriuose Europos regionuose stebimas

M. canis sukeliamų galvos infekcijų padažnėjimas [37, 38]. Taip pat ir Kinijoje pranešama, kad M. canis nuo 1990 iki 2014 laipsniškai plito ir tapo vienu iš vyraujančiu Kinijos žmonių dermatofitijos

sukėlėjų [39].

1.1.2. Dermatofitijos patogenezė ir klinikiniai simptomai

M. canis priskiriamas keratinofiliniams mikroskopiniams grybams. Infekcijos metu kietas

keratininis audinys suskaidomas į trumpus peptidus ir aminorūgštis – junginius, kuriuos dermatofitai lengvai pasisavina [40]. Mitybiniams poreikiams jie naudoja odoje esančius azotą, anglį ir sierą [41]. Keratinofilinių mikroskopinių grybų proteolitiniai fermentai hidrolizuoja daugumą tirpių (kazeiną, želatiną, kraujo serumo albuminus, kiaušinio albuminą, hemoglobiną, mioglobiną) ir netirpių baltymų (keratiną, elastiną, kolageną, fibriną, fibronektiną) [40]. In vitro atlikti tyrimai taip pat parodė, kad M. canis geba išskirti keratinazę, lipazę, elastazę ir deoksiribonukleazę [42]. Šie fermentai padeda atskirti skirtingo virulentiškumo kamienus. Nustatyta, kad M. canis kamienai išskirti iš kačių su simptomais, gamino statistiškai reikšmingai daugiau keratinazės ir elastazės, lyginant su kamienais išskirtais iš asimptomių kačių [43]. Tyrimais su triušiais nustatyta, kad didžiausią įtaką odos žaizdų atsiradimui turėjo M. canis išskirta lipazė ir keratinazė [44].

Naudojant „dot-blot“ hibridizaciją ir realaus laiko PGR, nustatyta, kad didesnis kiekis M.

canis genų porų susidarė terpėje su vaiko skalpo oda nei su suaugusio žmogaus skalpo odą, o

mažiausiai terpėje su beplauke oda. Gauti rezultatai paaiškinami dvejais mechanizmais. Pirma, vaikų galvos odos riebalų liaukos būna dar pilnai neišsivysčiusios. Jos gamina nepakankamą kiekį fungistatinių riebalų rūgščių, todėl negali slopinti M. canis infekcijos. Antra, plaukuotoje galvos odoje raginis sluoksnis užimą mažesnę dalį nei kitose kūno dalyse, todėl M. canis išskiriama keratinazė daug lengviau kolonizuoja plaukuotą odą [45].

Plaukai pažeidžiami tik aktyvioje augimo (anageno) fazėje. Dermatofito hifas prasiskverbia į plauko folikulo angą, pakelia plauko kutikulę, vyksta žievės erozija, toliau vystosi įsiskverbimo organai, kurie kolonizuoja plauko šerdį. Tik dermatofitai gali taip skverbtis į plauką. Kai plaukas pereina į ramybės (telogeno) fazę, keratino gamyba lėtėja ir sustoja, todėl nustoja augti ir

11 mikroskopinis grybas. Tokie plaukai nuslenka kartu su dermatofitu [46]. Dermatofitų poveikis sukelia stresą organizmui. Nustatyta, kad dermatofito pažeistuose plaukuose yra didesnis kortizolio kiekis nei sveikuose [47].

Infekcijos metu dermatofitai tiesiogiai pažeidžia odą tik minimaliai; daugelis patologijų kyla dėl organizmo reakcijos į patogeną [48]. Pirmosios epidermio ląstelės susiduriančios su dermatofitais infekcijos metu yra keratinocitai, kurie veikiami šių mikroskopinių grybų gali išskirti platų spektrą citokinų, IL-8 ir uždegiminių TNFα chemoatraktantų [49]. Naudojant M. canis gyvybingas artrokonidijas, stimuliuoti kačių polimorfonukleariniai neutrofilai išskyrė didesnį kiekį uždegiminių citokinų: TNFα, IL-1β ir IL-8 [50]. Uždegiminės reakcijos metu pažeidžiamas epidermio barjeras, sustiprėja epidermio proliferacija bei padidėja keratinocitų antimikrobinių peptidų (pvz. defensinų) ekspresija [51]. Pagrindiniai dermatofitų sukeliamų infekcijų požymiai (niežulis, deginimas, bendras odos dirglumas) yra stipriai susiję su organizmo uždegimine reakcija į mikroskopinį grybą [48, 52]. Įprasti uždegiminės reakcijos požymiai infekcijos metu: eritema, patinimas, deginimas ir alopecija (plaukų netekimas) [54]. Niežulys yra dominuojantis dermatomikozinių infekcijų simptomas. Ūminis niežulys gali pereiti į lėtinę eigą, kuri gali progresuoti skausmu, jei nuolatinis kasymasis veda link maceracijos ir antrinės infekcijos išsivystymo. Kasymasis dėl niežulio pagreitina audinių yrimą ir infekcijos plitimą, taip atitolindamas gyjimo procesą ir tikėtina prisideda prie bakterinių superinfekcijų [52]. Dermatofitinių infekcijų metu taip pat išskiriami toksinai. Tai didina mikroskopinių grybų patogeniškumą ir audinių pažeidimą [55]. Taigi organizmo reakcija į dermatofitus sukelia matomus odos pažeidimus: alopeciją, eritemą, papules, odos lupimasį, šašus, žaizdos aiškiai ribotos su uždegimu periferijoje (1 pav. a ir b) [1].

1 pav. a - tipinis Trichophyton mentagrophytes sukeltų snukio odos žaizdų vaizdas; b - Trichophyton erinacei sukeltas sunkus folikulitas ir furunkuliozė šuniui; c – Microsporum canis

sukeltas granulomatozinis dermatitas ir panikulitas (dermatofitinė pseudomicetoma) [1]

Rečiau pasitaikantys simptomai ir komplikacijos. Viena iš retai pasitaikančių komplikacijų yra favus. Manoma, kad tai hiperjautrumo reakcija į dermatofitus. Ji pasireiškia geltonos plutos

12 susidarymu aplink plaukų folikulus [56]. Plaukai iškrenta ir nebeatauga, lieka randinė alopecija [57]. Kerionas – pūliuojanti ir skausminga mazgelinė dermatofitozė, susijusi su pūlingu drenažu, giliomis pūlingomis uždegiminėmis žaizdomis ir regionine limfadenopatija [1, 56]. Pseudomicetoma – dermatofitų sukelta (dažniausiai M. canis) paodžio ir tikrosios odos infekcija (1 pav. c). Ji pasireiškia vieno ar kelių kietų iškilusių gumbelių atsiradimu. Jie gerai apriboti, mobilūs ir liečiant neskausmingi. Predispoziciją turi persų veislės katės [58-60]. Taip pat aprašytas išskirtinis katės užsikrėtimo M. canis atvejis, kuris pasireiškė rinitu ir stomatitu, be jokių odos pažeidimų. Požymiai: sumažėjusi oro srovė pro abi katės šnerves, halitozė, stertoras, kairiojo submandibuliarinio limfmazgio hiperplazija, 3 cm opinė masė kietajame gomuryje. Nazofaringoskopijos metu buvo matyti iš abiejų choanų kyšanti geltona plokštelių pavidalo masė. Rinoskopijos metu nustatyta, kad nosies gleivinę bilateraliai dengė daugybinės geltonos plokštelės [61].

