BETA AMILOIDO SĄVEIKA SU ŽIURKĖS NEURONINĖMIS IR MIKROGLIJOS LĄSTELĖMIS: EKSPERIMENTINIAI TYRIMAI IN VITRO

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Paulius Čižas

BETA AMILOIDO SĄVEIKA

SU ŽIURKĖS NEURONINĖMIS IR

MIKROGLIJOS LĄSTELĖMIS:

EKSPERIMENTINIAI TYRIMAI

IN VITRO

Disertacija rengta 2007–2011 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Medicinos akademijoje, Neuromokslų institute, Biochemijos laboratorijoje

Mokslinė vadovė

prof. dr. Laima Ivanovienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)

Konsultantė

prof. dr. Vilmantė Borutaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)

TURINYS

ĮVADAS ... 7

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8

1.1. Alzheimerio ligos tipai ir veiksniai ... 8

1.2. Amiloido baltymo pirmtakas ... 8

1.3. Alfa, beta ir gama sekretazės ... 10

1.4. APP skilimo keliai... 11

1.5. Aβ peptidai ... 12

1.6. Aβ peptido sankaupų susidarymas ... 13

1.7. Aβ1-40 ir Aβ1-42 monomerų, oligomerų ir fibrilių poveikį lemiantys veiksniai ... 14

1.7.1. Išorinis Aβ1-40 ir Aβ1-42 peptidų agregatų poveikis ląstelių gyvybingumui ... 15

1.7.2. Aβ1-42 oligomerų sukelto kalcio jonų kiekio padidėjimo neuronuose poveikis ... 18

1.7.3. Aβ oligomerų poveikis sinapsių funkcijoms ... 19

1.7.4. Viduląstelinis Aβ oligomerų poveikis. Endocitozė ... 19

1.7.5. Aβ poveikis mitochondrijoms ... 20

1.8. Aβ poveikis aktyvių deguonies junginių susidarymui ... 22

1.9. Aβ peptido agregatų pašalinimo keliai ... 22

2. METODAI ... 24

2.1. Ląstelių kultūros ... 24

2.1.1. Žiurkės smegenėlių neuronų kultūros paruošimas ... 24

2.1.2. Žiurkės smegenų žievės neuronų paruošimas ... 25

2.1.3. Pelių J774 makrofagų kultūros paruošimas... 26

2.2. Aβ1-40 ir Aβ1-42 peptidų agregatų paruošimas ... 26

2.2.1. Aβ oligomerų paruošimas (I protokolas) ... 26

2.2.2. Aβ oligomerų paruošimas (II protokolas) ... 27

2.2.3. Aβ oligomerų paruošimas (III protokolas) ... 27

2.2.4. Aβ fibrilių paruošimas ... 27

2.2.5. Aβ monomerų paruošimas ... 28

2.3. Baltymo koncentracijos nustatymas Bradfordo metodu ... 28

2.4. Aβ1-42 oligomerų tirpalo ultrafiltravimas ... 28

2.5. Neuronų žūties įvertinimas ... 29

2.5.1. Fluorescencinė mikroskopija ... 29

2.5.2. Nekrozės įvertinimas pagal LDH aktyvumą ląstelių augimo terpėje ... 29

2.6. Ląstelių plazminės membranos įtampos vertinimas ... 29

2.8. Ląstelių kvėpavimo greičio matavimas ... 30

2.9. Žiurkės smegenų mitochondrijų išskyrimas ... 30

2.9.1. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu ... 31

2.9.2. Mitochondrijų kvėpavimo greičio matavimas ... 31

2.10. Statistinė duomenų analizė ... 32

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 33

3.1. Įvairaus oligomerizacijos laipsnio Aβ1-40 ir Aβ1-42 peptidų poveikis neuronų gyvybingumui ... 33

3.2. Aβ1-42 oligomerų toksiškumo neuronams priklausomybė nuo peptidų laikymo sąlygų ... 37

3.3. Įvairių Aβ1-42 agregatų poveikio neuronams priklausomybė nuo inkubacijos laiko ... 39

3.4. Aβ1-42 poveikio neuronams priklausomybė nuo oligomerinių dalelių dydžio ... 40

3.5 Frakcionuotų Aβ1-42 agregatų poveikis neuronų kultūrai ... 41

3.6 Aβ1-42 peptido agregatų poveikis grynai smegenėlių neuronų kultūrai ... ... 43

3.7. Aβ1-42 agregatų poveikis 10–14 DIV neuronų kultūrai ... 45

3.8. Aβ1-42 peptido agregatų poveikis žievės neuronų kultūrai ... 46

3.9. Aβ1-42 agregatų poveikis J774 makrofagams ... 47

3.10. Didelių Aβ1-42 oligomerų poveikis neuronų gyvybingumui ... 49

3.11. Lipopolisacharido ir Aβ1-42 agregatų poveikis neuronų gyvybingumui ... 53

3.12. Aβ1-42 oligomerų sukeltos žūties mechanizmų tyrimas ... 55

3.12.1.Aβ1-42 oligomerų poveikis neuronų ir mikroglijos ląstelių plazminės membranos įtampos pokyčiams ... 55

3.13. Įvairių junginių poveikio, apsaugant neuronus nuo Aβ1-42 oligomerų sukeltos žūties, tyrimas ... 60

3.14. Aβ1-42 agregatų poveikis izoliuotų žiurkės smegenų mitochondrijų funkcijoms ... 61

DISKUSIJA ... 67

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 71

PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS DISERTACIJOS TEMA ... 86

SANTRUMPOS

AJM Atominės jėgos mikroskopija AL Alzheimerio liga

APP Amiloido baltymo pirmtakas Aβ Beta amiloidas

Aβ1-40 Beta amiloidas 1–40 amino rūgščių seka

Aβ1-42 Beta amiloidas 1–42 amino rūgščių seka

CNS Centrinė nervų sistema DMEM Ląstelių augimo terpė

DMSO Dimetilsulfoksidas ((CH3)2SO)

EDTA Etileno diamino tetraacto rūgštis

EGTA Etilenglikol-bis-(β-amino-etileterio)-N,N,N’,N’-tetraacto rūgštis HEPES 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinoetanosulfoninė rūgštis

HFIP 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanolis KSB Kraujo smegenų barjeras

LDH Laktato dehidrogenazė LPS Lipopolisacharidas MK-801 Dizociplinas (C16H15N)

MNPP Mitochondrijų nespecifinio laidumo pora NMDA N-metil-D-aspartato receptoriai

PBS Fosfatinių druskų buferis ROS Aktyvios deguonies formos TFA Trifluoracetinė rūgštis (CF3CO2H)

TFE Trifluoretanolis (CF3CH2OH)

TMPD N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilendiaminas α7nAChR α7 acetilcholino receptoriai

ĮVADAS

Alzheimerio liga (AL) labiausiai paplitusi silpnaprotystės forma, kuriai būdinga: laipsniškas atminties silpnėjimas, įgytų įgūdžių praradimas ar emociniai sutrikimai. Vėlesni ligos vystymosi etapai siejami su paralyžiumi, išsekimu ir mirtimi. Ši liga sudaro apie 50–70 proc. visų silpnaprotystės atvejų. 2010 metais pasaulyje buvo priskaičiuota apie 35,6 milijono šios ligos atvejų. Manoma, kad po dvidešimties metų sergančiųjų skaičius sieks apie 65,7 milijono, o apie 2050-uosius metus – 115,4 milijonus ligos atvejų [Ferri et al., 2009]. Rizikos veiksniai, galintys lemti ligos vystymąsi, yra: amžius, lytis, išsilavinimas, depresija, aukštas kraujospūdis, diabetas, aukš-tas cholesterolio lygis, gyvenimo būdas ar medikamentų vartojimas. Svarbiausiu rizikos veiksniu laikomas individo amžius. Atminties sutrikimai diagnozuojami apie 10 proc. 70-mečių, 25–45 proc. 85-mečių ir vyresnių pacientų. Ligos vystymąsis trunka 8–10 metų, pavieniais atvejais – nuo 2 iki 25 metų.

Nuo tada, kai 1907-aisiais metais Aloyzas Alzheimeris pirmą kartą aprašė šią ligą, senatvinės plokštelės ir neurofibriliniai raizginiai yra laikomi pagrindiniais šios ligos požymiais [Mattson et al., 2004]. Senatvinės plokštelės yra užląstelinės baltymo, vadinamo beta amiloidu, fibrilių san-kaupos, tuo tarpu neurofibriliniai raizginiai yra viduląstelinės hiperfos-forilinto baltymo Tau sankaupos. Dažniausiai šių dviejų baltymų aptinkama galvos smegenų žievės, hipokampo, migdolinio kūno zonose. Ilgą laiką buvo manoma, kad fibrilės ir iš jų sudarytos senatvinės plokštelės yra pagrindiniai ligą sukeliantys veiksniai, tačiau jų sandara ir morfologija ne-buvo atskleista. Aštuntajame praėjusio šimtmečio dešimtmetyje ne-buvo nu-statyta, kad senatvines plokšteles sudarančios fibrilės yra sudarytos iš mažesnių, beta amiloidu (Aβ) vadinamu peptidų. Šie peptidai gali sudaryti monomerus, tirpius oligomerus, protofibriles, netirpias fibriles ir jų san-kaupas, o jų kiekis smegenyse koreliuoja su AL vystymosi stadijomis. Apibendrinti tyrėjų duomenys leidžia manyti, kad ligos eigai yra reikšmingi 42 amino rūgščių peptidai (Aβ1-42), iš kurių sudaryti tirpūs oligomerai yra

toksiškiausi. Nustatyta, kad šie oligomerai gali mažinti sinapsių kiekį hipokampo neuronuose ir jų plastiškumą, slopinti ramybės potencialą. Nors teigiama, kad tirpūs oligomerai yra toksiški neuronams, tačiau duomenų kaip šį toksiškumą lemia jų morfologija ir dydis, nėra.

Tikslas

Ištirti įvairaus oligomerizacijos laipsnio Aβ1-40 ir Aβ1-42 peptidų agregatų

Uždaviniai:

1. Įvertinti Aβ1-40 ir Aβ1-42 monomerų, oligomerų ir fibrilių poveikį

neuronų-glijos ląstelių kultūros gyvybingumui.

2. Nustatyti ryšį tarp Aβ1-42 oligomerų toksiškumo ir dydžio.

3. Ištirti Aβ1-42 oligomerų poveikį neuronų ir mikroglijos ląstelių

plazminės membranos įtampos pokyčiams ir įvertinti, kokią reikšmę Aβ1-42 oligomerų sukeltoje neuronų žūtyje turi išorinio kalcio

koncentracija, NMDA receptorių ir endocitozės aktyvumas.

