Magistro baigiamasis darbas KVERCETINO IR JO GLIKOZIDŲ POVEIKIS ŽIURKĖS INKSTŲ MITOCHONDRIJŲ KVĖPAVIMUI AUŠRA DIDŽIULYTĖ LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

AUŠRA DIDŽIULYTĖ

KVERCETINO IR JO GLIKOZIDŲ POVEIKIS ŽIURKĖS INKSTŲ

MITOCHONDRIJŲ KVĖPAVIMUI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė

Konsultantas:

Prof. Dr. Rasa Banienė

KAUNAS, 2014

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA AUŠRA DIDŽIULYTĖ TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas ___________________ Data _____________________

KVERCETINO IR JO GLIKOZIDŲ POVEIKIS ŽIURKĖS INKSTŲ MITOCHONDRIJŲ KVĖPAVIMUI

Magistro baigiamasis darbas

Konsultantas Darbo vadovas

Rasa Banienė, ________ Sonata Trumbeckaitė, __________ Data ________________ Data ________________________

Recenzentas Darbą atliko Vardas, pavardė, parašas Magistrantė

Aušra Didžiulytė _________ Data ___________________ Data_________________

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

1. ĮVADAS ... 8

1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai ... 9

1.2. Darbo aktualumas, teorinė ir praktinė reikšmė ... 9

2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

2.1. Mitochondrijos... 10

2.1.1. Mitochondrijų struktūra ir funkcijos ... 10

2.1.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės struktūra ir funkcijos ... 11

2.2. Oksidacinis fosforilinimas ... 13

2.3. Aktyvios deguonies formos (ROS) ir jų toksiškumas. ... 14

2.3.1. Antioksidantai - organizmo apsauga nuo žalingo aktyvių deguonies formų poveikio ... 15

2.4. Flavonoidai ... 16

2.4.1. Flavonoidų struktūra, klasifikacija ir šaltiniai ... 16

2.4.2. Flavonoidų biologinis poveikis ... 18

2.4.3. Flavonoidų biologinis pasisavinimas ... 19

2.5. Kvercetinas ir jo glikozidai ... 20

2.5.1. Kvercetinas ... 20

2.5.2. Izokvercitrinas ... 22

2.5.3. Rutinas ... 23

2.5.4. Hiperozidas ... 25

2.6. Kvercetino ir jo glikozidų poveikis mitochondrijų funkcijoms... 26

3. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 28

3.1. Tyrimų pobūdis... 28

3.2.1 Aparatūra, indai ... 28

3.2.2. Terpės ... 28

3.3. Mitochondrijų išskyrimas ... 29

3.4. Baltymo kiekio mitochondrijų suspensijoje nustatymas biureto metodu ... 29

3.5. Mitochondrijų kvėpavimo greičio įvertinimas ... 29

3.6. Statistinė analizė ... 30

4. TYRIMO REZULTATAI ... 31

4.1. Kvercetino ir jo glikozidų poveikio oksidacinio fosforilinimo sistemai žiurkės inkstų mitochondrijose tyrimas ... 31

4.1.1. Kvercetino ir jo glikozidų poveikis mitochondrijų kvėpavimui antroje metabolinėje būsenoje ... 31

4.1.2. Kvercetino ir jo glikozidų poveikis mitochondrijų kvėpavimui trečioje metabolinėje būsenoje ... 36

5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 40

6. IŠVADOS ... 43

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 44

SANTRAUKA

Aušra Didžiulytė. Kvercetino ir jo glikozidų poveikis žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimui: magistro baigiamasis darbas/ Mokslinė vadovė prof. dr. Sonata Trumbeckaitė; Lietuvos Sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas, 2014

Tikslas: ištirti kvercetino ir jo glikozidų poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimui.

Uždaviniai: 1) Ištirti kvercetino ir jo glikozidų (rutino, hiperozido, izokvercitrino) poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiams antroje metabolinėje būsenoje. 2) Ištirti kvercetino ir jo glikozidų (rutino, hiperozido, izokvercitrino) poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiams trečioje metabolinėje būsenoje. 3) Palyginti kvercetino ir jo glikozidų poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms.