1.1.3. Dermatofitų jautrumo priešgrybinėms medžiagoms nustatymo metodai

CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute, JAV), EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) ir BSAC (British Society for Antimicrobial Chemotherapy) nėra pateikę standartizuotų priešgrybinio jautrumo testų metodų dermatofitams [62]. Moksliniuose straipsniuose [63-68] šiam tikslui dažniausiai naudojami diskų difuzijos, difuzijos į agarą (įdubų) ir daugybinio praskiedimo metodai (2 pav.). Atliekant tyrimus su vaistinėmis medžiagomis, dažniausiai pasirenkamas diskų difuzijos metodas [64, 66-68]. Atliekant tyrimus su silpnesnėmis priešgrybinėmis medžiagomis (eteriniais aliejais, natūraliais augalų ekstraktais) pasirenkamas difuzijos į agarą metodas [63, 65]. M. canis inkubuojamas 28-30 o

C temperatūroje [64, 66-68]. Dažniausiai naudojamas Sabūro dekstrozės agaras bei Bulvių dekstrozės agaras [62, 64, 66-68].

2 pav. a – diskų difuzijos metodas, autorės nuotrauka; b – difuzijos į agarą (įdubų) metodas, autorės piešinys; c – daugybinių praskiedimų metodas [69]

13

1.2. Dermatofitijos konservatyvios gydymo priemonės

Veterinarinėje medicinoje gydant dermatomikozes dažniausiai naudojami priešgrybiniai vaistai yra azolai (enilkonazolas, klotrimazolas, ketokonazolas, flukonazolas, vorikonazolas, mikonazolas), grizeofulvinas, piroktono olaminas ir terbinafino hidrochloridas. Jie naudojami oraliai arba išoriškai. Pastarieji vaistai (įvairūs kremai, geliai, odos purškalai, odos tirpalai) efektyviausi yra pradinėje dermatofitozės stadijoje, o oraliai naudojami vaistai efektyvūs gydant lėtines, užsitęsusias dermafitozes arba kai išoriškai naudojami vaistai yra neefektyvūs [70]. Lietuvos veterinarinių vaistų registre registruoti šie vaistiniai preparatai nuo mikroskopinių grybų: Imaverol 100 mg/ml odos tirpalas (enilkonazolas), Fungiderm 5 mg/ml odos tirpalas (klotrimazolas), Canizol vet 200 ir 400 mg tabletės (ketokonazolas), Osurnia gelis (terbinafino hidrochloridas), Malaseb šampūnas (mikonazolas), Biopirox odos purškalas (piroktono olaminas).

1.2.1. Pagrindinių priešgrybinių vaistų veikimo mechanizmai

Imidazolai ir triazolai yra dvi pagrindinės, chemiškai susijusios grupės, priklausančios azolams. Triazolai nuo imidazolų skiriasi tuo, kad turi tris azoto atomus azolo žiede, o imidazolai – du. Azolai blokuoja lanosterolio14-α-demetilazę. Tai ergosterolio biosintezei reikalingas fermentas. Ergosterolis yra pirminis sterolio derivatas, kuris yra pagrindinis mikroskopinių grybų ląstelių membranos komponentas. Mažėjant ergosterolio kiekiui ląstelių membranose ir didėjant 14-α-demetilazės akumuliacijai ląstelėje, membrana darosi pralaidesnė, slopinamas ląstelių augimas ir galiausiai jos žūsta [71]. Klotrimazolas, mikonazolas, enilkonazolas ir ketokonazolas priklauso imadazolo derivatų grupei.

Alilaminai kaip ir azolai trikdo ergosterolio sintezę, tačiau jie veikia inaktyvuodami skvaleno epoksidazę, kuri yra lanosterolio pirmtakas. Mikrsokopinio grybo ląstelėje padidėja skvaleno kaupimasis, o tai sutrikdo ląstelių veiklą, jų membranos tampa pralaidesnės ir grybo ląstelės žūsta. Svarbiausi šios grupės vaistai yra terbinafinas ir naftifinas [71]

Piroktono olaminas priklauso hidroksipiridonų priešgrybinių vaistų grupei. Tai silpnos rūgštys, pasižyminčios plataus spektro antimikrobiniu veikimu. Šios medžiagos sudaro chelatus su trivalenčiais metalų katijonais, taip slopindamos nuo metalų priklausomus fermentus. Dėl šios priežasties skyla mažiau citoplazminių peroksidų ir padidėja ląstelės jautrumas oksidaciniam stresui [72].

1.2.2. Konservatyvių dermatofitijos gydymo priemonių trūkumai

Šie vaistai sukelia platų spektrą šalutinių poveikių. Azolai slopina citochromų (CYP) P-450 grupei priklausančius fermentus. Tai išprovokuoja vaistų sukeltus kepenų pažeidimus (angl. DILI).

14 Nustatyta, kad dažniausiai šiuos kepenų pažeidimus sukelia flukonazolas, vorikonazolas ir terbinafinas (lyginant priešgrybinius vaistus) [73]. Oraliai ir intraveniškai naudojamas flukonazolas gali sukelti diarėją, pykinimą, galvos skausmą ir svaigimą, skrandžio skausmus, kepenų ir inkstų pažeidimus [6]. Ketokonazolas stipriai siejamas su ginekomastijos atsiradimu. Jis blokuoja testosterono sintezę ir antinksčių atsaką į kortikotropiną, taip pat selektyviai pakeičia dihidrotestosteroną ir estradiolį serume [7]. Taip pat oraliai naudojamas ketokonazolas sukelia kepenų pažeidimus, vėmimą, hepatinę komą, kepenų nekrozę, pakyla ALT, AST, ALP [74]. Aprašytas atvejis, kuriame panaudojus klotrimazolo kremą buvo sukelta kontaktinė alergija, o paskyrus oraliai flukonazolo ir flukoksacilino po 48 val. atsirado plačiai išplitusi egzantemą [8]. Topiškai naudotas enilkonazolas kačių dermatofitozėms gydyti (sukeltoms M. canis) buvo toleruojamas gana gerai, tačiau pasireiškė seilėjimasis (nuo kelių minučių iki valandos), vienai katei (iš 22 kačių) atsirado raumenų silpnumas ir pakilęs ALT. Be to buvo padaryta išvada, kad gydymas su 0,2 proc. enilkonazolu šiuo atveju buvo tik dalinai efektyvus prieš M. canis [75].

Per pastarąjį dešimtmetį atsiradus mažiau toksiškų vaistų, kurie gali būti saugiai naudojami įvairiems pacientams, pradėta priešgrybinius vaistus dažniau naudoti profilaktikos, empiriniais ir tiesioginės terapijos tikslais. Toks padažnėjęs jų naudojimas sukėlė padidėjusį mikroskopinių grybų atsparumą šiems vaistams [10]. Nors daugelyje straipsnių skelbiama apie mielių (kandidozės) ir pelėsinių grybų (aspergiliozės) atsparumą azolų grupės vaistams, pradeda daugėti ir pranešimų apie dermatofitų atsparumą jiems [76]. Per pastaruosius kelis metus, dermatofitų atsparumas priešgrybiniams vaistams padidėjo dėl neracionalaus jų naudojimo [77]. Atsparumas visiems plačiai naudojamiems priešgrybiniams vaistams buvo aprašytas tiek laboratorinėmis sąlygomis tiek ir klinikiniuose atvejuose [9]. Pavyzdžiui, vieno in vitro tyrimo metu nustatytas, kad Trichophyton

rubrum ilgai veikiant itrakonazolu ir flukonazolu išsivysto atsparumas. Tuo pačiu tyrimu nustatytas

kryžminis atsparumas tarp abiejų azolų [78]. Taip pat dažnėja pranešimai apie visoms priešgrybinių vaistų klasėms atsparių rūšių atsiradimą (pvz. Candida auris) [79, 80]. Dabar egzistuojantiems priešgrybiniams vaistams atsparių kamienų atsiradimas yra neišvengiamas, todėl ateityje reikės naujų vaistų dermatomikozėms gydyti [81].