4. Nustatyti Aβ1-42 oligomerų poveikį smegenėlių kultūrai, papildytai J774

makrofagais

5. Nustatyti Aβ1-42 oligomerų poveikį mitochondrijų oksidacinio

fosforilinimo sistemai. Mokslinis naujumas

Šiame darbe nustatytas ryšys tarp Aβ1-42 oligomerų dydžio ir toksiškumo

neuronams. Pirmą kartą parodyta, kad maži (toksiški) Aβ1-42 oligomerai (1–

2 nm), koncentracijose, kurios gali susidaryti smegenyse patologinėmis sąlygomis, yra toksiški ląstelių kultūroje esantiems neuronams, tačiau nekeičia kitų, ląstelių kultūroje esančių, ląstelių gyvybingumo (mikroglijos ir astrocitų).

Pirmieji išsiaiškinome, kad maži ir dideli Aβ1-42 oligomerai gali sukelti

neuronų žūtį skirtingais mechanizmais: maži tiesiogiai veikdami neuronus, o dideli veikdami per glijos ląsteles.

Mūsų tyrimai atskleidė iki šiol neaprašytą reiškinį, kad maži Aβ1-42

oligomerai gali sąlygoti ne tik neuroninių ląstelių žūtį, bet ir jų tankio mažėjimą, kuris, kitų autorių tyrimų duomenimis [Neniskyte et al., 2011], gali būti susijęs su Aβ paveiktų, bet gyvybingų neuronų praradimu fago-citozės būdu.

Parodėme, kad maži Aβ1-42 oligomerai sukelia ne tik neuronų, bet ir

mikroglijos ląstelių plazminės membranos įtampos pakitimus. Šiuose plazminės membranos įtampos pokyčiuose, mikroglijos ląstelėse, dalyvauja NMDA receptoriai.

Nustatėme, kad ląstelės išorėje esančių laisvųjų kalcio jonų koncent-racijos sumažinimas, endocitozės slopinimas, mažinantis Aβ1-42 oligomerų

patekimą į ląstelės vidų, bei estradiolis, apsaugantis neuronų mitochondrijas nuo nespecifinės mitochondrijų laidumo poros susiformavimo, apsaugo neuronus nuo žūties, esant mūsų pasirinktoms mažų Aβ1-42 oligomerų

1.

_{LITERATŪROS APŽVALGA}

Alzheimerio ligos priežastys išlieka nežinomos. Manoma, kad ligos atsiradimas susijęs su genetiniais, biologiniais ar aplinkos veiksniais [Lee et al., 2010]. Alzheimerio liga (AL) yra skirstoma į du potipius: ankstyvąją ir vėlyvają. Šios ligos ankstyvasis potipis apima 1–6 proc. visų AL atvejų, stebimas 30–60-aisiais individo gyvenimo metais ir siejamas su šeimine, autosominiu dominantiniu keliu paveldima, ligos forma. Manoma, kad šio potipio ligos eiga susijusi su amiloido baltymo pirmtako (APP) [Citron et al.,1992], presinilino 1 (PS1), presinilino 2 (PS2) [Haass et al., 1999; Jean-Charles et al., 2011] ir apolipoproteino (ApoEe4) mutacijomis [Masters et al., 1998)]. Vėlyvosios ligos potipis, pasireiškiantis 60-aisiais ir vėlesniais gyvenimo metais, yra labiau paplitęs ir priskiriamas prie pavienių/at-sitiktinių ligos atvejų, siejamų su aplinkos veiksniais. Dėl AL ankstyvo diagnozavimo metodų trūkumo sunku yra spręsti, kada jos priežastis yra genetiniai veiksniai, o kada aplinkos, nes dažniausiai liga nustatoma vyresniame individo amžiuje. Abu ligos tipai glaudžiai persipina ir sunku yra nustatyti, kuri jos forma yra šeiminė paveldima, o kuri pavienė/atsitiktinė. Taigi svarbu yra įvertinti negenetinius ligos vystymosi veiksnius.

1.2 Amiloido baltymo pirmtakas

Amiloidinės senatvinės plokštelės yra vienos iš pagrindinių Alzheimerio ligos morfologinių požymių. Plokštelės yra sudėtingi, kintančios struktūros ir sudėties dariniai. Jose aptinkama įvairių žuvusių smegenų ląstelių ar jų baltymų [Iwata et al., 2004]. Šios plokštelės susiformuoja iš nedidelio 4 kDa (38–43 amino rūgščių (a. r.)) Aβ peptido, kurio pirmtakas yra 100–130 kDa membraninis baltymas, vadinamas amiloido baltymo pirmtaku (APP). Žinomos aštuonios šio baltymo izoformos, aptinkamos įvairių tipų ląstelėse, tačiau dažniausiai aptinkamos trys izoformos, sudarytos iš 695, 751 ir 770 a. r. (APP 695, APP 751 ir APP 770). Ląstelės lygmenyje APP baltymas aptinkamas plazminėje membranoje, Goldžio komplekse, endoplazminiame tinkle, endosomų, lizosomų ir mitochondrijų membranose. Trumpiausioji izoforma APP 695 gausiausiai sintetinama smegenyse. APP 751 izoforma turinti, Kunitz serininės proteazės inhibitoriaus domeną (KPI), o taip pat

APP 770 izoforma, turinti KPI ir MRC-OX2 antigeno domenus užląs-telinėse baltymo dalyse, dažniau aptinkamos ne neuroninėse ląstelėse [Selkoe et al., 2001]. Aβ domenas, galintis dalyvauti Aβ peptido susi-daryme, nustatytas visose trijose APP baltymo izoformose.

APP baltymas skirstomas į tris dalis: didelę užląstelinę dalį, sudarančią apie 88 proc. viso APP baltymo masės, hidrofobinę membraninę dalį ir trumpą citoplazminę dalį. Manoma, kad APP baltymas atlieka ląstelės paviršiaus receptorinę, sukibimo, neuritų ilgėjimo, sinaptogenezės ir kitas funkcijas [Beher et al., 1996; Ho et al., 2004; Kibbey et al., 1993]. Citoplazminė baltymo dalis yra konservatyvioji APP dalis. Manoma, kad svarbiausios šios baltymo dalies funkcijos yra įvairių medžiagų pernašos reguliacija aksonuose, signalo perdavimas, ląstelių migracijos reguliacija ir kt. [Zheng H et. al., 2011]. Citoplazminės APP dalies fosforilinimas yra svarbus ląstelių diferenciacijai [Suzuki et al., 1994; Ando et al., 1999]. Nu-statyta, kad citoplazminėje APP dalyje esančio treonino (Thr 668) fosfo-rilinimas JNK 3 (c-jun N-terminal kinase 3) reguliuoja APP baltymo loka-lizaciją neurituose ir augimo kūgelyje in vitro sąlygomis [Muresan et al., 2005; Ando et al., 2001]. APP baltymo fosforilinimas in vivo sąlygomis neištirtas, tačiau manoma, kad jame dalyvauja CDK 5 (cyclin-dependent kinase 5), JNK (c-Jun NH2-terminal kinase) ir GSK3β (Glycogen synthase kinase 3 beta) [Iijima et al., 2000; Muresan et al., 2005]. Nustatyta, kad APP, kurio citoplazminėje dalyje fosforilinta ši amino rūgštis, labiau paplitęs sergančiųjų AL smegenyse [Lee et al., 2003]. Citoplazminė APP baltymo dalis taip pat svarbi neuronų sinapsių rekonstrukcijai. Manoma, kad citoplazminė APP baltymo dalis jungiasi su Fe 65 (aktiną valdantis baltymas) ir Mena (citoskeletą valdantis baltymas) baltymais. Šių baltymų kompleksai išsidėsto aksono augimo kūgyje ir galbūt reguliuoja dinaminį APP baltymo sukibimą su kitais paviršiais [Sabo et al., 2003], nors tai nėra galutinai aišku.

Eksperimentai in vivo ir in vitro patvirtino, kad APP baltymas prisideda prie aktyvios nesubrendusių neuronų migracijos į funkcionavimo vietas, erdvinio ląstelių išsidėstymo ir jų aksonų augimo bei brendimo [Ohsawa et al., 1997]. Wang P. tyrėjų grupė 2005 metais nustatė, kad esant nuslopintam APP genui pelių smegenų žievės neuronų migracija yra chaotiška. APP baltymo ir Fe 65 kompleksai taip pat didina ne neuroninių ląstelių migraciją, tačiau veikimo principas nežinomas [Sabo et al., 2001].

APP baltymų raiška priklauso nuo individo amžiaus. Žiurkių naujagimių smegenyse aptinkamo baltymo kiekis yra kelis kartus didesnis nei po perinatalinio laikotarpio. Manoma, kad tai susiję su APP baltymo netie-siogiu dalyvavimu formuojant jungtis tarp nutolusių neuronų aksonų [Clar-ris et al., 1995]. Aksonų augimo metu didžiausią dalį pernešamų baltymų

regos nerve sudaro APP baltymai ir jų homologai APLP 1 (APP-like protein 1) ir APLP 2 [Lyckman et al., 1998; Reed-Geaghan et al., 2009]. Šie bal-tymai taip pat svarbūs formuojantis funkcionuojančioms sinapsėms.

APP baltymų raiška hipokampo neuronų ląstelių kultūroje didina jų atsaką į glutamatą. Pelių motorinių neuronų ir skaidulų veikla bei signalo perdavimas sinapsėmis, esant nuslopintiems APP baltymo genams, sutrinka. Ilgalaikiai šių ryšių sutrikimai sukelia gyvūnų žūtį [Heber et al., 2000; Herms et al., 2004; Wang et al., 2005; Yang et al., 2005]. Manoma, kad APP baltymas taip pat svarbus centrinėje nervų sistemoje (CNS) bręstant įvairių neuronų potipiams [Salbaum et al., 1994].

1.3 Alfa, beta ir gama sekretazės

APP yra membraninis baltymas, kuris gali būti skaidomas daugelio proteazių, tačiau tik trys proteazės ar jų kompleksai siejamos su AL vys-tymusi [Fodero et al., 2011]:

Alfa sekretazė (α). Žinomi trys fermentai iš metaloproteinazių šeimos, turintys α sekretazės aktyvumus: ADAM 9 (a disintegrin and metallopro-teinase) ir ADAM 10, o taip pat ADAM 17, labiau žinoma kaip TACE (Tumor necrosis factor converting enzyme) fermentas [Allinson et al., 2003]. Šios proteazės sintezuojamos kaip profermentai, kurie fermentinį aktyvumą įgyja plazminėje membranoje.

Beta sekretazė (β). Ši sekretazė yra membraninis baltymas, priklausantis pepsino šeimos aspartilo proteazėms BACE 1 (β-site APP cleving enzyme 1) [Hussain et al., 1999; Sinha et al., 1999; Vassar et al., 1999; Yan et al., 1999; Lin et al., 2000]. Labiausiai β sekretazės sintezė yra išreikšta smegenyse, mažiau kituose organuose ar audiniuose. Ląstelėje šios sekreta-zės daugiausia aptinkama Goldžio komplekse ir endosomose, mažiau – endoplazminiame tinkle, lizosomose ir plazminėje membranoje [Vassar et al., 1999; Yan et al., 1999; Lin et al., 2000].