Tyrimo metodai: Eksperimentinėje dalyje buvo tiriamas kvercetino ir jo glikozidų (rutino, izokvercitrino, hiperozido) poveikis žiurkės inkstų mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai. Tyrimams naudojome Wistar veislės žiurkes. Tyrimų pobūdis – in vitro. Žiurkės inkstų mitochondrijos izoliuotos diferencinio centrifugavimo metodu. Flavonoidų poveikis žiurkės inkstų mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai buvo tiriamas naudojant poliarografinį metodą. Paruošti tiriamųjų flavonoidų etaloniniai tirpalai buvo pridedami: a) mitochondrijoms esant antroje metabolinėje būsenoje; b) mitochondrijoms esant trečioje metabolinėje būsenoje.

Rezultatai: Kvercetinas ir jo glikozidai, t.y. rutinas, hiperozidas ir izokvercitrinas (3 - 48 nM), stimuliuoja žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje metabolinėje būsenoje (t.y. atskiria oksidacijos ir fosforilinimo procesus). Mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje stimuliavo kvercetinas ir rutinas, kiti flavonoidai statistiškai reikšmingo poveikio neturėjo. Išvados: efektyviausiu oksidacijos ir fosforilinimo procesus atskiriančiu poveikiu iš tirtų junginių pasižymėjo kvercetinas (28 - 39 %). Kvercetino glikozidai, izokvercitrinas (18 – 34 %) > hiperozidas (12 – 25 %) > rutinas (4 – 19 %), turėjo mažesnį poveikį. Efektyviausiai mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje didino rutinas (19 - 22 %) ir kvercetinas (12 - 18 %). Oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimas (nedidelio laipsnio) yra naudingas ląstelei, kadangi tokiu būdu galima reguliuoti (mažinti) aktyvių deguonies formų susidarymą mitochondrijose. Didelio laipsnio oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimas jau yra nenaudingas, nes dėl to susilpnėja ATP sintezės efektyvumas.

SUMMARY

Aušra Didžiulytė. The effect of quercetin and its glycosides on the rat kidney mitochondrial respiration: master thesis/ Scientific supervisor prof. dr. Sonata Trumbeckaitė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy.– Kaunas, 2014

Aim:

The objectives: 1) To investigate the effect of quercetin and its glycosides (rutin, hyperoside, isoquercitrin) on rat kidney mitochondrial respiration rates in the second metabolic state (State 2). 2) To investigate the effect of quercetin and it‘s glycosides (rutin, hyperoside, isoquercitrin) on rat kidney mitochondrial respiration rates in the third metabolic state (State 3). 3) Compare the quercetin and its glycosides effect on renal mitochondrial respiration.

Methods: In this research work we investigated the effect of quercetin and its glycosides (rutin, hyperoside, isoquercitrin) on rat kidney mitochondrial oxidative phosphorylation system. In these studies we used Wistar rats. Eksperimental model – in vitro. Rat kidney mitochondria isolated by differential centrifugation and the impact of flavonoids on rat kidney mitochondrial oxidative phosphorylation system was evaluated by poliarographic method. Prepared tests standards solutions of flavonoids were added: a) in the second metabolic state (State 2); b) in the third metabolic state (State 3).

Results: Quercetin and its glycosides, i.e. rutin, hyperoside and isoquercitrin (3 - 48 nM) stimulated rat kidney mitochondrial respiration rate in the second metabolic state (uncoupled the mitochondrial respiration). Quercetin and rutin stimulates mitochondrial State 3 respiration rate, other tested compounds had no effect. Conclusion: the most pronounced uncoupling effect was determined for quercetin (28 - 39 %). Quercetin glycosides: isoquercitrin (18 - 34 %) > hyperoside (12 - 25 %) > rutin (4 - 19 %), had a smaller uncoupling effect. The most pronounced effect on the mitochondrial State 3 respiration rate had rutin (19 - 22 %) and quercetin (12 - 18 %). Slight uncoupling of mitochondrial respiration is useful for the cell, since it prevents the generation of reactive oxygen species. High concentrations of flavonoids, mitochondrial respiration rate in the second metabolic state was highly stimulated (up 52 %), but it was no effect in the third metabolic state (not statistically significant result). Uncoupling of mitochondrial respiration at high degree is harmful since it causes the reduction of ATP synthesis efficiency.