1.3. Dermatofitijos alternatyvios gydymo priemonės

Įrodymais pagrįsta alternatyvioji – papildančioji terapija – tai moksliniais tyrimais pagrįstų alternatyvių gydymo metodų taikymas bei alternatyvių ir konservatyvių metodų taikymas kartu. Jungtinių Tautų organizacija „Nacionalinis papildančiosios ir integruotosios medicinos centras“

15 alternatyviąją – papildančiąją mediciną apibūdina kaip įvairių medicinos ir sveikatos priežiūros sistemų praktiką ir produktus, kurie šiuo metu nėra priskiriami tradicinei Vakarų medicinai. Alternatyvūs dermatofitijos gydymo metodai remiasi natūraliomis medžiagomis, kurios dažnai savo efektyvumu nenusileidžia ir įprastiems sintetiniams vaistams. Augaluose gausu veikliųjų medžiagų: fenolių, kumarinų, flavonoidų, taninų, alkaloidų, saponinų, terpenų ir kt. Šios medžiagos pasižymi antidermatofitiniu veikimu [70]. Pavyzdžiui 6 proc. ciberžolės kremas efektyviai veikia prieš

Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum, Epidermophyton floccosum ir Microsporum gypseum

[82]. Kai kurios natūralios priemonės gali būti efektyvesnės už konservatyvius gydymo būdus ir neturėti šalutinių poveikių būdingų komerciniams vaistams. Tyrimais nustatyta, kad gydant žmones, turinčius burnos grybinę infekciją, natūralus ir netoksiškas arbatmedžio aliejus buvo efektyvesnė gydymo priemonė nei klotrimazolas [83]. Prie natūralių alternatyvių priešgrybinių medžiagų gali būti priskirtas ir bičių pikis [84] ar ozonas.

1.3.1. Eteriniai aliejai

Eteriniai aliejai – iš augalų išgauti koncentruoti natūralūs hidrofobiniai skysčiai. Dažniausiai tai lakieji aromatiniai junginiai [85]. Augalai gamina platų spektrą antrinių metabolitų: terpenoidus (limoneną, terpineną), alkoholinius junginius (mentolį, linalolį), įvairias rūgštis, aldehidus (benzaldehidus, kamparą), ketoninius kūnus ir fenolius. Dalis jų pasižymi antibakterinėmis ar priešgrybinėmis savybėmis [86]. Veterinarinėje medicinoje eterinių aliejų panaudojimas itin platus: privilioti arba atbaidyti gyvūnus; nuraminti gyvūnus; apsaugoti nuo blusų, erkių, moskitų, kandžių, amarų, vikšrų; kontroliuoti ausų erkutes ir parazitus; naudojami pašaruose vietoj antibiotikų; naudojami broilerių pašaruose apetitui ir virškinimo fermentų išsiskyrimui skatinti [87]. Eteriniai aliejai taip pat veiksmingi prieš mikroskopinius grybus. Tyrimais nustatyta, kad eukalipto, anyžių, gvazdikėlių, bergamočių, pelargonijų, sibirinio kėnio, citrinų ir arbatmedžio eteriniai aliejai turi fungicidinių savybių. Stipriausiu fungicidiniu poveikiu Trichophyton rubrum ir Microsporum canis grybams pasižymėjo gvazdikėlių, Sibiro kėnio, citrinų ir arbatmedžio eteriniai aliejai. Susidariusios sterilios zonos diskų difuzijos metodu svyravo nuo 29,5 mm iki 85,0 mm [13]. Šių eterinių aliejų sudėtyje yra fenolių. Nustatyta, kad katės negali tinkamai apdoroti fenolių ir didesni jų kiekiai gali būti toksiški [14]. Katėms galėtų būti saugus pelargonijų eterinis aliejus, jo sudėtyje yra labai maži kiekiai fenolių [15]. Šio aliejaus veiksmingumas prieš M. canis ir Trichophyton simii siekia 25-38,5 proc. [88]. Be to nustatyta, kad pelargonijų eterinis aliejus itin efektyviai mažina neutrofilų kaupimąsi odos pažeidimo vietoje, taip slopindamas uždegimą [89].

16 1.3.2. Alavijo gelis

Tikrasis alavijas (Aloe vera) yra daugiametis sukulentas kserofitas – augalas, kuris kaupia vandenį savo lapų audiniuose, kad išgyventų sausose vietovėse, kur mažas kritulių kiekis [90]. Tikrasis alavijas yra viena iš daugiau nei 400 Aloe rūšių, kurios priklauso Liliaceae augalų šeimai [91]. Alavijo (Aloe vera) gelis naudojamas išoriškai odos sudirgimams, nudegimams, žaizdoms, egzemoms, psoriazei, dermatitui, opoms gydyti, stimuliuoti ląstelių regeneraciją. Taip pat pasižymi antivirusiniu, priešvėžiniu, drėkinančiu poveikiu, veikia kaip antiseptikas, stiprina imuninę sistemą [92]. Aloe vera pasižymi antibakteriniu poveikiu prieš Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa [11]. Difuzijos į agarą metodu nustatytos 11-18 mm

slopinimo zonos Aspergillus niger, Cryptococcus neoformans, Penicillium maneffei, Fusarium

oxysporum, Rhizoctonia solani mikroskopiniams grybams [93]. Nustatytas prieštaringas alavijo

gelio poveikis C. albicans įdubų metodu. Vieni autoriai nurodo, jog Aloe vera veiksmingai veikia

C. albicans [11], kitų autorių tyrimai rodo atsparumą [93]. Pagal Shrivastav et al. autorių tyrimus T. mentagrophytes, T. tosurans ir M. audoinii paveikus Aloe vera geliu buvo gautos atitinkamos

slopinimo zonos 11, 13 ir 12 mm. T. rubrum, T. equinum, M. nanum ir M. gypseum rodė atsparumą

Aloe vera geliui [12]. Atlikti klinikiniai tyrimai su 10 arklių užsikrėtusių T. equinum. Pusė jų gavo

įprastinį gydymą grizeofulvinu (oraliai), kita pusė gavo česnakų tablečių, o žaizdos buvo įtrinamos alavijo geliu. Norimas gydymo rezultatas buvo pasiektas 25‘ą dieną abiem metodais [94]. Ištyrus

Aloe vera cheminę sudėtį, nustatyta, kad didžiausią antidermatofitinį poveikį prieš T. mentagrophytes ir T. rubrum turi fitolis (aciklinis diterpeno alkoholis) [95].

1.3.3. Ozonas

Ozonas tai triatomė deguonies forma (O3). Įprastoje temperatūroje, susidaręs iš sauso oro, ozonas yra melsvos dujos, tačiau bespalvės – kai gaminamos iš itin gryno deguonies [17]. Ozonas turi aukštą oksidacinį potencialą – 2,076 V [16], lyginant su chloru – 1,36 V ir deguonimi – 1,23 V [17]. Jį lenkia tik fluoras ir persulfatas. Ozonas yra 1,6 karto tankesnis ir 10 kartų geriau tirpstantis vandenyje (49 ml/100 ml vandens, esant 0 oC) nei deguonis [16]. UV spindulių (188 nm bangos ilgio) ir koroninės iškrovos metodais galima inicijuoti laisvųjų deguonies radikalų susiformavimą ir taip generuoti ozoną [17]. Ozono dujos yra nestabilios ir negali būti kaupiamos, nes jų pusinės eliminacijos laikas yra 40 min (20 oC). Taigi jos turi būti panaudojamos iškart po pagaminimo [16]. Ozonuojant aliejus, ozonas jungiasi su dvigubomis jungtimis tarp anglies atomų ir sudaro patvaresnius ryšius [17]. Aliejai turintys daugiau riebalų rūgščių geba prisijungti didesnius ozono kiekius [96]. Praktikoje yra naudojamas potencialių ozonidų indeksas (POI), kuris skaičiuojamas: Omega 3 (x3) + Omega 6 (x2) + Omega 9 (x1) = POI. Pagal POI daugiausią ozono gali pasisavinti

17 kanapių aliejus. Ozonuotų aliejų tyrimuose ozono koncentracija svyruoja tarp 0,1 ir 3,2 μg/ml [20]. Po oksidacijos reakcijos ozonas virsta deguonimi ir nepalieka jokių pavojingų likučių, todėl labai susidomėta jo kaip ekologiškos, saugios priemonės panaudojimu įvairiose srityse. „Google scholar“ duomenimis per pastaruosius 10 metų yra pasirodę virš 670 tūkstančių mokslinių straipsnių apie ozoną. Jo panaudojimo spektras didžiulis: vandens dezinfekcija; žemės ūkyje naudojamas vietoj fungicidų; patalpų oro dezinfekcija; maisto pramonėje prailgina produktų galiojimo laiką; bitininkystėje naudojamas nuo kenkėjų; žmonių odontologijoje; arklių laminitui gydyti; mastitui gydyti [97]. Ozonas taip pat galėtų būti nauja saugi ir efektyvi dermatomikozių ir kitų odos ligų gydymo priemonė. Toliau bus nagrinėjamas ozono potencialas gydyti odos infekcines ligas.