Gama sekretazė (γ). Tai kompleksinis fermentas, sudarytas iš keturių baltymų: presenilino, nikastrino, APH-1 (anterior pharynx-defective 1) ir PEN-2 (presenilin enhancer 2). Presenilinas ir jame esančios aspartilo proteazės yra šio fermento katalitinis subvienetas, atliekantis APP baltymo skėlimo funkciją [Fusheng et. al., 2006]. Pagrindinės nikastrino funkcijos yra palaikyti fermento stabilumą ir reguliuoti viduląstelinį baltymų judėjimą [Zhang et al., 2005]. PEN 2 padeda presenilinui suformuoti membraninį domeną ir stabilizuoti baltymo kompleksą po APP skėlimo [Prokop et al., 2004]. APH-1 reguliuoja proteolitinį fermento aktyvumą [Lee et al., 2004].

Šis daugiakompleksinis fermentas susiformuoja ir įgauna katalitinių savybių lygiajame endoplazminiame tinkle, vėliau pernešamas į grūdėtąjį endoplaz-minį tinklą, kuriame atlieka baltymų kirpimo funkciją [Camilla et al., 2004].

1.4 APP skilimo keliai

APP baltymo skaidymas ir apdorojimas gali vykti dviem skirtingais keliais – neamiloidogeniniu ir amiloidogeniniu.

Procesams vykstant neamiloidogeniniu keliu, α sekretazė skelia APP baltymą ties 83 a. r., skaičiuojant nuo peptido C galo. Į ląstelės išorę yra atpalaiduojamas didelis, tirpus peptido subvienetas sAPP α (soluble APP α), o membranoje lieka 83 a. r. peptidas, vadinamas C 83. Šį peptidą skelia γ sekretazė, turinti dvi alternatyvias skėlimo vietas. Gaunamas 24 arba 26 a. r. 3 kDa peptidas, vadinamas p3 peptidu, ir 57, arba 59 a. r. peptidas – C 57 arba C 59. Specifinė γ sekretazės skėlimo vieta yra APP baltymo Aβ do-mene. Skėlimas šioje vietoje leidžia išvengti Aβ peptido susidarymo, kuris yra svarbus veiksnys AL vystymęsi [Frank et al., 2007].

Procesams pakrypus amiloidogeniniu keliu, APP baltymą ties 99 a. r., skaičiuojant nuo C galo, skelia β sekretazė. Už ląstelės ribų atpalaiduojamas tirpus peptidas sAPP β (soluble APP β), o membranoje lieka 99 a. r. – C 99 peptidas. Šį peptidą skaido γ sekretazė, susidarant C 57 arba C 59 peptidui ir nedideliam 4 kDa Aβ peptidui, turinčiam 40 a. r. (Aβ1-40) arba 42 a. r. (Aβ 1-42) [Selkoe et al., 2001; Walsh et al., 2007]. Taip susidaro apie 90 proc. Aβ 1-40 ir 10 proc. Aβ1-42 peptidų. Nors gausiau yra sintetinamas Aβ1-40 peptidas,

AL atveju ypač svarbus Aβ1-42 peptidas. Šis ilgesnis peptidas yra labiau

hidrofobinis ir linkęs agreguotis į didesnius darinius [Burdick et al. 1992; Jarrett et al. 1993].

Galimos ir alternatyvios γ sekretazės skėlimo vietos. Susidarantys Aβ1- 43,

Aβ1-38 ar Aβ1-37 a. r. peptidai aptinkami ląstelių kultūrose ar smegenų

skysčiuose [Benilova et al., 2012]. Įvairaus ilgio peptidų susidarymas siejamas su aminopeptidazių, glutaminilciklazių ar jų izomerazių veikla, o taip pat su fosforilinimo procesais ląstelėje [Kumar et al., 2011]. Sveikose smegenyse nustatyta dvidešimt skirtingo dydžio peptidų, galinčių oligomerizuotis ir fibrilizuotis AL metu [Benilova et al., 2012].

Manoma, kad prie greitesnės Aβ peptidų oligomerizacijos ir toksiškumo prisideda jų fosforilinimas [Kumar et al., 2011]. Didesnis fosforilintų peptidų kiekis aptinkamas segančiųjų AL smegenyse, o taip pat šios ligos pelių modeliuose [Kumar et al., 2011].

Kuriuo keliu – amiloidogeniniu ar neamiloidogeniniu, vyks APP baltymo skaidymas nėra žinoma, manoma, kad tam gali daryti įtaka įvairūs aplinkos veiksniai.

1.5 Aβ peptidai

AL vystymesi pagrindiniai veiksniai yra toksiškų oligomerų ir fibrilių formavimasis ir kaupimasis. Svarbiausios šių darinių sudėtinės dalys yra Aβ1-40 ir Aβ1-42 peptidai bei jų izoformos (Aβ4-40, Aβ4-41, Aβ11-40, Aβ11-42,

pGluAb3-42, pGluAβ11-40, pGluAβ11-40 ir kt.) [Kangning et al., 2006;

Por-telius et al., 2010]. Nustatytų dvidešimties skirtingo dydžio Aβ peptidų, aptinkamų žmogaus CNS, funkcijos ir reikšmė ligos vystymuisi nėra žinoma [Portelius et al., 2008; Benilova et al., 2012].

Aβ1-42 peptido seka yra sudaryta iš 42 amino rūgščių liekanų ir

nume-ruojama nuo N galo: Asp1-Ala2-Glu3-Phe-Arg5-His6-Asp7-Ser8-Gly9-Tyr10

-Glu11-Val12-His13-His14-Gln15-Lys16-Leu17-Val18-Phe19-Phe20-Ala21-Glu22

-Asp23-Val24-Gly25-Ser26-Asn27-Lys28-Gly29-Ala30-Ile31-Ile32-Gly33-Leu34

-Met35-Val36-Gly37-Gly38-Val39-Val40-Ile41-Ala42. Peptido Aβ1-40 seka yra

homologiška, tačiau trumpesnė dviem a. r. (Ile ir Ala) C gale. Peptido krūvis yra –3 (minus trys), tačiau jis priklauso nuo terpės pH ir terpės joninių savybių. Šių peptidų molekulės, sudarytos iš hidrofilinių a. r. liekanų N gale ir hidrofobinių aromatinių bei alifatinių a. r. liekanų centrinėje dalyje ir peptido C gale. Manoma, kad centrinė peptido dalis, apie kurią vyksta baltymo lankstymasis, yra išsidėsčiusi tarp Ala21 ir Ala30 a. r. [Lazo et al.,

2005]. Mutacijos, įvykusios šiame centre, yra siejamos su ankstyvąja AL forma, ir vadinamos pagal vietovę, kurioje buvo aptiktos: „Arctic“ Glu22 →

Gly, „Dutch“ Glu22 → Gln, „Italian“ Glu22 → Lys, „Flemish“ Ala21 → Gly

ir „Iowa“ Asp23 → Asn [Nilsberth et al., 2001; Levy et al., 1990; Bugiani et

al.,1998]. Aptinkamos ir retesnės mutacijos arčiau N peptido galo: Ala2 →

Val, „English” His6 → Arg, „Totori-Japanese“ Asp7 →Asn ir vienos a. r.

mutacija peptido C gale Ala42 →Thr [Giaccone et al., 2010; Ono et al.,

2010; Hori et al., 2007; Armstrong et al., 2004].

Aβ peptido monomerai vandeninėje aplinkoje yra nestabilūs, joje pep-tidai sudaro įvairių nestabilių junginių mišinį [Glabe et al., 2008]. Naudojant organinius junginius heksafluorizoproponolį ((CF3)2CHOH) (HFIP) ir

trifluoracetinę rūgštį (CF3COOH) (TFA), pavyko stabilizuoti monomerines

Aβ peptido formas ir nustatyti α spiralių turtingus peptido domenus. Spektrofotometriniu metodu, naudojant trifluoretanolį (CF3CH2OH) (TFE),

nustatyta, kad apie 80 proc. Aβ1-40 peptido sudaryta iš α spiralių [Cizas et

Manoma, kad Aβ peptido 1–16 a. r. domenas yra metalų jonų jungimosi vieta [Miller et al., 2010; Faller et al., 2009]. Šio Aβ peptido domeno sąveika su metalų jonais (Cu2+, Zn2+, Fe3+ ir Al3+) gali būti veiksnys, le-miantis monomerų lankstymosi ar jungimosi į didesnius darinius pradžią [Exley et al., 2006].

1.6 Aβ peptido sankaupų susidarymas

Įvairaus ilgio Aβ peptidų susidarymas organizme yra natūralus fizio-loginis reiškinys. Šie peptidai yra aptinkami sveikų žmonių galvos smege-nyse ir stuburo smegenų skystyje [Walsh et al., 2007;]. Tai rodo, kad patys peptidai nėra AL sukeliantis veiksnys organizme. Tačiau AL vystymąsi gali sukelti pusiausvyros tarp peptidų gamybos ir pašalinimo sutrikimai arba Aβ1-42 peptidų kaupimasis [Citron et al. 1992; Suzuki et al. 1994].

APP baltymo skėlimo metu gaunamos Aβ peptidų monomerinės formos, linkusios jungtis į didesnius darinius. In vitro sąlygomis Aβ peptidai gali formuoti įvarios formos ir dydžio darinius: mažus ir didelius oligomerus, sferines daleles, kanalo tipo poras, cilindrines miceles, fibriles [Lomakin et al., 1996; Yong et al., 2002]. Peptidų agregacijos pradžią gali lemti peptidų koncentracija, pH, joninės jėgos, temperatūra, metalų jonai ar organiniai junginiai. Manoma, kad oligomerų ir fibrilių formavimasis, priklausomas nuo pH, yra susijęs su fizinėmis baltymų savybėmis ir peptidų izolektriniu tašku (pI), kuomet gali keistis peptido krūviai, konformacija ir oligome-rizacija. Peptido monomerų a. r. seka ir jų fizinės savybės lemia monomerų lankstymosi pradžią ir tolesnę oligomerizaciją [Lazo et al., 2005]. Terpės rūgštingumas taip pat svarbus ir fibrilių formavimuisi. Nors jų morfologija nesikeičia, esant pH 1,5, formuojasi ilgesnės fibrilės nei pH 4 [McParland et al., 2000]. Joninė jėga taip pat veikia Aβ peptidų agregaciją. Žemas pH ir stiprios joninės jėgos yra palankesnės fibrilių formavimuisi [McParland et al., 2000; Schmittschmitt et al., 2003]. Terpėse, kuriose joninės jėgos yra skirtingos, formuojasi skirtingos morfologijos peptidų agregatai [McParland et al., 2000]. Aβ peptidų agregaciją taip pat lemia aplinkos temperatūra – monomerų oligomerizacija ir fibrilių ilgėjimas greičiau vyksta aukštesnėje temperatūroje [Lin et al., 2008].