SANTRUMPOS

ADP Adenozino 5’- difosfatas ATP Adenozino 5' - trifosfatas

NADH Nikotino amido adenino dinukleotidas, redukuota forma NAD Nikotino amido adenino dinukleotidas

FADH2 Flavino adenino dinukleotidas, redukuota forma FAD Flavino adenino dinukleotidas, oksiduota forma FMNH2 Flavino mononukleotidas, redukuota forma FMN Flavino mononukleotidas, oksiduota forma ROS Aktyvios deguonies formos

KoQ Kofermentas Q

KKK Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas

V2 Mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje V3 Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje CCCP Karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazonas

1. ĮVADAS

Statistikos duomenimis, apie 20 % vyrų ir 25 % moterų nuo 65 iki 74 metų amžiaus serga tam tikromis inkstų ligomis ir to priežastimi dažnai tampa tiek egzogeniniai (rūkymas, alkoholio vartojimas, spinduliuotė, tam tikrų vaistų, pavyzdžiui ksenobiotikų, vartojimas), tiek endogeniniai (per didelė oksidantų gamyba organizme, susilpnėjusi antioksidantinės gynybos sistemos veikla, per mažas endogeninių/egzogeninių antioksidantų kiekis, bei per didelis aktyvių deguonies formų (ROS) kiekis organizme) veiksniai [10]. Pavyzdžiui, ROS neigiamai veikia ląsteles, sukeldamos lipidų, baltymų ir nukleorūgščių pažaidas, kurios veda prie struktūrinių ir funkcinių sutrikimų [6]. Dėl sukelto oksidacinio streso žalos gali išsivysti tokie inkstų sutrikimai, kaip ūminis inkstų funkcijos nepakankamumas, obstrukcinė nefropatija, hiperlipidemija, glomerulų pažeidimas. Dėl to yra aktualu surasti būdus, kurie galėtų sustiprinti antioksidantinės gynybos sistemos veiklą ir taip sulėtinti inkstų ir kitų organų funkcijos sutrikimų progresavimą [6].

Flavonoidai yra naturalūs antioksidantai, paplitę gamtoje ir gali atlikti svarbų vaidmenį stiprinant antioksidacinę gynybos sistemą, nes jie elgiasi kaip ROS surišėjai ir fermentų moduliatoriai [6]. Jau 1990-aisiais metais, po epidemiologinių tyrimų paskelbimo, buvo įrodyta, jog flavonoidai gali sumažinti sergamumą vėžiu, širdies, inkstų ir kraujagyslių ligomis [37]. Dėl gebėjimo surišti laisvuosius radikalus, flavonoidai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis ir gali apsaugoti ląsteles nuo oksidacinio streso sukeltos žalos. Ankstesni tyrėjų darbai parodė, jog inkstus apsaugančiu poveikiu pasižymi tokie flavonoidai, kaip kvercetinas ar rutinas. Nors šie tyrimai buvo atliekami su eksperimentiniais gyvūnais, buvo pasiūlyta, kad ši apsauga gali būti naudinga gydant inkstų sutrikimus žmonėms [6]. Teigiamas kvercetino ir jo glikozidų (rutino, hiperozido, izokvercitrino) poveikis sveikatai yra ne tik dėl jų antioksidacinių savybių, bet ir dėl antibakterinių, priešuždegiminių ir priešvėžinių savybių. Taip pat buvo atlikti tyrimai, patvirtinantys jų apsauginį poveikį mitochondrijų funkcijoms [4].

Mitochondrijos yra ląstelės organėlės, kurių svarbiausia funkcija yra substratų oksidavimas ir ATP gamyba [1]. Mitochondrijų kvėpavimo grandinėje, oksiduojant NADH arba FADH2, gaminasi ir

aktyvios deguonies formos (ROS) [37]. Mitochondrijų veikla ląstelėje yra labai svarbi ir mitochondrijų funkcijų sutrikimas, pažaidos gali sąlygoti ląstelių energijos gamybos sutrikimus, ar net ląstelių žūtį. Biologiškai aktyvių junginių pagalba galima kryptingai įtakoti mitochondrijų funkcinę būklę. Kadangi flavonoidai pasižymi plačiu biologiniu veikimo spektru, o jų poveikio mechanizmas molekuliniame lygmenyje, bei jų poveikio priklausomybė nuo flavonoido struktūros ir glikozidinės dalies struktūros yra menkai išanalizuota, šio darbo tikslas yra įvertinti kvercetino ir jo glikozidų poveikį žiurkių inkstų mitochondrijų kvėpavimui.