Išoriškai naudojamas ozonas gali lengvai prasiskverbti per odą, efektyviai naikinti mikroorganizmus ir sterilizuoti pažeistą vietą [16]. Ozonas akimirksniu reaguoja su polinesočiosiomis riebalų rūgštimis, kurios yra odos raginiame sluoksnyje, tuo metu susidaro aktyvi deguonies forma ir lipo-oligopeptidai [98]. Ozonuotas vanduo ir ozonuoti aliejai efektyviai skatina antioksidacinius fermentus aktyvuoti imuninę sistemą, gerina kraujo cirkuliaciją paveiktame audinyje, padidina deguonies tiekimą ir skatina augimo faktorių atpalaidavimą. Teigiama, kad dėl serumo ir ląstelinių antioksidantų apsaugos, ozonas negali pažeisti sveikų ląstelių ar audinių [99]. Ozonas oksiduoja bakterijų baltymus ir lipidus, taip pažeisdamas bakterijų sienelės vientisumą ir sukeldamas ląstelės žūtį (3 pav.) [100]. Ozonas pažeidžia virusų kapsidę ir nutraukia reprodukcinį ciklą. Veikdamas per peroksidacijos procesą, jis nutraukia ryšius tarp viruso ir ląstelės [101]. Ozonas yra pajėgus difuziškai prasiskverbti pro grybų sienelę, jis patenka į jų citoplazmą ir nutraukia gyvybines ląstelės funkcijas. Ozonas slopina sporų augimą, produkciją ir biomasės augimą [102]. Keratinazė laikoma pagrindiniu dermatofitų virulentiškumo faktoriumi odos infekcinėse ligose. Nustatyta, kad M. canis ir T. rubrum sukėlė didžiausia keratinazės aktyvumą, o

T. interdigitale ir M. gypseum – mažiausią. Naudojant ozonuotą aliejų, keratinazės aktyvumas buvo

nuslopintas nuo 49,64 proc. (T. rubrum) iki 87,21 proc. (M. gypseum) [20].

Ozono dujos pasižymi stipriu oksidaciniu poveikiu prieš mikroorganizmus. Naudojant 25 ppm koncentracijos ozono dujas 20 minučių, daugelis bakterijų kolonijas sudarančių vienetų sumažėjo ≥4log10 (Clostridium difficile, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae,

Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa ir kt.) bei apie 3log10 (Bacillus cereus, MRSA, Enterococcus faecalis, Escherichia coli ir kt.) [103]. Taip pat patvirtintas

ozono dujų veiksmingumas prieš toksikogeninius mikroskopinius grybus Fusarium spp.,

Aspergillus spp. ir Penicillium spp. [104]. Atlikus bandymą su 13 aplinkoje esančių mikroskopinių

18 išnaikinti tirtus mikroskopnius grybus patalpų ore [105]. Ozono dujos taip pat veiksmingai naikina dermatofitus Trichophyton rubrum ir Trichophyton mentagrophytes [106, 107].

3 pav. Elektroninės mikroskopijos būdu padarytos nuotraukos: a – kontrolinės E. coli 0157 bakterijos; b – ozonu paveiktos E. coli 0157 bakterijos; c – kontrolinės L. monocytogenes

bakterijos; d – ozonu paveiktos L. monocytogenes bakterijos. Ozonu paveiktos bakterijos netaisyklingos formos, suardytos [100]

Už ozono dujas efektyvesnis yra ozonuotas aliejus. Ozonuotam aliejui patys jautriausi dermatofitai yra M. gypseum ir M. canis. Naudojant 0,5 μg/ml koncentracijos ozonuotą aliejų pastarųjų dermatofitų sporų gamyba sumažėjo 98,71 ir 97,05 proc. [108]. Gydant vulvovaginalinę kandidozę, ozonuotas aliejus taip pat efektyviai kaip ir klotrimazolas sumažino klinikinius simptomus, o mėginiuose kandidozės sukėlėjų rasta nebuvo [109]. Patogenų (Candida spp. ir

19 [110]. Gydant M. canis sukeltus pažeidimus triušiams in vivo pastebėta, kad ozonuotas aliejus ir terbinafino kremas turėjo panašų poveikį [22]. Trečios fazės klinikiniame tyrime, gydant nagų grybelį, pastebėta, kad ozonuotas aliejus buvo efektyvesnis už ketokonazolį ir pasižymėjo 92,7 proc. efektyvumu [23]. Ozonuoto aliejaus saugumas nustatytas tiek žmonių medicinoje (gydant pėdų, nagų grybelį ir pragulų opas) [24, 21, 23] tiek ir veterinarijoje (gydant dermatomikozes triušiams) [22], jokio šalutinio poveikio šiuose in vivo tyrimuose nepastebėta.

Ozonuotas aliejus taip pat pasižymi naudingomis savybėmis visoms odos žaizdoms. In vitro ir

in vivo tyrimais nustatyta, kad ozonuotas aliejus gali reikšmingai sumažinti odos žaizdų plotus

pelėms ir pagreitinti šių žaizdų gijimą lyginant su kontroline grupe. Šie tyrimai parodė, kad ozonuotas aliejus padidino kolageno I, α-SMA ir TGF-β1 mRNR bei proteinų kiekius fibroblastuose [111]. Buvo iškelta hipotezė, jog visi ozonuoti aliejai, kurie turi tokį patį peroksidų kiekį turės tą patį poveikį žaizdų gijimui. Atlikus tyrimus su ozonuotais linų sėmenų, sezamo ir alyvuogių aliejais, hipotezė buvo paneigta ir nustatyta, kad sezamų aliejus buvo efektyviausias. Vienintelis ozonuotas sezamų aliejus turėjo reikšminga poveikį žaizdų susitraukimo greičiui [112]. Pats sezamo aliejus taip pat skatina žaizdų gijimą [113]. Naudojant ozonuota sezamo aliejų žaizdai gyjant susidaro geriau organizuotas epitelio sluoksnis su didesniu kiekiu kolageno, mažiau uždegiminių ląstelių ir geriau išreikštais plaukų folikulais ir liaukomis nei naudojant paprastą sezamų aliejų [114]. Taigi, norint pasiekti geriausių rezultatų, svarbios ir paties ozonuojamo aliejaus savybės.

1.4. Kanapių aliejus

Įvairiuose pasaulio regionuose kanapės jau nuo seno buvo naudojamos medicininiais tikslais: naudotos išoriškai skausmui malšinti ir niežuliui sumažinti. Kanapių sėklų aliejus naudingas gydant žmonių egzemą, dermatitą, seborėjinį dermatitą, psoriazę, plokščiąją kerpligę, rožinę [115].