Kai kurie metalai taip pat gali veikti peptidų oligomerizacijos pradžią. Al3+, Fe3+, Cu2+ ir Zn2+ jonai pagreitina peptidų agregaciją in vitro sąly-gomis [Faller et al., 2009]. Manoma, kad metalų jonai taip pat gali lemti skirtingo susilankstymo, konformacijos ar morfologijos agregatų susida-rymą [Dong et al., 2007].

Nors Aβ peptidų agregacija in vivo sąlygomis išlieka nežinoma, dėl tokio sudėtingo ir įvairaus peptido agregatų formavimasis in vitro galima manyti, kad in vivo šių peptidų agregacija taip pat yra įvairiapusė, o agregatai skiriasi savo morfologija ir savybėmis [Matsuzaki et al., 2011].

Ilgą laiką buvo manoma, kad netirpios Aβ fibrilės yra pirminiai molekuliniai AL veiksniai [Hardy et al., 1992], tačiau vėlesni tyrimai atskleidė, kad tirpaus Aβ1-42 oligomero kiekis koreliuoja su sinapsių

pažeidimu ir pažinimo funkcijų sutrikimu graužikų smegenyse [Lue et al., 1999; McLean et al. 1999; Wang et al., 1999].

1.7 Aβ1-40 ir Aβ1-42 monomerų, oligomerų ir fibrilių poveikį lemiantys veiksniai

Toksinis Aβ peptidų poveikis gali pasireikšti skirtingais keliais: tiesio-giai – sukeliant neuronų žūtį, sutrikdant sinapsių veiklą ir netiesiotiesio-giai – aktyvinant kitų tipų ląsteles [Brown et al., 2010]. Tačiau yra svarbu išskirti veiksnius, lemiančius pačių peptidų toksiškumą. Priimta, kad tai yra Aβ peptido ilgis, koncentracija ir forma.

Yra žinoma, kad Aβ1-42 peptidas yra linkęs greičiau jungtis į didesnius

darinius nei Aβ1-40. Manoma, kad ši peptido savybė gali lemti jo

toksiš-kumą. Eksperimentai su Neuro 2A neuroblastomos ląstelių kultūromis parodė, kad Aβ1-42 peptidų agregatai labiau veikė ląstelių gyvybingumą nei

Aβ1-40 agregatai [Dahlgren et al., 2002]. Manzoni C. ir kiti tyrė Aβ1-40 ir

Aβ1-42 peptidų agregatų poveikį pelių neuroblastomos N2c ląstelių

gyvybin-gumui ir pastebėjo, kad Aβ1-42 peptidų agregatai yra toksiškesni už Aβ1-40

agregatus. Tyrėjai savo darbuose naudojo peptidų koncentracijas nuo 500 nM iki 15 µM. Idomu tai, kad autoriai nurodo, jog esant 5µM koncentracijai ląstelių gyvybingumą mažina Aβ1-42 monomerai, o Aβ1-40 monomerai neturi

poveikio net esant 15 µM koncentracijai [Manzoni et al., 2011].

Kitas veiksnys, lemiantis šių peptidų toksiškumą, yra koncentracija. Dauguma tyrėjų Aβ peptido toksiškumo tyrimuose naudoja koncentracijas, siekiančias nuo 5 iki 25 µM [Dahlgren et al., 2002; Manzoni et al., 2011]. Hung L. ir kiti tyrėjai, tirdami, kuris iš Aβ peptiduose esančių domenų, lemia peptido oligomerizacijos pradžią ir toksiškumą, naudojo pirmines žievės neuronų kultūras ir 15 µM agregatų koncentracijas [Hung et al., 2008]. Resende ir kiti tyrėjai, siekdami nustatyti, kurie iš sintetinio Aβ1-42

peptidų oligomerų (šviežiai pagaminti ar seni) toksiškesni žievės neuro-nams, naudojo 5 µM koncentracijas. Tyrėjai nurodo, kad ši 5 µM koncen-tracija sutrikdė sinapsių veiklą [Resende et al., 2008]. Kiti autoriai nurodo,

kad tirdami Aβ agregatų poveikį sinapsių funkcijoms, naudoja 5–100 nm koncentracijas [Klyubin et al., 2008].

Remiantis literatūros šaltiniais, galima teigti, kad Aβ peptido dalelių dydis yra svarbus veiksnys, lemiantis jo toksiškumą. Toksiškai gali veikti visos Aβ1-42 peptido formos (monomerai, oligomerai ir fibrilės) [Manzoni et

al., 2011], tačiau toksiškumo laipsnis nevienodas. Naudojant neuro 2A ląstelių liniją nustatyta, kad Aβ1-42 oligomerai ląstelių gyvybingumą slopina

10 kartų stipriau negu fibrilės ir 40 kartų stipriau negu monomerai [Dahl-gren et al., 2002]. Autoriai nurodo, kad Aβ1-42 oligomerai toksiškiau veikė

žievės neuronus, sukeldami sinapsių sutrikimus ir kalciokiekio padidėjimą citoplazmoje nei fibrilės [Resende et al., 2008]. Teigiama, kad toksiš-kiausios peptido dalelės yra nuo dimero ir trimero iki dodekamero (dvylikos peptidų). Elektrofiziologiniais eksperimentais nustatyta, kad Aβ1-42 peptido

trimerai slopina ramybės potencialą hipokampo neuronuose [Townsend et al., 2006], o dimerai ir tetramerai jungiasi su šių neuronų fosfolipidine membrana ir sutrikdo jos vientisumą [Hung et.al., 2008].

Ne mažiau svarbus toksiškumo veiksnys, yra abiejų Aβ peptidų santykis. Manoma, kad oligomerizuojantis jungiasi abiejų tipų peptidai. Nustatyta, kad abiejų Aβ peptidų mišinyje Aβ1-40 peptido oligomerizacija slopina mažų

Aβ1-42 peptidų oligomerų susidarymą ir didina didelių oligomerų

(dode-kamero) susidarymą in vitro [Murray et al., 2009]. Peptidų oligomerizacijos sparta priklauso nuo peptidų santykio [Kuperstein et al., 2010]. Autoriai naudodami hipokampo neuronus, tyrė peptidų santykio pokyčius sinapsių funkcijoms. Tyrėjai pastebi, kad nematė poveikio sinapsių funkcijoms esant 1:9 (Aβ1-42 : Aβ1-40) peptidų agregatų santykiui, o labiausiai sinapsnių veika

sutriko esant 3:7 Aβ1-42 ir Aβ1-40 peptido agregatų santykiui [Kuperstein et

al., 2010].

Nors šiuo metu yra sukaupta daug žinių apie Aβ peptidų sukeliamą toksinį poveikį, priklausomą nuo peptidų ilgio, koncentracijos ir santykio tarp peptidų, tačiau, kaip šį toksiškumą lemia dalelių dydis, dalelių susilankstymas ir konformacija, aiškaus atsakymo nėra.

1.7.1 Išorinis Aβ1-40 ir Aβ1-42 peptidų agregatų poveikis ląstelių gyvybingumui

Daugumoje tyrimų naudojamos ląstelių kultūros, kurių augimo terpės, papildytos sintetiniu Aβ peptidu. Tokiomis sąlygomis yra vertinamas telės išorėje esančių peptidų poveikis. Aβ oligomerai veikia visų tipų ląs-teles (mikroglijos, astrocitų), tačiau jautresnės jiems yra neuroninės ląstelės

[Ebenezer et al., 2010]. Pirminėje žievės neuronų-glijos ląstelių kultūroje oligomerai toksiškai pirmiausia veikė neuronines ląsteles, o poveikio as-trocitams nebuvo net kelis kartus padidinus toksiškojo oligomero koncent-raciją [Ebenezer et al., 2010].

Vienas iš galimų oligomero veikimo kelių yra tiesioginė Aβ saveika su ląstelės paviršiaus receptoriais. Bateman ir kitų tyrėjų grupė tirdami peptidų Aβ1-40 ir Aβ1-42 oligomerizacijos greitį nustatė, kad Aβ1-42 oligomerai

greičiau jungėsi prie ląstelės paviršiaus baltymų nei Aβ1-40 oligomerai.

Jungimosi su ląstelės paviršiaus baltymais nebuvo stebima naudojant Aβ1–42

peptido mutantą, linkusį mažiau agreguotis [Bateman et al., 2007]. Šiame darbe tyrėjai taip pat nurodo, kad po Aβ peptidų prisijungimo prie pavir-šiaus baltymų, vyksta tolesnė jų oligomerizacija ant ląstelės pavirpavir-šiaus. Autoriai teigia, kad peptidų prisijungimas prie ląstelės paviršiaus baltymų sumažėjo ląsteles paveikus tripsinu [Bateman et al.,2007]. Manoma, kad Aβ peptidų jungimasis su ląstelės paviršiaus baltymais gali sukelti membranoje esančių kanalų veikimo sutrikimus ir skatinti peptidų pernašą į ląstelę. Nustatyta, kad Aβ oligomerai gali jungtis su N-metil-D-aspartato (NMDA) ir α7 acetilcholino (α7nAChR) receptoriais, sukelti kalcio jonų prietaką į ląstelės vidų, sutrikdančią kalcio homeostazę [Shankar et al.,2007; Lee et al., 2003; Demuro et al., 2010].

Manoma, kad Aβ peptidai gali jungtis su plazminės membranos fosfo-lipidais. Autoriai nurodo, kad jungiasi tik oligomerai, fibrilės šios savybės neturi (Williams et al., 2011b). Eksperimentai in vitro parodė, kad Aβ1-42

oligomerai jungiasi su įvairių tipų dirbtinėmis fosfolipidinėmis membrano-mis ir formuoja poros tipo kanalus [Capone et al., 2012; Williams et al., 2011a; Hilal et al., 2006]. Šių kanalų susiformavime dalyvauja beta klos-tėmis turtingi Aβ peptidai. Kanalo išorinis diametras siekia 8–10 nm, o vidinis – 2 nm. [Quist et al. 2005]. Kaip vyksta įsiskverbimas į membraną ir ar nekinta pačių kanalų savybės lieka nežinoma (Capone et al., 2012]. Manoma, kad šių kanalų susidarymas gali sutrikdyti ląstelės jonų homeo-stazę ir taip veikti toksiškai. Parodyta, kad kanalų susiformavimas pa-gumburio neuronuose padidino už ląstelės ribų esančio kalcio jonų patekimą į ląstelės vidų [Singer et al., 2006]. Nors šių kanalų susiformavimas pirmą kartą aprašytas 1993 metais, žinių apie tai, kaip jie formuojasi ir veikia in

vivo sąlygomis, nėra.