1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai

Darbo tikslas: ištirti kvercetino ir jo glikozidų poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimui. Uždaviniai:

1. Nustatyti kvercetino ir jo glikozidų (rutino, hiperozido, izokvercitrino) poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiams antroje metabolinėje būsenoje.

2. Ištirti kvercetino ir jo glikozidų (rutino, hiperozido, izokvercitrino) poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiams trečioje metabolinėje būsenoje.

3. Palyginti kvercetino ir jo glikozidų poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms.

1.2. Darbo aktualumas, teorinė ir praktinė reikšmė

Vieni iš labiausiai gamtoje paplitusių natūralių antioksidantų – flavonoidai, kurie gali apsaugoti ląsteles nuo oksidacinės žalos, aktyvių deguonies formų toksinio poveikio. Atlikus literatūros analizę pastebėta, kad didėja susidomėjimas natūraliomis medžiagomis, kurios padėtų sustiprinti antioksidacinę gynybos sistemą. Kvercetino ir jo glikozidų poveikiu žiurkės širdies mitochondrijų funkcijoms plačiai domėtąsi ir Lietuvoje, Lietuvos Sveikatos mokslų universitete (mokslininkai S. Trumbeckaitė, J. Bernatoniene, D. Majiene ir kt., 2006), tačiau literatūroje tyrimų apie kvercetino ir jo glikozidų poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms nėra, todėl mūsų tyrimo metu buvo aktualu ištirti flavonolio kvercetino ir jo glikozidų poveikį žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms in vitro, bei įvertinti, kokį poveikį, priklausomai nuo koncentracijos, jie turi mitochondrijoms įvairiose metabolinėse būsenose. Be to, buvo svarbu sužinoti, ar prie kvercetino struktūros prijungta glikozidinė grupė (kvercetino glikozidai) įtakoja (padidina ar sumažina) aglikono biologinį poveikį.

Tyrimo metu nustatėme, kad efektyviausiai oksidacijos ir fosforilinimo procesus atskiriančiu poveikiu iš tirtų junginių pasižymėjo kvercetinas. Kvercetino glokozidai izokvercitrinas > hiperozidas > rutinas turėjo mažesnį poveikį. Mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje efektyviausiai didino rutinas ir kvercetinas. Izokvercitrinas ir hiperozidas neveikė mitochondrijų kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje. Taigi, flavonoidų ir jų glikozidų pagalba, keičiant koncentraciją, galima būtų tikslingai reguliuoti mitochondrijų funkcinę būklę.

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Mitochondrijos

2.1.1. Mitochondrijų struktūra ir funkcijos

Mitochondrijos yra apie 0,5 - 1 mm skersmens ir iki 7 mm ilgio organėlės. Jos randamos visuose eukariotiniuose organizmuose, o pagrindinė jų funkcija gaminti ATP energiją oksidacinio fosforilinimo metu (t.y. mitochondrijos atlieka pagrindinį vaidmenį ląstelių energijos apykaitoje) [1]. Jų forma ir skaičius ląstelėse priklauso nuo konkretaus audinio. Mitochondrijų skaičius ląstelėse skiriasi priklausomai nuo energijos poreikio: audiniai, atliekantys didelio pajėgumo aerobinės apykaitos funkcijas (tokie kaip skeleto raumenys, širdis ar inkstai), turės didesnį mitochondrijų skaičių [1]. Mitochondrijos turi dvi specializuotas membranas, kurių kiekviena sudaryta iš fosfolipidų dvisluoksnio. Šios dvi membranos skiriasi tiek savo išvaizda, tiek fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis, todėl pasižymi ir skirtingomis biocheminėmis funkcijomis. Išorinė membrana yra lygi, o vidinė vingiuota. Vidinė membrana dengia mitochondrijų matriksą ir formuoja kristas (vidinės „raukšlės“), kurios padidina vidinės membranos paviršių (1 pav.). Vidinė ir išorinė membrana pasižymi skirtingu fosfolipidų išsidėstymu ir baltymų – lipidų santykiu. Išorinėje membranoje šis santykis yra apie 50:50, ir manoma, kad baltymai pasižymi fermentine ir transporto funkcija. Vidinėje membranoje baltymų ir lipidų santykis yra 80:20 [1].