Šiais laikais tokį teigiamą poveikį odos ligoms jau galima pagrįsti moksliškai. Kanapių aliejuje nepakeičiamosios linolo (omega-6) ir alfa-linoleno (omega-3) riebalų rūgštys pasiskirstę atitinkamu santykiu tarp 2:1 ir 3:1 [116, 117]. Šiame aliejuje taip pat randamos omega-9 ir gama-linoleno rūgštys bei kanabidiolis, kariofilenas, beta-sitosterolis, vitaminas E, metil-salicilatas [117]. Tyrimais nustatyta, kad sėjamoji kanapė (Cannabis sativa L.), į kurios sudėtį įeina kanabidiolis ir kanabidiolio rūgštis gali mažinti odos uždegimą [118]. Kariofilenas, kurio gausu kanapių aliejuje, taip pat pasižymi priešuždegiminiu poveikiu [119] ir antinociceptiniu veikimu [120, 121]. Paskyrus kariofileno per os, buvo reikšmingai sumažintas tiek ūminis tiek lėtinis skausmas pelėms [121].

20 Siekiant, išsiaiškinti beta-sitosterolio poveikį, naudojant 2,4-dinitrofluorobenzeną pelėms buvo sukeltos į atopinį dermatitą panašios žaizdos. Nustatyta, kad oraliai naudojant beta-sitosterolį (2,5 mg/kg) šioms žaizdoms gydyti, reikšmingai sumažėjo uždegiminių citokinų, chemokino, imunglobulino E ir histamino [122]. Beta-sitosterolis gali būti naudojamas ir išoriškai. Užsienio šalių rinkoje yra „Mebo“ tepalas odai su 0,25 proc. beta sitosteroliu (kilmės šalis – Jungtiniai Arabų Emiratai). Metil-salicilatas pasižymi skausmo malšinimu. Vienkartinis 8 valandas trukęs tepalo (10 proc. metil-salicilato ir 3 proc. l-mentolio) panaudojimas ant odos sumažino silpną ir vidutinį raumenų skausmą 40 procentų geriau nei placebas [123]. Kanapių aliejuje metil-salicilato randami tik pėdsakai [117]. Taigi kanapių aliejus turi komponentų, kurie silpnina skausmą ir mažina odos uždegimą. Tai gali būti naudinga gydant dermatofitozes.

21

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) dr. L. Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikoje. Tyrimas truko 8 mėnesius (nuo 2017 m. spalio iki 2018 gegužės mėn.). Dermatofitai buvo išskirti iš „X“ veterinarijos klinikoje paimtų plaukų mėginių, kurie buvo surinkti iš įtariamai dermatofitoze sergančių gyvūnų. Paimti mėginiai pernešti ant Sabūro agaro (Sabouraud CAF Agar) ir auginti 7-14 dienų, 29 ±0,5 °C temperatūroje termostate (TERMOSTAT TC-80M-2) aerobinėmis sąlygomis. Dermatofito rūšis nustatyta mikroskopuojant OXION OX 3085 binokuliariniu mikroskopu. Mikroskopinio grybo hifų dalis užnešta kilpele ant objektinio stiklelio, nudažyta metileno mėlynuoju ir x400-x1000 padidinimu mikroskopuota, naudojant imersinį aliejų. Mikroskopuojant matomos specifinės makrokonidijos (4 pav. dešinėje). Surinkti 6 Microsporum

canis mėginiai. Visi mėginiai buvo paimti iš prieglaudose gyvenančių kačiukų (iki 6 mėn.).

4 pav. Microsporum canis makrokonidijos, matomos mikroskopuojant elektroniniu mikroskopu (kairėje) ir optiniu mikroskopu (dešinėje) [124]

Tyrime naudotos medžiagos: šalto spaudimo kanapių aliejus, prisotintas ozonu (UAB „Ozono centras“, Lietuva); Himalajinių pelargonijų (Pelargonium graveolens var. himalayica) eterinis aliejus (UAB „Kvapų namai“, Lietuva); LSMU veterinarijos akademijos eksperimentinės ir klinikinės farmakologijos laboratorijoje iš Vaistinio alavijo (Aloe vera) lapų pagamintas gelis; Charmil plus 50 g odos gelis (Pongamia pinnata, Cedrus Deodara, Azadirachta indica eteriniai aliejai; Ayurvet Limited, Indija; platintojas Ruvera, Šiauliai), Fungiderm odos tirpalas (klotrimazolas 5 mg/ml, Drwalewskie Zakłady Przemysłu Biow eterynaryjnego Spółka Akcyjna, Lenkija), Imaverol odos tirpalas (enilkonazolas, 100 mg/ml, Eli Lilly Regional Operations GmbH, Austrija), Biopirox odos purškalas (olamino piroktonas 1 g/100 ml, Bioveta, Čekijos Respublika), Terbinafine Actavis (terbinafino hidrochloridas, 10 mg/g, Actavis Group PTC ehf., Islandija). Kontrolei buvo naudotas grynas šalto spaudimo kanapių aliejus (UAB „Ecohumus“, Lietuva). Medžiagos ir vaistai buvo laikomi pagal gamintojo nurodymus. Imaverol odos tirpalas buvo skiestas fiziologiniu tirpalu santykiu 1:50. Ruošiant Himalajinių pelargonijų eterinį aliejų tyrimui,

22 7-14 d. 29oC 14 d. 29oC 3-7 d. 29oC

buvo vadovautasi nurodymais, pagal kuriuos paruošta gyvūnams (ypač katėms) nekenksminga jo koncentracija: 4 eterinio aliejaus lašai sumaišyti su 10 ml kanapių aliejaus [125]. Taip pat paruoštas didesnio stiprumo mišinys: 12 lašų eterinio aliejaus ir 15 ml kanapių aliejaus.

Agaras mikroskopinių grybų išskyrimui ruoštas pagal gamintojo reikalavimus. Sabūro agaro 65,5 g ištirpinta 1 litre išgryninto vandens. Paruoštas tirpalas kaitintas maišant, kol visai ištirps, vėliau autoklavuotas 118 °C temperatūroje 15 min. Atvėsintas agaras išpilstytas į stiklines Petri lėkšteles po 20 ml.

5 pav. Tyrimo schema

Tyrimo schema pavaizduota 5 paveiksle. Dermatofitų kultūros buvo išgrynintos juos persėjant dūrio metodu. Išskirtos dermatofito kultūros kultivuotos 29 ±0,5 °C termostate aerobinėmis sąlygomis. Keturiolikos dienų kolonija padengta 5 ml steriliu fiziologiniu tirpalu ir švelniai perbraukta kelis kartus Pastero pipetės smailiu galu tam, kad suardyti kolonijos vientisumą ir atskirti hifus bei konidijas nuo kolonijos agaro paviršiaus. Tokia suspensija perpilta į sterilų mėgintuvėlį, palikta 15 – 20 min nusėsti stambioms dalelėms, viršutinis skystis pipete nutrauktas į kitą mėgintuvėlį ir 15 s maišytas Vortex V-1 plus maišykle. Tokia suspensija pritaikyta 0,5

M. canis sporų

suspensija tolygiai užsėjama ant Sabūro agaro

Diskų difuzijos metodu uždedami diskeliai su tiriamomis medžiagomis Difuzijos į agarą metodu OKA

įpilamas į įdubas

M. canis

slopinimo zonų vertinimas Dūrio metodu į Sabūro

agarą persėti aptikti dermatofitai

5 ml fiziologinio tirpalo užpilama ant užaugusios grynos M. canis kultūros, po 2 val. suardomas kolonijos vientisumas Į mėgintuvėlį supilama susidariusi suspensija ir leidžiama stambioms dalelėms nusėsti Hemacitometru užtikrinama sporų koncentracija pagal MacFarland Kačiuko plaukų mėginys

Mėginys pasėtas ant Sabūro agaro

23 MacFarland standartui - atitinkamai 1-5x106 KSV/ml. Tinkama suspensijos koncentracija užtikrinta skaičiuojant hemacitometru [66, 68].