Aβ peptidai taip pat gali veikti netiesiogiai. Autoriai teigia, kad neuronai yra jautresni Aβ1-42 oligomerų poveikiui nei mikroglijos ar astrocitų ląstelės

[Ebenezer et al., 2010], tačiau Aβ1-42 oligomerai taip pat veikia ir šias

ląsteles [Orellana et al. 2011]. Manoma, kad toksinis oligomerų poveikis yra sukeliamas ne tiesiogiai veikiant neuronus, o aktyvinant mikroglijos ląsteles [Maezawa et al., 2011]. Šių ląstelių aktyvinimas gali būti lydimas

užde-giminio atsako [Orellana et al., 2011; Maezawa et al., 2011], fagocitozės ir neuronų nykimo [Neniskyte et al., 2011].

Aktyvintų mikroglijos ląstelių aptinkama AL sergančiųjų smegenyse, taip pat šios ligos pelių modeliuose. Šios aktyvintos ląstelės susitelkia šalia amiloidinių plokštelių sankaupų [Perlmutter et al. 1990; Frautschy et al. 1998]. Naudojant fluorescencinius vaizdinimo metodus AL pelių mode-liuose nustatyta greita (1–2 dienos) ląstelių migracija į naujai susidariusių fibrilių sankaupų vietas [Bolmont et al., 2008; Meyer-Luehmann et al. 2008;]. Šių ląstelių kiekis didėjo proporcingai didėjant amiloidinių plokš-telių sankaupoms, ir nebuvo susijęs su ląsplokš-telių proliferacija [Ajami et al., 2007].

Mikroglijos ląstelės smegenyse atlieka fagocitozės, antigenų pateikimo, citokinų gamybos ir kitas funkcijas. Teigiama, kad esant Aβ1-42 oligomerų

koncentracijoms, kurios nėra tiesiogiai toksiškos hipokampo neuronams, aktyvinama mikroglija, kuri gali išskirti neurotoksinius veiksnius, galinčius pažeisti neuronų sinapsių vientisumą [Maezawa et al., 2011]. Veikiamos Aβ peptidų agregatų mikroglijos ląstelės išskiria uždegimą skatinančias ir slopinančias molekules, tokias kaip IL-1β, IL-6,TNF-α, IL-8,TGF-β, MIP-1α, o tai pat aktyvias deguonies formas (ROS) ir azoto monoksidą (NO) [Sastre et al.,2006a], kurios, galbūt, pažeidžia neuronus ir gali sukelti jų žūtį. Manoma, kad Aβ peptidų oligomerai ir fibrilės skatina skirtingus mikroglijos aktyvacijos kelius, lemiančius neuronų žūtį [Sondag et al., 2009]. Astrocituose Aβ1-42 oligomerai sukėlė greitą uždegiminių molekulių

išskyrimą, tuo tarpu fibrilių poveikis buvo labiau lėtinis ir uždegiminių molekulių kiekis mažesnis [White et al., 2005].

Viena iš mikroglijos ląstelių funkcijų yra žuvusių ar žūstančių ląstelių pašalinimas. Naujausi duomenys rodo, kad tokios aktyvintos ląstelės da-lyvauja ne tik žuvusių neuronų pašalinime, bet gali fagocituoti ir gyvus neuronus [Neniskyte et al., 2011]. Šie tyrėjai, naudodami pirminę smege-nėlių neuronų kultūrą, nustatė, kad mikroglija fagocituoja gyvus neuronus. Autoriai teigia, kad signalas fagocituoti neuronus, susijęs su neuronų fosfatidilserino išsivertimu į plazminės membranos išorinę pusę.

Išsamių žinių apie mechanizmus, kaip Aβ agregatai aktyvina mikroglijos ląsteles, kaip tai susiję su dalelių dydžiu ir kaip sukeliama neuronų žūtis, nėra.

1.7.2 Aβ1-42 oligomerų sukelto kalcio jonų kiekio padidėjimo neuronuose poveikis

Kalciojonų homeostazė yra svarbus veiksnys ląstelių fiziologinėms funk-cijoms palaikyti. Kalciojonai neuronuose yra svarbūs plazminės membranos įtampai, neurotransmiterių išskyrimui, genų raiškai, neuronų augimo reguliavimui ar apoptozės mechanizmui [Bezprozvanny et al., 2008]. Neuronų aktyvinimas yra siejamas su kalciojonų koncentracijos padidėjimu ląstelės viduje, kai kalcio jonai patenka ir iš išorės, ir iš viduląstelinių rezervų. Neuronų signalizacija, susijusi su kalcio jonais, yra sudėtingas mechanizmas, kuriame dalyvauja plazminėje membranoje esantys, nuo įtampos priklausantys, kalcio kanalai, NMDA receptoriai, TRP (transient receptor potential) kanalai, taip pat endoplazminio tinklo kalcio kanalai, reguliuojami IP3R (inositolio trifosfato receptorius), RyR (rianodino receptorius), atpalaiduojantys endoplazminiame tinkle esančius kalcio jonus [Bezprozvanny et al., 2008]. Mitochondrijos taip pat atlieka svarbų vaidmenį neuronų signalo perdavime. Jų geba sugerti kalcio jonus yra svarbi neuronų fiziologinėms funkcijoms. Kalcio jonai mitochondrijose jungiasi su kalciui jautriomis dehidrogenazėmis, stimuliuoja metabolizmo procesus, didina energijos gamybą, tačiau per didelis kalcio kiekis gali sukelti nespecifinio laidumo poros susidarymą ir apoptozę [Spät et al., 2008; Gellerich et al., 2010]. Manoma, kad Aβ peptidai gali jungtis su ląstelės plazminės membranos fosfolipidais ar joje esančiais baltymais ir sutrikdyti jos vientisumą ir plastiškumą. Kalcio jonų pusiausvyros sutrikimai ląstelėje yra susiję su oksidaciniu stresu, mitochondrijų fiziologinės būklės blogėjimu ir ląstelės žūtimi. Naudojant žmogaus neuroblastomos SH-SY5Y ląstelių liniją parodyta, kad Aβ1-42 oligomerai greičiau sutrikdo membranos

vien-tisumą ir ląstelės išorėje esančio kalcio patekimą į ląstelės vidų, negu šio amiloido monomerai ir fibrilės [Demuro et al., 2005]. Vienas iš galimų vei-kimo mechanizmų yra Aβ peptidų formuojama pora pro kurią nevaldomai gali patekti kalcio jonai [Arispe et al., 1993; Demuro et al., 2005].

Kitas mechanizmas, dėl kurio Aβ peptidai gali sukelti išorinio kalcio pa-tekimą į citozolį, siejamas su membranos fosfolipidų peroksidacija [Mattson et al., 2004]. Manoma, kad Aβ peptidų oligomerizacijos metu susidaro van-denilio peroksidas ir šį procesą sustiprina geležies ir vario jonai [Huang et al., 1999]. Lipidų peroksidacijos metu susidaro 4-hidroksinonenolis (C9H16O2), kuris toksiškai veikia ląsteles. Lipidų peroksidacijos metu

susi-daręs 4-hidroksinonenolis sutrikdė nuo kalcio priklausomas ATP-azes, gliukozės ir glutamato pernašą pirminėse hipokampo ir žievės neuronų kul-tūroje, (Aβ 10µM) sukėlė sinapsių nykimą ir neuronų degeneraciją [Mark et al., 1997].

Nors yra žinoma, kad Aβ agregatai keičia kalcio pusiausvyrą ląstelėse, tačiau poveikio mechanizmai ir atsakas išlieka nežinomi, reikalaujantys išsamesnių tyrimų.

1.7.3 _{Aβ oligomerų poveikis sinapsių funkcijoms}

Manoma, kad tiek sintetiniai, tiek naturalūs Aβ oligomerai gali sukelti sinapsių pažeidimus. Eksperimentuose in vivo sąlygomis, esant Aβ peptidų koncentracijoms, tokiom pat kaip ir AL sergančių žmonių smegenyse, tik Aβ oligomerai sutrikdė sinapsių funkcijas, monomerai ir fibrilės poveikio neturėjo [Walsh et al., 2002]. Tyrėjams pavyko nustatyti, kad tirpūs Aβ oligomerai (dimerai ir trimerai), sutrikdo hipokampo piramidinių neuronų ramybės potencialą, sumažina dentritinių spyglių kiekį, o taip pat mažina aktyvių sinapsių kiekį [Walsh et al., 2002]. Manoma, kad tai susiję su Aβ oligomerų sukeltu sinapsėse esančių vezikulių atpalaidavimo į tarpsinapsinę erdvę sutrikimu, NMDA receptorių pažeidimu ir kofilino bei kalcineurino aktyvinimu, nors tikslus veikimo mechanizmas nėra išaiškintas [Shankar et al., 2007].

1.7.4 Viduląstelinis Aβ oligomerų poveikis. Endocitozė

Aβ peptidų oligomerizacijos mechanizmai ląstelės viduje nėra žinomi. Manoma, kad už ląstelės ribų atpalaiduoti peptidai endocitozės pagalba arba tarpininkaujant receptoriams ir pernašos baltymams, patenka į ląstelės vidų. Eksperimentai naudojant HeLa ląsteles atskleidė, kad Aβ1-42 oligomerai

endocitozės būdu patenka į ląstelės vidų ir toliau yra pernešami į lizosomas [Chafekar et al.,2008]. Aβ peptidų pernešimą neuroblastomos ląstelėse reguliuoja dinamino ir RhoA baltymai [Yu et al., 2010]. Peptidų kaupimasis lizosomose, ar per lėtas ardymo procesas, didina fiziologiškai nenormalių lizosomų susidarymą, ir jose esančių hidrolazių sintezę. Kaip manoma, vienas iš veiksnių, lemiantis tokių nenormalių lizosomų susidarymą, yra Aβ oligomerų veikiamos ubikvitino proteosominės sistemos slopinimas. Sutrikusi šių pūslelių veikla gali sukelti jose esančių fermentų patekimą į ląstelės citoplazmą, taip sukeliant ląstelės žūtį. Peptidų pašalinimo kelio sutrikimai galbūt veikia ir APP baltymo skaidymą. Manoma, kad APP labiau skaidomas amiloidogeniniu keliu susidarant Aβ peptidams, taip dar labiau didina Aβ peptidų gamybą [Chafekar et al.,2008; Yao et al., 2005; St John et al., 2007].

1.7.5 Aβ poveikis mitochondrijoms

Toksinį Aβ peptidų poveikį, siejamą su mitochondrijomis, galėtume suskirstyti į poveikį išorinei ir vidinei membranai, tarpmembraninei erdvei, ir matriksui (užpildui).