1 pav. Mitochondrijų struktūra [55]

Išorinė mitochondrijų membarana yra labiau laidi jonams ir didesnėms molekulėms, lyginant su vidine membrana, kuri laidi tik tam tikriems jonams ir junginiams. Dėl šios priežasties, vidinė

mitochondrijų membrana dar yra vadinama „specifiniu barjeru“ [1]. Mitochondrijų vidinėje ir išorinėje membranoje taip pat yra randami fosfolipidai: kardiolipinas ir fosfatidiletanolaminas. Trūkstant kardiolipino sutrinka mitochondrijų funkcija ir stabilumas, taip pat išorinės ir vidinės membranos baltymų kompleksų veikla [24].

Mitochondrijos atlieka tam tikras funkcijas, pavyzdžiui, mitochondrijų matrikse yra įvairių fermentų, kurie svarbūs angliavandenių, lipidų ir amino rūgščių oksidacijai, bei šlapalo ir hemo biosintezei [1]. Taip pat mitochondrijų matrikse vyksta sudėtingų reakcijų visuma, vadinama Krebso ciklu. Pagrindinė Krebso ciklo funkcija yra oksiduoti acetilo komponentą iš acetil-CoA į dvi anglies dioksido molekules ir kartu išsaugoti laisvą energiją NADH (nikotinamido adenino dinukleotido redukuota forma) ir FADH (flavino adenino dinukleotido redukuota forma) formoje. Naudojant NADH ir FADH2 kaip substratus, oksidacinio fosforilinimo metu mitochondrijose gaminama ATP

energija [1]. Be to, mitochondrijos yra pagrindiniai ląstelių energijos ir redokso metabolizmo reguliatoriai. Taip pat vaidina pagrindinį vaidmenį ląstelių signalizacijos ir mirties keliui, reguliuoja kalcio kiekį citoplazmoje. Mitochondrijose vykstančių procesų skaičius priklauso nuo ATP sintezės ir reaktyvių deguonies formų gamybos [23].

2.1.2. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės struktūra ir funkcijos

Mitochondrijų kvėpavimo grandinė – sudėtinga oksidacijos-redukcijos sistema, kuri randasi vidinėje mitochondrijų membranoje (3 pav.). Ji yra unikali, nes jos veikimą kontroliuoja du atskiri genomai: mtDNR ir nDNR. Kvėpavimo grandinę sudaro 4 kompleksai (kompleksas I – IV), kurie kartu su kompleksu V (ATP sintaze) sudaro sudėtingą oksidacinio fosforilinimo sistemą. Pirmieji 4 kompleksai sąveikauja tarpusavyje ir sukuria sudėtingą protonų gradientą, kuris dalyvauja ADP ir neorganinio fosfato konvertavime į ATP (komplekse V). Šie kompleksai sąveikauja vienas su kitu, dalyvaujant judriems elektronų nešikliams: KoQ ir citochromui c [36]. Mitochondrijų kvėpavimo grandinę sudaro šie kompleksai:

Kompleksas I (NADH dehidrogenazė) – jo sudėtyje yra flavino mononukleotidai (FMN), prijungiantys H+ jonus nuo NADH ir geležies-sieros grupių centrai, prijungiantys elektronus ir protonus nuo FMNH2 ir perduodantys juos KoQ, o protonai išstumiami į tarpmembraninę erdvę. [1;

16] Mitochondrijų vidinėje membranoje esantis KoQ dalyvauja perduodant elektronus iš mitochondrijų kvėpavimo gradinės komplekso I ir komplekso II į kompleksą III. Jis taip pat veikia kaip lipiduose tirpus antioksidantas, dalyvauja įvairiuose metabolizmo procesuose, įskaitant pirimidino nukleotidų biosintezę ir β riebalų rūgščių oksidaciją [33].

Tai gi, kompleksas I yra labai svarbus daugelio aerobinių organizmų kvėpavimui. Mitochondrijose jis oksiduoja NADH, gautą trikarboksirūgščių ciklo (Krebso) ir metu, redukuoja ubichinoną, dalyvauja protonų pernašoje per vidinę mitochondrijų membraną [34].