Difuzijos į agarą (įdubų) metodas naudotas tik su ozonuotu kanapių aliejumi. Agare daromos įdubos (9 mm), į kurias lašinama tiriamoji medžiaga (0,1 ml). Cheminės tiriamosios medžiagos difunduoja į agarą, slopina mikroskopinių grybų augimą aplink įdubą ir susiformuoja skaidrios zonos. Tyrime buvo naudoti atitinkami ozonuoto kanapių aliejaus ir kanapių aliejaus praskiedimai: 50 proc. atitinka 0,15:0,15 ml aliejų, 60 proc. – 0,18:0,12 ml, 70 proc.– 0,21:0,09 ml bei grynas 100 proc. ozonuotas kanapių aliejus.

M. canis jautrumas priešgrybinėms medžiagoms tirtas Kirby-Bauer (diskų difuzijos) metodu

[68]. Tiriamųjų medžiagų priešgrybinėms savybėms nustatyti naudoti 6 mm filtrinio popieriaus diskai [67, 68]. Sterilūs filtrinio popieriaus diskai išmirkyti 0,02 ml kiekvienu tiriamuoju tirpalu, išdžiovinti ore ir sudėti ant sustingusio agaro su pasėtais mikromicetais.

Petri lėkštelės su pasėtomis M. canis kultūromis ir tiriamosiomis medžiagomis kultivuotos termostate 29 ±0,5 oC temperatūroje. Skirtingos padermės auga skirtingu greičiu, todėl rekomenduojama slopinamųjų zonų diametrus vertinti pirmąją dieną, kai kontrolėje gerai matomas dermatofito augimas [64]. Visų zonų sritys (diametras, mm), kuriose slopintas M. canis augimas, išmatuotos liniuote. Jei aplink diskus skaidri zona nesusidarė (0 mm), daryta išvada, kad tiriamasis mikroskopinis grybas atsparus tiriamajai medžiagai [68].

Kontrolė (kanapių aliejus), 4 vaistinės medžiagos ir 3 alternatyvios priešgrybinės medžiagos tirtos 4 pakartojimais, o ozonuotas kanapių aliejus 9 pakartojimais su kiekvienu iš 6 M. canis. Įdubu metodu su ozonuotu knapių aliejumi atliktas tyrimas 4 skirtingomis koncentracijomis, po 4 pakartojimus.

Statistinė duomenų analizė atlikta kompiuterine programa IMB SPSS Statistics 25. Skaičiuotas vidurkis, mediana, moda, minimali ir maksimali reikšmės, standartinis nuokrypis nuo vidurkio, standartinė vidurkio paklaida, patikimumas, Stjudento T-test, ANOVA, Pirsono koreliacija.

24

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1. Ozonuoto kanapių aliejaus poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum

canis nustatymas difuzijos į agarą (įdubų)

metodu

Atlikus tyrimus su ozonuotu kanapių aliejumi (OKA) įdubų metodu Petri lėkštelėse M. canis augimas nestebimas, todėl neįmanoma nusakyti slopinamosios zonos diametro. Norėdami bent apytiksliai nustatyti šią zoną atlikome keletą OKA praskiedimų su kontroliniu kanapių aliejumi (KA). Stipri teigiama koreliacija rodo, kad mažėjant ozono kiekiui ozonuotame kanapių aliejuje slopinamosios zonos aplink įdubas taip pat mažėja (6 pav.). Naudojant 100 proc. OKA (originalų komercinį produktą) Petri lėkštelė buvo tuščia, todėl slopinimo zona yra bent 100 mm (Petri lėkštelės diametro dydžio). Naudojant 70 proc. OKA, jau buvo matomos slopinamosios zonos – 64,0 ±1,0 mm , 60 proc. OKA – 40,0 ±1,0 mm, 50 proc. OKA – 30 ±2,0 mm. Dešimtą M. canis augimo dieną zonos sumažėjo 50-70 proc. (vid. 57,75 proc.)

6 pav. OKA M. canis slopinamųjų zonų dydžio pokytis, didėjant OKA praskiedimui (įdubu metodu)

0 20 40 60 80 100 120

100 proc. OKA 70 proc. OKA 60 proc. OKA 50 proc. OKA

M. ca n is s lop in amos ios zo n o s d yd is , m m Pirsono koreliacija 0,991 , p<0,01

25

3.2. Ozonuoto kanapių aliejaus poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum

canis nustatymas diskų difuzijos metodu

Diskų difuzijos metodu nustatyta, kad OKA sudarė vidutiniškai 22,19 ±3.3 mm M. canis slopinimo zonas (mediana 22 mm, moda 22 mm, standartinė vidurkio paklaida 0,4528 mm, minimali reikšmė 16 mm, maksimali reikšmė 29 mm). OKA su skirtingomis M. canis padermėmis sudarė statistiškai reikšimingai skirtingas slopinamąsias zonas (p<0,001) (7 pav. ir 1 lentelė).

7 pav. OKA slopinamosios M. canis zonos diskų difuzijos metodu. I dalis 1 lentelė. OKA slopinamosios M. canis zonos diskų difuzijos metodu. II dalis

I M. canis II M. canis III M. canis IV M. canis V M. canis VI M. canis

Mediana, mm 20 24 26 19 21 22 Minimali reikšmė, mm 16 20 25 17 18 21 Maksimali reikšmė, mm 28 28 29 22 25 23 Standartinis nuokrypis nuo vidurkio, mm ±3,464 ±2.525 ±1,509 ±1,691 ±2,261 ±0,667 20,16 24,5 26,56 19,11 21,11 21,72 0 5 10 15 20 25 30

I M. canis II M. canis III M. canis IV M. canis V M. canis VI M. canis

M. ca n is s lop in amos ios zo n o s d yd is , m m vid. 22.19

26 Stulpelinėje diagramoje galima išskirti dvi grupes: slopinamąsias zonas virš 22,19 mm ir žemiau 22,19 mm ribos (raudona linija pažymėta 7 paveiksle). OKA stipriausiai slopino II ir III M.

canis padermes (vid. 25,53 ±2,28 mm, minimali reikšmė 20 mm, maksimali reikšmė 29 mm,

mediana 26 mm). Silpniausias OKA slopinamasis poveikis pastebėtas I, IV ir V ir VI M. canis padermėms(vid. 20,53 ±2,38 mm, minimali reikšmė 16 mm, maksimali reikšmė 28 mm, mediana 21 mm). Nors šių grupių slopinimo zonų vidurkiai skyrėsi statistiškai reikšmingai (p<0,001), dispersijos statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05), (2 lentelė).

2 lentelė. Dviejų nepriklausomų grupių t-test rezultatai pateikti lentelėje

*0 hipotezė teigia, kad mūsų išskirtų dviejų grupių dispersijos ir vidurkiai lygūs.

Taip pat pastebėta, kad OKA sudarytos slopinamosios zonos nėra idealiai lygaus apskritimo formos (8 pav.). Aplink diskelius su KA (kontrolėje) M. canis slopinimo zonos nesusidarė. Lyginant su OKA sudarytomis slopinimo zonomis, KA rezultatai statistiškai reikšmingai skyrėsi (p<0,001).