Manoma, kad Aβ peptidai gali tiesiogiai arba netiesiogiai slopinti baltymus, dalyvaujančius medžiagų pernešime į mitochondrijų vidų ar iš jo. Hansson P. ir kiti tyrėjai nustatė, kad Aβ agregatai jungiasi su TOM 40 (translocase of the outer membrane) ir TIM 22 (translocase of the inner membrane) baltymais [Hansson et al., 2008]. Gali būti, kad ilgalaikis susijungimas su šiais baltymais palaipsniui sukelia pusiausvyros sutrikimus tarp baltymų pernašos į mitochondrijas ir iš jų [Pagani et al., 2011]. Manoma, kad Aβ peptidai taip gali būti pernešami į mitochondrijų matriksą, atpalaiduojami ir veikti mitochondrijų genų raišką bei baltymų sintezę [Hansson et al., 2008]. Naudojant proteomikos ir masių spektrometrijos metodą AL pelių modeliuose nustatyta, kad Aβ peptidai sutrikdė 24 baltymų veiklą mitochondrijose, iš kurių viena trečioji dalis, susijusi su oksdidacinio fosforilinimo sistema [Rhein et al., 2010].

Mitochondrijos yra dinamiškos organelės, kuriose nuolat vyksta susi-liejimo ir skilimo procesai. Sutrikęs susisusi-liejimo procesas veda prie per di-delio mitochondrijų ilgėjimo, o sutrikęs skilimo procesas – prie organelės fragmentacijos [Chen et al., 2003; Chen et al., 2005; Hoppins et al., 2007]. Šių dviejų procesų reikšmė mitochondrijų funkcijoms skirtinga. Mitochond-rijų skilimas leidžia organelėms atsinaujinti, persiskirstyti, tuo tarpu susi-liejimas palengvina judėjimą, paplitimą aksonuose ir sinapsėse [Chen et al., 2007; Baloh et al., 2007a;b]. Manoma, kad šių procesų pusiausvyros su-trikdyme gali dalyvauti Aβ peptidai [Wang et al., 2008]. Nustatyta, kad Aβ oligomerai didina mitochondrijų skilimo baltymų Fis 1 (fission 1) ir Drp 1 (dynamin-related protein 1) genų raišką, o taip pat mažina susiliejimo bal-tymų Mfn 1 (mitofusin 1), Mfn 2 (mitofusin 2) ir Opa 1 (optic atrophy 1) genų raišką AL pelių modelių hipokampo neuronuose [Manczak et al., 2011]. Modifikuotose neuroblasotmos lastelėse su APP „švediška“ mutacija, tyrėjai nustatė fragmentuotas mitochondrijas ir mažesnį ATP kiekį negu ląstelėse be šios mutacijos [ Wang et al., 2008].

Manoma, kad Aβ peptidai veikia ir mitochondrijų energetinę būklę. Energetinės būklės blogėjimas, apibrėžiamas kaip mitochondrijų elektroche-minio potencialo, taip pat IV komplekso aktyvumo ir ATP kiekio mažė-jimas, buvo nustatytas AL pelių modeliuose su „švediška“ ir „Londono“ APP mutacijomis [Hauptmann et al., 2009]. Šiose pelėse taip pat buvo rastas padidėjęs ROS kiekis bei pakitęs baltymų Bcl-xL/Bax santykis. Kiti

tyrėjai šio modelio pelėse nustatė padidėjusį lipidų peroksidacijos produkto 4-hidroksinonenolio, kiekį ir sumažėjusį superoksido dismutazių aktyvumą [Cho et al., 2009]. Yao vadovaujama tyrėjų grupė, tirdama energetinę izoliuotų mitochondrijų būklę išskirtų iš transgeninių 3xTg-AD pelių embrionų hipokampo neuronų, nustatė, kad Aβ peptidai mažina kvėpavimo greitį, piruvato dehidrogenazės ir citochromo c oksidazės kiekį ir aktyvumą [Yao et al., 2009].

Mitochondrijų nespecifinės pralaidumo poros susidarymas (MNPP) yra vienas iš veiksnių, galinčių sukelti ląstelės žūtį. Šios poros sudarymo metu mitochondrijose prarandamas elektrocheminis potencialas, mažėja ATP gamyba, į citozolį atpalaiduojami apoptozę sukeliantys baltymai citochro-mas c, Smac/Diablo ir kt. [Hengartner et al., 2000]. Vienas iš šio kanalo komponentų yra baltymas ciklofilinas D. Tiriant šio baltymo pasiskirstymą transgeninių pelių smegenų žievės neuronuose, pastebėta, kad jis jungiasi su Aβ peptidais ir yra pernešamas iš matrikso prie vidinės mitochondrijų membranos [Du et al., 2011]. Gali būti, kad šio baltymo pernešimas prie membranos yra žingsnis tolimesniam poros formavimuisi [Bernardi et al., 2006].

Kitas mitochondrijų matrikso baltymas, su kuriuo jungiasi Aβ peptidai, yra ABAD (β-peptide-binding alcohol dehydrogenase) [Yan et al., 1997]. Aβ peptidai specifiškai jungiasi su ABAD [Lustbader et al., 2004] ir sutrikdo jos veiklą AL sergančiųjų smilkinio zonos neuronų, o taip pat – AβPP transgeninių pelių neuronų mitochondrijose [Yan et al., 1997]. Manoma, kad Aβ peptidų prisijungimas padidina ROS ir NO gamyba ir blogina mitochondrijų energetinę būklę [Spahn et al., 2004]. Šių baltymų susijungimo slopinimas neuronų kultūrose ir AL pelių modeliuose sumažino ROS generaciją [Lustbader et al., 2004; Yao et al., 2011]. Nustatyta, kad Aβ oligomerai taip pat mažina izoliuotos ABAD aktyvumą [Lustbader et al., 2004]. Aβ peptido ir ABAD komplekso kristalografinė struktūrinė analizė parodė, kad šio komplekso susidarymas slopina NAD+ prisijungimą prie ABAD, keičia membranos laidumą [Aleardi et al., 2005] ir mažina kvėpa-vimo grandinės fermentų aktyvumą [Lustbader et al., 2004], kuris vėliau gali sukelti mitochondrijų sutrikimus.

Nors yra žinoma, kad Aβ peptidai jungiasi su ABAD ir neigiamai veikia mitochondrijų funkcijas, tačiau išlieka nežinoma, kurie iš Aβ peptidų agregatų slopina ABAD ir kaip šis slopinimas sukelia neuronų žūtį.

1.8 Aβ poveikis aktyvių deguonies junginių susidarymui

Fiziologinėmis sąlygomis ROS gamyba yra neatskiriama organizmo ir atskiros ląstelės gyvavimo dalis, kadangi ROS dalyvauja signalo perdavime, organizmo apsaugoje nuo mikroorganizmų ar svetimų baltymų. ROS homeostazės sutrikimas yra siejamas su amžiumi, hipoksija (insultas), diabetu, traumomis ar toksinais [Guglielmotto et al., 2010]. Streso metu smegenyse stebimas padidėjusi ROS gamyba. Manoma, kad oksidacinis stresas ir Aβ peptidai tarpusavyje glaudžiai susiję. Peptidų agregacija prisideda prie oksidacinio streso sukėlimo, o oksidacinis stresas gali didinti Aβ gamybą in vitro ir in vivo [Harkany et al. 2000]. Imunocheminiais metodais nustatyta, kad oksidacinį stresą sukeliantys veiksniai prisideda prie APP baltymo raiškos žiurkių hipokampo astrocituose [Cheng et al., 2004], tai pat prie APP baltymo ir Aβ peptidų gamybos žiurkės ir beždžionių akies lęšiukų ląstelių kultūrose [Frederikse et al., 1996]. Manoma, kad lipidų peroksidacijos produktas 4 hidroksinonenolis didina β sekretazės BACE aktyvumą NT2 neuronuose [Tamagno et al., 2005]. Egzistuoja koreliacija tarp 4-hidroksinonenolio kiekio ir BACE 1 aktyvumo AL segančiųjų smegenyse [Borghi et al., 2007].

Nors yra žinoma, kad oksidacinis stresas prisideda Aβ peptidų gamybos padidėjimo ir kaupimosi, tačiau mechanizmai, kuriais aktyvinama ši peptidų gamyba ir kaupimasis nėra atskleisti.

1.9 Aβ peptido agregatų pašalinimo keliai

Manoma, kad galvos smegenyse Aβ peptidai gali būti šalinami dviem būdais: 1) Tirpių peptidų darinių pernaša iš smegenų į organizmo periferiją; 2) proteolitinis tirpių ir fibrilinių agregatų pašalinimas smegenyse. Manoma, kad Aβ peptidų formų pernaša iš smegenų taip pat vyksta dviem keliais: per kraujo smegenų barjerą (KSB), dalyvaujant LRP1 (mažo tankio lipopro-teinas 1); iš likvoro į limfinę sistemą ir iš jos per KSB, dalyvaujant PgP (P glikoproteinas) [Bell et al., 2007, Deane et al., 2007]. Smegenyse užląs-telinių Aβ peptidų agregatus ardo įvairių tipų proteazės – neprilisinas, in-suliną degraduojantis fermentas (IDE) ir kt. [Malito et al., 2008]. Manoma, kad Aβ fibrilės taip pat gali būti fagocituojamos mikroglijos ląstelių, tačiau nėra žinoma, kodėl įvairių tipų (formų) amiloidinės plokštelės fagoci-tuojamos skirtingai [D’Andrea et al., 2004]. Fagocitozės ar pinocitozės būdu į lastelės vidų patekę peptidai toliau ardomi lizosomose [D’Andrea et al., 2004].

Literatūrinėje dalyje apžvelgėme pasiekimus, kurie padeda atskleisti AL biocheminius procesus. Daugumos autorių darbai atlikti naudojant dideles Aβ peptidų agregatų koncentracijas, AL pelių modelius, dirbtines ląstelių kultūrų linijas ar genų ir baltymų raiškos tyrimus, negali pilnai atskleisti, kaip veikia Aβ peptidai esant koncentacijoms, artimoms AL, kokią įtaką daro dalelių dydis, susilankstymas ir konformaciniai pokyčiai, ląstelių tipai ir kiti veiksniai, galintys veikti ląstelių gyvybingumą.

2.

_METODAI

Visų tyrimų metu, jei nenurodyta kitaip, buvo naudoti „Sigma-Aldrich“ firmos reagentai.