Kompleksas II (sukcinato dehidrogenazė) – savo sudėtyje turi flavoproteinų ir geležies – sieros grupių turinčių baltymų kompleksų. [1] Komplekse II esantys flavino adenino dinukleotidai prisijungia H+ jonus, o geležies-sieros centrai prisijungia elektronus nuo FADH2. Kompleksas II

oksiduoja sukcinatą į fumaratą (krebso ciklo metu) ir tiesiogiai perduoda elektronus iš FADH2

kvėpavimo grandinės kofermentui Q10. Protonai nėra išstumiami iš mitochondrijų [1; 16].

Kompleksas III (ubichinono - citochromo c reduktazė) - kompleksas III perduoda elektronus nuo redukuoto KoQ citochromui c. Citochromas c priima elektronus iš komplekso III ir perduoda juos kompleksui IV (citochromo oksidazei), kur jie bus perduoti deguonies molekulei: O2 konvertavimui į

H2O [35]. Citochromai – hemoproteinai, kurių molekulėse yra tvirtai prijungtas hemas. Oksidacijos

metu protonai iš mitochondrijų matrikso yra išstumiami į transmembraninę erdvę (kompleksas perneša protonus iš matrikso į išorę) [35].

Kompleksas IV – (citochromo c oksidazė) katalizuoja paskutinį elektronų perdavimo procesą: deguonies redukciją, susidarant vandeniui. Kompleksas IV perneša keturis protonus iš mitochondrijų matrikso į tarpmembraninę terpę, o elektronai naudojami deguonies redukcijai. Procesas yra negrįžtamas. Kompleksas IV susideda iš 13 subvienetų, iš kurių trys subvienetai yra koduojami mtDNR, o kiti 10 yra koduojami nDNR [16].

Kvėpavimo grandinė sukuria elektrocheminį protonų gradientą (susidaro dėl protonų pernešimo per kompleksus I, III ir IV), kuris dar kitaip vadinamas „protonų varomąja jėga“. Susidaręs elektrocheminis gradientas turi dvi sudedamąsias dalis: elektrinį potencialą ir pH komponentą (2 pav. 3 pav.). [1]

2 pav. Delta p – elektrocheminis gradientas, paprastai išreiškiamas milivoltais. Mitochondrijos, izoliuotos iš hepatocitų, paprastai turi apie 170 mV membranos potencialą [1]

3 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinė sukuria elektrocheminį protonų gradientą, kurį naudoja V mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas – ATP sintazė – kuris sintetina ATP iš ADP ir neorganinio fosfato [1]

ATP sintazė naudoja elektrocheminį protonų gradientą (pav. 3; pav. 4) ATP sintezei iš ADP ir neorganinio fosfato. ATP-sintazė yra sudėtingos struktūros transmembraninis baltymas, esantis vidinėje mitochondrijų membranoje. Chemoosmosinė teorija teigia, kad ATP-azė yra vidinėje mitochondrijų membranoje (3 pav.). [1]

2.2. Oksidacinis fosforilinimas

Oksidacinis fosforilinimas - procesas, kurio metu mitochondrijose gaminama ATP energija, kaip substratus naudojant NADH ir FADH2. Oksidacinio fosforilinimo procesas priklauso nuo

mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų [1]. Elektronų transporto grandinės kompleksai priima elektronus, gautus iš redukuotų ekvivalentų (NADH ir FADH2) ir perduoda deguoniui, susidarant

vandeniui. Laisva energija, gauta iš NADH ir FADH2 oksidacijos, naudojama ATP gaminimui

mitochondrijose [1]. Kad vyktų oksidacinis fosforilinimas reikalingos šios sąlygos: pirma, vidinė mitochondrijų membrana turi būti intaktiška, t.y. nepažeista, kad protonai iš tarpmembraninės erdvės būtų grąžinti į mitochondrijų užpildą ATP sintezės metu, o antra, turi būti reikiama protonų koncentracija mitochondrijų vidinės membranos išorėje. ATP sintazės varomoji jėga yra protonų gradiento energija, kuri dar kitaip vadinama chemiosmotiniu potencialu, kuris atsiranda dėl protonų

koncentracijos skirtumo ir elektros krūvių skirtumo abipus vidinės mitochondrijų membranos. Tai yra tam tikra energijos forma, panaudojama ATP sintezei iš ADP ir neorganinio fosfato [30].