Levene testas dispersijos

lygybei T-testas vidurkių lygybei

F Sig. t Laisvės laipsnis Sig. (su dvipuse kritine sritimi) Vidurkių skirtuma s Stand. Paklaidos skirtumas 95 proc. skirtumo patikimumo intervalas Žemesn is Aukštes nis 0 hipotezė* 0.039 0.844 7.376 52 0.000 5.0000 0.6778 3.6398 6.3602 1 hipotezė 7.488 35.501 0.000 5.0000 0.6677 3.6451 6.3549

27

8 pav. Tyrimo metu darytos nuotraukos, kuriose matosi OKA sudarytų slopinimo zonų nelygūs kraštai (nuotraukos autorės)

3.3. Vaistinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui Microsporum canis

nustatymas ir palyginimas su ozonuotu kanapių aliejumi

Stipriausiomis M. canis slopinamosiomis savybėmis pasižymėjo Fungiderm odos tirpalas (klotrimazolas) vid. 54,85 ±0,5 mm (mediana 55 mm). Silpniausiomis slopinamosiomis savybėmis pasižymėjo Biopirox odos purškalas (piroktono olaminas) vid. 15,29 ±0,2 mm (mediana 15 mm). Imaverol odos tirpalas (enilkonazolas) vid. 49,77 ±0,1 mm (mediana 50 mm) ir Terbinafine Actavis kremas (terbinafino hidrochloridas) vid. 51,95 ±0,1 mm (mediana 52 mm) pasižymėjo panašiomis slopinamosiomis savybėmis. Visos vaistinės medžiagos sudarė lygaus apskritimo M. canis slopinimo zonas (9 pav.).

28

9 pav. Komercinių vaistinių preparatų slopinamojo poveikio zonos diskų difuzijos metodu. Kairėje – Biopirox odos purškalas, dešinėje – arčiau centro viena lėkštelė su Imaverol odos tirpalu ir dvi

lėkštelės dešiniau su Fungiderm odos tirpalu (nuotraukos autorės)

Skirtingoms M. canis padermėms Fungiderm odos tirpalo poveikis nebuvo statistiškai reikšmingai skirtingas (p=0,406), visos slopinamosios zonos buvo panašios (10 pav.).

10 pav. Fungiderm odos tirpalo slopinamosios zonos skirtingoms M. canis padermėms

Skirtingoms M. canis padermėms Imaverol odos tirpalo poveikis nebuvo statistiškai reikšmingai skirtingas (p=0,481), visos slopinamosios zonos buvo panašios (11 pav.).

50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

I M. canis II M. canis III M.canis IV M. canis V M. canis VI M. canis

M. ca n is s lop in amos ios zo n o s d yd is , m m

29

11 pav. Imaverol odos tirpalo slopinamosios zonos skirtingoms M. canis padermėms

Skirtingoms M. canis padermėms Terbinafine Actavis kremo poveikis nebuvo statistiškai reikšmingai skirtingas (p=0,534), visos slopinamosios zonos buvo panašios (12 pav.).

12 pav. Terbinafine Actavis kremo slopinamosios zonos skirtingoms M. canis padermėms

Skirtingoms M. canis padermėms Biopirox odos purškalo poveikis nebuvo statistiškai reikšmingai skirtingas (p=0,089), visos slopinamosios zonos buvo panašios (13 pav.).

45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

I M. canis II M. canis III M.canis IV M. canis V M. canis VI M. canis

M. ca n is s lop in amos ios zo n o s d yd is , m m 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57

I M. canis II M. canis III M.canis IV M. canis V M. canis VI M. canis

M. ca n is s lop in amos ios zo n o s d yd is , m m

30

13 pav. Biopirox odos purškalo slopinamosios zonos skirtingoms M. canis padermėms

OKA sudarytos M. canis slopinimo zonos statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo Fungiderm odos tirpalo sudarytų zonų (p<0,001) ir buvo mažesnės. OKA sudarytos M. canis slopinimo zonos statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo Imaverol odos tirpalo sudarytų zonų (p<0,001) ir buvo mažesnės. OKA sudarytos M. canis slopinimo zonos statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo Terbinafine Actavis kremo sudarytų zonų (p<0,001) ir buvo mažesnės. OKA sudarytos M. canis slopinimo zonos statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo Biopirox odos purškalo sudarytų zonų (p<0,001) ir buvo didesnės (3 lentelė).

3 lentelė. Priešgrybinių vaistų ir OKA t-testo duomenys

Leveno testas dispersijos lygybei T-testas vidurkių lygybei*

F Sig. t laisvės laipsnis Sig. (su dvipuse kritine sritimi) Fungiderm 33,625 0,000 -70,077 59,019 0,000 Imaverol 34,514 0,000 -59,733 57,082 0,000 Terbinafine Actavis 33,401 0,000 -63,160 61,134 0,000 Biopirox 22,942 0,000 13,800 70,999 0,000

*Atmetus H0 hipotezę (prielaida, kad slopinimo zonų dispersijos yra lygios), toliau pateikti duomenis pagal H1 hipotezę

(prielaida, kad slopinimo zonų dispersijos nėra lygios).

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

I M. canis II M. canis III M.canis IV M. canis V M. canis VI M. canis

M. ca n is s lop in amos ios zo n o s d yd is , m m

31

3.4. Alternatyvių priešgrybinių medžiagų poveikio mikroskopiniam grybui

Microsporum canis nustatymas ir palyginimas su ozonuotu kanapių aliejumi

Šioje grupėje stipriausiu priešgrybiniu poveikiu pasižymėjo Charmil plus odos gelis – vid. 16,88 ± 2,9 mm (mediana 17 mm, minimali reikšmė 12 mm, maksimali reikšmė 25 mm). Charmil plus odos gelis, kaip ir OKA atveju, sudarė netaisyklingo apskritimo zonas. Charmil plus odos gelis turėjo nevienodą poveikį skirtingoms M. canis padermėms (14 pav.), ANOVA testo duomenimis rezultatai statistiškai reikšmingai skyrėsi (p<0,001). Paruoštas pelargonijų eterinio aliejaus ir kanapių aliejaus mišinys bei alavijo gelis M. canis slopinimo zonų nesudarė. Lyginant su Charmil plus odos gelio sudarytomis zonomis, OKA sudarytos M. canis slopinimo zonos statistiškai reikšmingai skyrėsi (p<0,001) ir buvo didesnės.

14 pav. Charmil plus odos gelio slopinamosios zonos skirtingoms M. canis padermėms

Viso tirtos medžiagos ir jų vidutiniai M. canis slopinimo zonų dydžiai pateikti 15 paveiksle. 0 5 10 15 20 25 30

I M. canis II M. canis III M.canis IV M. canis V M. canis VI M. canis

M. ca n is s lop in amos ios zo n o s d yd is , m m

32

15 pav. Visų tirtų medžiagų vidutinių M. canis slopinimo zonų palyginimas

3.5. Ozonuoto kanapių aliejaus savybių nustatymas

Tyrimo metu nustatyta, kad KA pH reikšmė yra 5,98-6,12, OKA pH reikšmė – 3,29-3,89 (11-13oC). UAB „Ozono centras“ tyrimų laboratorijoje išmatuota, kad ozono koncentracija ozonuotame kanapių aliejuje per 3 mėnesius, laikant šaldytuve tamsaus stiklo buteliukuose, sumažėjo 2,2 ±0,4 proc. (1 priedas). 54,85 51,95 49,77 15,29 22,19 16,875 0 0 0 0 10 20 30 40 50 60 Fungiderm Terbinafinas Imaverol Biopirox OKA Charmil Pelargonijų et. al. Alavijo gelis Kanapių aliejus

33

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Pagal difuzijos į agarą (įdubų) metodo rezultatus gryno OKA M. canis slopinamoji zona turėtų siekti apie 100-120 mm. Reikalingi detalesni tyrimai, naudojant didesnio diametro Petri lėkšteles (150 mm). Iki šiol moksliniuose straipsniuose dar nebuvo nustatytos ozonuoto aliejaus priešgrybinės savybės dermatofitams įdubų metodu. Šiuos rezultatus galima palyginti tik su kitomis priešgrybinėmis medžiagomis (alavijų geliu, eteriniais aliejais). Alavijų gelis įdubų metodu sudarė 20 mm Trichophyton mentagrophytes slopinamąją zoną, o tyrime su M. canis slopinimo zonos nesudarė [63]. Pelargonijų (Pelargonium radula) spiritinis ekstraktas įdubų metodu sudarė 6 mm (M. gypseum) ir 7 mm (T. mentagrophytes) slopinimo zonas [65]. Galima daryti prielaidą, kad atliekant tyrimus įdubu metodu OKA dermatofitus priešgrybiškai veikia stipriau nei alavijo gelis ir pelargonijų spiritinis ekstraktas.