2.1 Ląstelių kultūros

2.1.1 Žiurkės smegenėlių neuronų kultūros paruošimas

Eksperimentams buvo naudojami „Wistar“ veislės žiurkių, 6–8 dienų amžiaus, naujagimiai. Gyvūnėliai buvo užmigdomi CO2 dujomis, o po to

dekapituojami (Valstybinės veterinarinės tarnybos leidimas darbui su labo-ratoriniais gyvūnais Nr. 0006). Prakirpus kaukolės viršutinę dalį nuimami pakauškaulio ir momenkaulio kaulai. Galvos smegenys išimamos ir deda-mos į Petri lėkštelę su atšaldytu iki 4 ºC temperatūros fosfatinių druskų bu-feriu (PBS), papildytu 13 mM gliukozės ir 0,5 ml antibiotiko penicilino-streptomicino tirpalu 50-čiai ml terpės. Tuomet nuo likusių galvos smegenų skalpeliu atskiriama smegenėlių zona ir perdedama į kitą Petri lėkštelę su PBS tirpalu. Šioje lėkštelėje nuvalomos smegenėles dengiančios krauja-gyslės, smegenėlės perdedamos į kitą Petri lėkštelę su PBS tirpalu ir aštriu skalpeliu yra sukapojamos į mažesnius gabaliukus. Gauti smegenėlių gaba-liukai sterilia 5 ml pipete perkeliami į mėgintuvėlį su 5 ml Verseno tirpalu (1:5000) pašildytu iki 37 ºC temperatūros ir inkubuojami 5 min., retkarčiais sujudinant. Po inkubacijos mišinys yra švelniai trituruojamas sterilia 2 mm diametro pipete, paskui 1 mm diametro Pastero pipete. Gautas trituratas perpilamas į sterilų 50 ml tūrio mėgintuvėlį. Likusioji, nesuardyto audinio dalis, užpilama 7 ml 37 ºC temperatūros Verseno tirpalu ir trituruojama su 0,5 mm diametro Pastero pipete. Abu trituratai supilami į vieną mėgintuvėlį. Mėgintuvėlis su trituratu centrifuguojamas 270×g 5 min. centrifugoje („Ep-pendorf 5810R“), atšaldytoje iki 4 ºC temperatūros. Gautas supernatantas nupilamas, o nuosėdos užpilamos 5 ml ląstelių kultūrų auginimo terpe DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), papildyta 5 proc. arklio serumu, 5 proc. jaučio serumo albuminu, 13 mM gliukozės, 2 mM gluta-mino, 20 mM kalio chlorido bei 0,5 ml penicilino-streptomicino tirpalu 50-čiai ml terpės ir švelniai trituruojant sumaišomos. Toliau ląstelių suspensija filtruojama pro sterilų, 40 µm poros diametro tinklelį.

Ląstelių kiekiui ir gyvybingumui įvertinti naudojome hemocitometrą ir tripano mėlio dažą (TM). Į mėgintuvėlį su 10 µl ląstelių suspensijos buvo pridedama 10 µl TM. Ląstelių ir TM mišinys pipete buvo pernešamas ant

hemocitometro kameros, padengtos dengiamuoju stikleliu. Skaičiuojamos gyvos, mėlynai nenusidažiusios ląstelės. Ląstelės skaičiuojamos pagal inst-rukciją, pateiktą su hemocitometru: suskaičiuojamos ląstelės, esančios ketu-riuose kvadratuose, jos sumuojamos ir dauginamos iš 4 (ląstelių skaičius skaičiuojamas 16-oje kvadratų), toliau dauginama iš 2 (skiedimų skaičius) ir dauginama iš 6000 (vieno kvadrato tūrio dalis mililitre). Gautas skaičius yra gyvų ląstelių kiekis viename mililitre. Toliau ląstelių skaičius dauginamas iš gauto ląstelių suspensijos tūrio. Gyvų ląstelių suspencija yra skiedžiama kultūrų auginimo terpe, kol pasiekiamas ląstelių tankis 1 000 000 ląstelių viename mililitre.

Prieš ląstelių sėjimą paruošiamos 24 šulinėlių lėkštelės. Šulinėliai paden-giami polilizinu: į šulinėlius įpilama po 0,4 ml 0,001 proc. polilizino tirpalo. Tirpalas laikomas 40 min., po to švelniai nusiurbiamas ir užpilama bidis-tiliuoto vandens. Prieš ląstelių sėjimą vanduo pašalinamas. Ląstelės sėjamos 250000 ląstelių/cm2 tankiu. Ląstelės auginamos inkubatoriuje (Heraeus) 37 ºC temperatūroje, atmosferos slėgio oro mišinyje, papildytame 5 proc. CO2

dujomis. Po 6–7 dienų ląstelių kultūra yra tinkama tolimesniems tyrimams. Ląstelių išskyrimo ir auginimo darbai atliekami sterilioje aplinkoje (lami-naras „Lamair“), naudojant sterilius instrumentus ir terpes.

2.1.2 Žiurkės smegenų žievės neuronų paruošimas

Eksperimentams buvo naudojami „Wistar“ veislės žiurkių, vienos dienos amžiaus, naujagimiai. Gyvūnėliai buvo užmigdomi CO2 dujomis, o po to

dekapituojami. Prakirpus kaukolės viršutinę dalį nuimami pakauškaulio ir momenkaulio kaulai. Galvos smegenys išimamos ir dedamos į Petri lėkštelę su atšaldytu iki 4 ºC temperatūros fosfatinių druskų buferiu (PBS), papildytu 13 mM gliukozės ir 0,5 ml penicilino-streptomicino tirpalu 50-čiai ml terpės. Tuomet nuo didžiųjų pusrutulių, skalpeliu atskiriama žievės zona ir perdedama į kitą Petri lėkštelę su PBS tirpalu. Šioje lėkštelėje nuvalomos kraujagyslės, žievė perdedama į kitą Petri lėkštelę su PBS tirpalu ir aštriu skalpeliu yra sukapojama į mažesnius gabaliukus, kurie sterilia 5 ml pipete perkeliami į mėgintuvėlį su 5 ml Verseno tirpalu (1:5000), pašildytu iki 37 ºC temperatūros. Mėgintuvėlis su Verseno tirpalu ir audiniu inkubuojamas 5 min. 37 ºC temperatūroje, švelniai sujudinant. Po inkubacijos mišinys yra švelniai trituruojamas sterilia 2 mm diametro pipete, paskui 1 mm diametro Pastero pipete. Gautas trituratas perpilamas į sterilų 50 ml tūrio mėgintuvėlį. Likusioji, nesuardyto audinio dalis, užpilama 7 ml 37 ºC temperatūros Ver-seno tirpalu ir trituruojama su 0,5 mm diametro Pastero pipete. Abu

trituratai supilami į vieną mėgintuvėlį. Mėgintuvėlis su trituratu centrifu-guojamas 250×g 5 min. centrifugoje („Eppendorf 5810R“), atšaldytoje iki 4 ºC temperatūros. Gautas supernatantas nupilamas, o nuosėdos užpilamos 5 ml kultūrų terpe „Neurobasal“ (GIBCO), papildyta 1 ml B-27 priedu, 13 mM gliukozės, 2 mM glutamino, 20 mM kalio chlorido bei 0,5 ml peni-cilino-streptomicino tirpalu 50-čiai ml terpės ir švelniai trituruojant sumai-šomos. Toliau ląstelių suspensija filtruojama pro sterilų, 40 µm poros dia-metro, tinklelį. Tolesni ląstelių gyvybingumo nustatymo, sėjimo ir auginimo darbai atliekami kaip nurodyta smegenėlių neuronų kultūros paruošimo apraše.

2.1.3 Pelių J774 makrofagų kultūros paruošimas

J774 ląstelės yra pelių makrofaginių ląstelių kultūra auginama DMEM terpėje papildytoje 5 proc. jaučio serumu ir 0,5 ml penicilino-streptomicino tirpalu 50-čiai ml terpės. Ląstelės laikomos inkubatoriuje (Heraeus) 37 ºC temperatūroje atmosferos slėgio oro mišinyje, papildytame 5 proc. CO2

dujomis.

2.2 Aβ1-40 ir Aβ1-42 peptidų agregatų paruošimas

Sintetiniai Aβ1-42 ir Aβ1-40 peptidai buvo gauti iš Bachem (Šveicarija) ir

American Peptide (JAV).

2.2.1 Aβ oligomerų paruošimas (I protokolas)

1 mg Aβ1-40 arba Aβ1-42 peptidų buvo ištirpinamas 400 µl

1,1,1,3,3,3-He-xafluor-2-propanol (heksafluorizoproponolis HFIP) kambario tempera-tūroje. Toliau į silikonizuotą mėgintuvėlį įpilama 900 µl bidistiliuoto vandens bei 100 µl paruošto HFIP ir peptidų tirpalo. 20 min. inkubuojama kambario temperatūroje, po to tirpalas centrifuguojamas 15 min. 12000 aps./min. greičiu (centrifuga „Eppendorf 5414“). Po centrifugavimo super-natantas perpilamas į kitą silikonizuotą mėgintuvėlį. Traukos spintoje išgarinamas HFIP, kol tirpalo tūris sumažėja 100 µl. Po išgarinimo Aβ tirpalas buvo inkubuojamas 24 arba 48 val. 20 ºC temperatūroje vandens vonioje, švelniai judinant mėgintuvėlį. Šiuo būdu gautų Aβ oligomerų dydis buvo vidutiniškai 1–4 nm. Gauti oligomerų tirpalai išpilstomi ir užšaldomi –20 °C temperatūroje.

2.2.2 Aβ oligomerų paruošimas (II protokolas)

1 mg Aβ1-40 arba Aβ1-42 peptidų buvo ištirpinamas 400 µl HFIP

kambario temperatūroje. Toliau į paprastą mėgintuvėlį (nesilikonizuotą) įpilama 900 µl bidistiliuoto vandens ir 100 µl paruošto HFIP ir peptidų tirpalo, 20 min. inkubuojama kambario temperatūroje, po to tirpalas centrifuguojamas 15 min. 12000 aps./min. greičiu (centrifuga „Eppendorf 5414“). Po centrifugavimo supernatantas perpilamas į kitą nesilikonizuotą mėgintuvėlį. HFIP išgarinamas švelniai pučiant azoto srovę (7 min.). Po išgarinimo Aβ tirpalas inkubuojamas 24 val. kambario temperatūroje vandens vonioje, švelniai judinant mėgintuvėlį. Šiuo būdu gautų oligomerų dydis buvo vidutiniškai 4–10 nm. Gauti Aβ oligomerų tirpalai išpilstomi ir užšaldomi –20 °C temperatūroje.

2.2.3 Aβ oligomerų paruošimas (III protokolas)

0,3 mg Aβ1-42 peptidų buvo ištirpinama 33 µl HFIP kambario

tempe-ratūroje, nesilikonizuotame mėgintuvėlyje. Po ištirpinimo išgarinamas HFIP. Po išgarinimo mėgintuvėlis papildomas 33 µl 100 mM NaOH tirpalu. Tirpalas 30 min. laikomas kambario temperatūroje. Po to įpilama 800 µl 10 mM Na2HPO4. Toliau gautas tirpalas dvi paras laikomas kambario

tem-peratūroje. Paruoštas tirpalas saugomas 4 °C temtem-peratūroje.

2.2.4 Aβ fibrilių paruošimas

1 mg Aβ1-40 arba Aβ1-42 buvo ištirpinamas 400 µl kambario temperatūros

HFIP. Toliau į paprastą mėgintuvėlį (nesilikonizuotą) įpilama 900 µl bidistiliuoto vandens ir 100 µl paruošto HFIP ir peptidų tirpalo, 20 min. inkubuojama kambario temperatūroje, po to tirpalas centrifuguojamas 15 min. 12000 aps./min. greičiu (centrifuga „Eppendorf 5414“). Po centri-fugavimo supernatantas perpilamas į kitą nesilikonizuotą mėgintuvėlį. Po HFIP išgarinimo Aβ tirpalas inkubuojamas vandens vonioje 7 paras 37 °C temperatūroje. Gautos Aβ fibrilės išpilstomos ir užšaldomos –20 °C tem-peratūroje.

2.2.5 Aβ monomerų paruošimas

1 mg Aβ1-40 arba Aβ1-42 buvo ištirpinamas 400 µl HFIP kambario

temperatūroje. Toliau į silikonizuotą mėgintuvėlį įpilama 100 µl paruošto HFIP ir Aβ tirpalo. Išgarinamas HFIP ir į mėgintuvėlį pridedama 50 µl di-metilsulfoksido (DMSO). Tirpalas centrifuguojamas 15 min. 12 000 aps./min. greičiu (centrifuga „Eppendorf 5414“). Po centrifugavimo super-natantas perkeliamas į kitą silikonizuotą mėgintuvėlį ir užšaldomas –20 °C temperatūroje.

2.3 Baltymo koncentracijos nustatymas Bradfordo metodu

Aβ koncentacija paruoštuose tirpaluose buvo nustatoma Bradfordo metodu. 20 µl Aβ peptido tirpalo buvo ištirpinama 1 ml Bradfordo regento. Po 5 min. inkubacijos spektrofotometriškai buvo nustatoma šviesos sugertis 595 nm bangoje (spektrofotometras „Hitachi 557“). Baltymo kiekis nusta-tomas pagal kalibracinę kreivę, sudarytą naudojant standartinį baltymo tirpalą, pagamintą iš žmogaus serumo albumino.

2.4 Aβ1-42 oligomerų tirpalo ultrafiltravimas

Aβ1-42 oligomerų tirpalo ultrafiltravimui naudojome įvairaus dydžio

Microcon filtrus: YM-10, YM-30 YM-100 (Millipore). Šviežiai paruoštas I protokolo Aβ1-42 oligomerų tirpalas pirmiausia buvo centrifuguojamas

12 000×g 12 min. (centrifuga „Eppendorf 5414“) naudojant YM-100 filtrą, atskiriantį 100 000 Da dydžio daleles. Gautos nuosėdos ant filtro buvo re-centrifuguojamos 3 min. (apvertus filtrą) į kitą mėgintuvėlį, pridėjus 100 µl H2O. Gauta Aβ1-42 oligomerų frakcija buvo >100 kDa. Supernatantas, gautas

po pirmo filtravimo, buvo centrifuguojamas dar kartą 12 000×g 12 min per 30 000 Da filtrą (gauta oligomerų frakcija <30 kDa) arba 12 000×g 30 min per 10 000 Da filtrą (gauta oligomerų frakcija <10 kDa). Frakcija virš filtro, gauta naudojant 30 000 Da filtrą, buvo skiedžiama 100 µl H2O, gaunant >30

kDa oligomerų frakciją. Baltymo koncentracija įvairiose frakcijose buvo nustatoma Bradfordo metodu.

2.5 Neuronų žūties įvertinimas

2.5.1 Fluorescencinė mikroskopija

Neuronų žūtis buvo vertinama fluorescentinės mikroskopijos metodu (mikroskopas OLYMPUS IX71S1F-3). Apoptozė buvo nustatoma pagal morfologinius neuronų branduolių pokyčius, naudojant fluorescuojantį dažą Hoechst 33342 (Hoechst). Po inkubacijos į neuronų kultūrą buvo pridedama Hoechst (4 µg/ml) bei propidžio jodido (4 µg/ml) dažo ir inkubuojama 15 min., esant kambario temperatūrai. Neuronai, kurių branduoliai buvo to-lygiai nudažyti mėlynai Hoechst dažu, buvo vertinami kaip sveiki, gyvy-bingi, o ląstelės, kurių branduoliai buvo kondensuoti ir fragmentuoti, buvo laikomos apoptozinėmis. Ląstelės, kurių branduoliai buvo nudažyti pro-pidžio jodidu ir švytėjo raudonai, buvo laikomos nekrozinėmis.

2.5.2 Nekrozės įvertinimas pagal LDH aktyvumą ląstelių augimo terpėje

Laktato dehidrogenazės (LDH) aktyvumas mišrios neuronų glijos ląstelių kultūros terpėje buvo vertinamas spektrofotometru „Hitachi 557“ (Japonija) pagal sugerties pokytį, 340 nm šviesos bangoje, registruojant NADH sunaudojimo greitį laktato dehidrogenazei, piruvatą verčiant laktatu. LDH aktyvumas buvo matuojamas terpėje (0,1 M Tris-HCL, 1 mM Na-piruvato, 0,1 mM NADH, pH 7,5) ir išreikštas santykiniais vienetais, rodančiais fermento kiekį, gebantį oksiduoti 1 µM NADH per minutę.

2.6 Ląstelių plazminės membranos įtampos vertinimas

Ląstelių plazminės membranos įtampos vertinimas buvo atliekamas fluo-rescentinės mikroskopijos metodu (mikroskopas OLYMPUS IX71S1F-3). Neuronų kultūra buvo kultivuojama in vitro 6–7 paras ir po to inkubuojama 0, 0,5, 1, 2 ir 4 val su 1 µM Aβ1-42 oligomerais. Po inkubacijos buvo

nupilama augimo terpė ir užpilama PBS tirpalo. Po to PBS tirpalas nupilamas ir užpilama ląstelių augimo terpės, papildytos oksanolio dažu

(DiBAC43) (3 µM), ir vėl inkubuojama 10 min. Ląstelės buvo

fotogra-fuojamos fotoaparatu (OLYMPUS). Membranos potencialo pokyčiai buvo vertinami pagal pikselių statistinius parametrus normalizuojant jų reikšmes, įvertinant foninį apšvietimą ir negyvų ląstelių fluorescenciją, kai negyvų ląstelių potencialas prilyginamas nuliui.

2.7 Glutamato kiekio nustatymas neuronų augimo terpėje

Ląstelių augimo terpėje esančio glutamato kiekis buvo nustatomas spektrofotometriškai, naudojant komercinius rinkinius („Abcam“, Anglija). Po inkubacijos glutamato kiekis buvo vertinamas spektrofotometru „Implen“ (Vokietija) pagal sugerties pokytį 340 nm šviesos bangoje.

2.8 Ląstelių kvėpavimo greičio matavimas

Makrofagų deguonies sunaudojimas buvo registruojamas naudojant „OROBOROS Oxygraph-2k” (Austrija) prietaisą. Matavimai buvo atlikti naudojant uždarą, termostatuojamą kiuvetę, esant 37 ºC temperatūrai. Prieš eksperimentą ląstelės buvo suspenduojamos DMEM terpėje. Deguonies sunaudojimas buvo registruojamas kiuvetėje makrofagus papildžius įvai-riomis Aβ1-42 agregatų formomis. Eksperimentuose ląstelių skaičius siekė

1 000 000/ml, Aβ1-42 agregatų koncentracija 1 µM.

2.9 Žiurkės smegenų mitochondrijų išskyrimas

Mitochondrijos buvo išskiriamos diferencinio centrifugavimo metodu. Trijų mėnesių amžiaus „Wistar“ veislės žiurkės patinas buvo užmigdomas CO2 dujomis, o po to dekapituojamas. Prakirpus kaukolės viršutinę dalį

nuimami pakauškaulio ir momenkaulio kaulai. Galvos smegenys išimamos ir dedamos į Petri lėkštelę su atšaldyta iki 1–4 ºC temperatūros terpe (IT), kurios sudėtis: 250 mM sacharozė, 10 mM Tris/HCL, 0,5 mM EDTA pH 7,4 (4 ºC). Pašalinami galvos smegenų dangalai, nuimamos kraujagyslės ir kraujo krešuliai. Toliau smegenys perdedamos kitą Petri lėkštelę su 5 ml IT ir smulkiai sukarpomos. Sukarpytas audinys perkeliamas į atšaldytą iki 4 ºC

temperatūros stiklo-teflono homogenizatorių ir užpilamas išskyrimo terpe (10 ml/g audinio). Homogenizuojama apie 40 s. Po to homogenatas lygiai išpilstomas į centrifuginius mėgintuvėlius ir 5 min. centrifuguojamas 1000×g (centrifuga „Eppendorf 5810R“). Gautas supernatantas perpilamas į kitus centrifuginius mėgintuvėlius ir centrifuguojamas 10 min. 7000×g. Gautos nuosėdos švelniai resuspenduojamos 2 ml 3 proc. fikolo tirpale (IT papildyta fikolu). Mišinys atsargiai perkeliamas į kitą mėgintuvėlį su 6 ml 6 proc. fikolo tirpalu, nesumaišant dviejų skirtingo tankio tirpalų. Toliau centrifuguojama 30 min. 11500×g. Supernatantas nusiurbiamas, o nusėdu-sios mitochondrijos suspenduojamos 200 µl. išskyrimo terpės. Gauta mito-chondrijų suspensija laikoma tamsiame, uždengtame centrifuginiame mė-gintuvėlyje ledų vonelėje viso eksperimento metu.

2.9.1 Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu

Mitochondrijų suspensijoje esančio baltymo kiekis buvo nustatomas biureto metodu. Į mėgintuvėlį, kuriame yra 0,05 ml mitochondrijų suspen-sijos įpilama 0,95 ml 0,33 proc. Natrio deoksicholato (C24H39NaO4) tirpalo,

gerai sumaišoma, įpilama 4 ml kambario temperatūros biureto reagento, sumaišoma ir inkubuojama vandeniniame termostate 37 ºC temperatūroje 20 min. Tirpalo optinis tankis išmatuojamas spektrofotometru („Hitachi 557“, Japonija) 536 nm ilgio bangoje. Baltymo kiekis nustatomas pagal kalib-racinę kreivę, sudarytą naudojant standartinį baltymo tirpalą, pagamintą iš žmogaus serumo albumino.

2.9.2 Mitochondrijų kvėpavimo greičio matavimas

Mitochondrijų kvėpavimo greitis įvariose metabolinėse būsenose buvo matuojamas oksimetriniu metodu uždaroje, stiklinėje termostatuojamoje (37 ºC) kiuvetėje su įtaisytu Clark tipo deguonies elektrodu, tiriamą mišinį maišant magnetine maišykle 650 aps/min. greičiu. Deguonies sunaudojimo greitis buvo užrašomas poliarografu „Rank Brothers LTD“ (Anglija). De-guonies sunaudojimo greitis išreiškiamas nanoatomais deDe-guonies per minutę 1 mg mitochondrijų baltymo. Laikytina, kad 1 ml (37 ºC) inkubacinės terpės yra 422 nanoatomų deguonies. Izoliuotų mitochondrijų deguonies sunau-dojimo matavimai buvo atlikti inkubacinėje terpėje, kurios sudėtis: 125 mM