Galuppi ir kt. mokslininkai [67] nustatė statistiškai reikšmingą koreliaciją tarp diskų difuzijos ir daugybinio praskiedimo metodų, pagal kuriuos buvo nustatyta, kad enilkonazolis yra efektyvus prieš dermatofitus, kai jo slopinamoji zona siekia bent 18 mm. To paties tyrimo metu nustatyta

enilkonazolio M. canis ir kitus dermatofitus slopinanti zona – 50,47 ±3,842 mm. Šiame darbe

gautas panašus rezultatas (49,77 ±0,1 mm), naudoti to paties dydžio diskeliai (6 mm). Taip pat

galima teigti, kad M. canis yra jautrus šiame darbe naudotam enilkonazolui (Imaverol odos tirpalui). Esteban ir kt. [64] nustatė, kad klotrimazolo M. canis slopinamoji zona svyruoja tarp 62 ir 89 mm, o terbinafino – tarp 84 ir 89 mm. Šio darbo metu gauti zonų dydžiai mažesni, atitinkamai 54,85 ±0,5 mm ir 51,95 ±0,1 mm. Tokius skirtumus galėjo lemti tai, kad Esteban ir kt. mokslininkų tyrime naudoti didesnio diametro diskeliai (9 mm). Kito tyrimo metu [68] nustatyta terbinafino M. canis slopinimo zona – 53,25 ±7,12 mm (naudoti 6 mm diskeliai), kuri buvo artima šio darbo gautiems rezultatams (51,95 ±0,1 mm). Išanalizavus kitų autorių mokslinius straipsnius galima teigti, kad šio darbo metu nustatytos priešgrybinių vaistų slopinimo zonos atitinka kitų mokslininkų rezultatus, kuriuose buvo naudotas tas pats metodas ir tokio pat dydžio diskeliai. Įvairių tyrimų duomenimis stipriausiomis priešgrybinėmis savybėmis pasižymėjo terbinafinas [64, 66, 126]. Šiame darbe stipriausiomis priešgrybinėmis savybėmis pasižymėjo klotrimazolas (Fungiderm odos tirpalas). M.

canis slopinimo zonų skirtumus galėjo lemti skirtingos terpės, diskelių dydžiai, skirtingas diskelių

prisotinimas, žmogiškasis faktorius. Vaistinių medžiagų grupėje stebimas stiprus skirtumas tarp Biopirox odos purškalo ir kitų vaistinių preparatų slopinamųjų zonų dydžių. Nors Biopirox odos purškalas kaip ir kitos medžiagos pasižymi fungicidiniu poveikiu (ne tik fungistatiniu), tačiau priklauso visai kitai cheminių medžiagų grupei – hidroksipiridonams (klotrimazolas ir

34 enilkonazolas priklauso azolams, terbinafinas – alilaminams). Taigi tokį rezultatą galėjo lemti veikimo mechanizmo skirtumai.

Padalkar ir kt. mokslininkai [127] difuzijos į agarą (įdubų) metodu nustatė Charmil plus odos gelio Trichophyton spp. slopinamasias zonas pagal produkto koncentraciją: 15,78 ±0,50 mm (2 proc.), 18,67 ±0,61 mm (5 proc.), 23,67 ±0,74 mm (10 proc.), 26,22 ±0,57 mm (20 proc.). Tokiu pat principu nustatytos M. canis slopinamosios zonos: 17,11 ±0,85 mm (2 poc.), 18,56 ±0,89 mm (5 proc.), 21,17 ±0,67 mm (10 proc.), 25,61 ±0,49 mm (20 proc.). Padalkar ir kt. mokslininkų gautų rezultatų negalima palyginti su šio darbo rezultatais, nes skiriasi naudotos koncentracijos ir metodai. Pagal kitų mokslininkų gautus rezultatus galima teigti, kad difuzijos į agarą (įdubų) metodu Charmil plus odos gelis dermatofitus veikia stipriau nei alavijo gelis ir pelargonijų spiritinis ekstraktas. Tai atitinka šiame darbe gautus rezultatus diskų difuzijos metodu, kad Charmil plus veikia stipriau nei alavijo gelis ir pelargonijų eterinis aliejus.

Dermatofitų ir dirvožemio keratinofilinių mikroskopinių grybų fermentai priklauso neutralių arba šarminių proteazių grupei. Optimali jų veikimo pH reikšmė yra 6-9. Netirpių baltymų, o ypač keratino, aplinkoje pH siekia aukščiausią ribą [40]. Taip pat žinoma, kad šunų ir kačių odos pH reikšmė yra 6,4-7,4. Taigi po ozonavimo aliejuje susidaręs gerokai mažesnis pH (3,29-3,89), sukuria rūgštinę terpę, kuri yra nepalanki dermatofitams daugintis odoje.

Palyginus KA ir OKA rezultatus diskų difuzijos metodu, galima teigti, kad būtent ozonas pasižymi priešgrybiniu veikiu, nes KA nesudarė slopinamosios zonos. Pagal UAB „Ozono centras“ laboratorijoje gautus duomenis, galima daryti išvadą, kad ozonuoto kanapių aliejaus efektyvumas gali išlikti stabilus per visą gydymo laikotarpį (2-3 mėn.). Kitų mokslininkų [16] taip pat nustatyta, kad ozonuoto sezamų aliejaus fizikinės ir cheminės savybės per metus, laikant stikliniame inde šaldytuve, nepakito. Nustatyta, kad ozonuotame alyvuogių aliejuje pagrindinė veiklioji medžiaga yra trioleino triozonidai. Laikant kambario temperatūroje, jie išliko stabilūs 3 mėnesius, o šaldytuve – mažiausiai 2 metus [128]. Šio darbo metu taip pat pastebėta, kad per visą tyrimo laikotarpį (8 mėnesius) ozonuoto kanapių aliejaus M. canis slopinamosios savybės nepakito.

Pastebėta, kad laikant termostate (29 ±0,5 o_{C) OKA sudaro priešgrybinę slopinimo zoną} nelygiais kraštais ir laikui bėgant šį zona stipriai sumažėja, tai rodo ozono nestabilumą kambario ir aukštesnėje temperatūroje. Dėl tokio nestabilumo rekomenduojame ozonuotą kanapių aliejų naudoti kaip alternatyviąją – papildančiąją priešgrybinę terapijos priemonę.

35

IŠVADOS

1. Nustatyta, kad difuzijos į agarą metodu ozonuotas kanapių aliejus slopino Microsporum canis, sudarydamas didesnę nei 100 mm slopinimo zoną.

2. Diskų difuzijos metodu ozonuotas kanapių aliejus mikroskopinį grybą Microsporum canis slopino, sudarydamas 22,19 ±3,3 mm slopinimo zoną.

3. Ozonuotas kanapių aliejus pasižymėjo statistiškai reikšmingai (p<0,001) silpnesnėmis

Microsporum canis slopinamosiomis savybėmis nei komerciniai preparatai Fungiderm odos

tirpalas, Terbinafine Actavis kremas ir Imaverol odos tirpalas, tačiau stipresnėmis nei Biopirox odos purškalas.

4. Ozonuotas kanapių aliejus buvo pats efektyviausias tarp alternatyvių priešgrybinių medžiagų ir statistiškai reikšmingai (p<0,001) pasižymėjo stipresnėmis Microsporum canis slopinamosiomis savybėmis nei Charmil plus odos gelis, alavijo gelis bei pelargonijų eterinio aliejaus ir kanapių aliejaus mišinys.

5. Ozonuotas kanapių aliejus galėtų būti naudojamas kaip priešgrybinė priemonė gyvūnų mikrosporijai gydyti.