2.3. Aktyvios deguonies formos (ROS) ir jų toksiškumas.

Terminas „aktyviosios deguonies formos“, kurios sutrumpintai žymimos ROS, reiškia radikalus, dalyvaujančius radikalų tipo reakcijose, bet tai nėra laisvieji radikalai, jei jie neturi neporinių elektronų. Pavyzdžiui, ne radikalinis ROS yra vandenilio peroksidas, hipochlorito rūgštis, ozonas ir singletinis deguonis. Tuo tarpu radikaliniai ROS yra superoksido anijonų radikalas ir hidroksilo radikalas. Tai – chemiškai aktyvios molekulės, turinčios deguonies. Taip pat yra ir aktyvių azoto rūšių, pavyzdžiui, azoto oksidas ir azoto dioksidas [37]. ROS gali pasigaminti vykstant endogeniniams procesams, pavyzdžiui, mitochondrijų kvėpavimo metu, polimorfonuklearinių leukocitų aktyvacijos, arachidono rūgšties metabolizmo metu, taip pat dėl fermentų veiklos ir kt. [37]. Pavyzdžiui, superoksido anijonas ir azoto oksidas yra laisvieji radikalai, kurie lengvai reaguoja su kitomis molekulėmis ir aktyviomis deguonies ir azoto rūšimis, sukeldami grandinines reakcijas. Viena iš superoksido anijono susidarymo priežasčių yra dalinė deguonies redukcija mitochondrijose (jis yra mitochondrijose vykstančio ląstelinio kvėpavimo šalutinis produktas) [50; 52].

Nors ROS gaminasi įvairių ląstelinių procesų metu ir vaidina svarbų vaidmenį ląstelių signalo perdavime, ląstelės nuolat susiduria su aktyvių deguonies formų sukelta žala (ypač susilpnėjus antioksidantinei gynybos sistemai). ROS toksiškumas ir ROS sukeltos ligos: Ca2+ transporto ir elektrolitų homeostazės slopinimas, citochromo oksidacija, DNR pažeidimai, mutacijų ir kancerogenezės skatinimas, energijos gamybos sutrikdymas (ATP, NADH), gyvybiškai svarbių tiolio junginių oksidacija į disulfidus [31]. Taip pat ROS sukelia uždegiminius procesus, kurie plinta iš vienos organų sistemos (kepenys) į kitą (inkstai, plaučiai ir kt.). Rezultate, išsivysto daugelio organų sistemų nepakankamumas, pasireiškia oksidacinis stresas audiniuose. ROS sukeltas uždegiminis procesas dalyvauja infekcinių ligų patogenezėje, įskaitant tuberkuliozę ir septinį šoką ir imuninių, bei autoimuninų ligų patogenezėje [31]. Aktyvių deguonies formų (ROS) šalutiniai produktai yra laisvieji radikalai, išsiskiriantys deguonies apykaitos metu (pvz. superoksido anijonas O2, hidroksilo radikalas

OH-, taip pat ne radikaliniai oksidantai (pvz. vandenilio peroksidas) [27]. Laisvieji radikalai yra labai aktyvus ir gali atakuoti, pavyzdžiui, membranų lipidus. Lipidų peroksidacija ir laisvieji radikalai gali būti aterosklerozės, vėžio ar lėtinio uždegimo atsiradimo veiksnys [31].

2.3.1. Antioksidantai - organizmo apsauga nuo žalingo aktyvių deguonies formų

poveikio

Antioksidantai – medžiagos, mažinančios ROS sukeltas biologinių molekulių oksidacines pažaidas, o jas sukeliančios medžiagos yra vadinamos prooksidantais. Biologinė apsauga nuo ROS apima įvairius endogeninius antioksidantinius fermentus ir endogeninių antioksidantų veiksnius (tokius kaip hemo baltymai, kofermentas Q, bilirubinas), bei egzogeninius nefermentinius maistinius veiksnius (pvz. antioksidantinėmis savybėmis pasižyminčius vitaminus, polifenolius, flavonoidus) [31]. Dažniausiai apsauginiai mechanizmai (antioksidantinė gynybos sistema prieš ROS) yra skirstomi į dvi pagrindines grupes:

1. Antioksidantiniai fermentai: glutationo peroksidazė (detoksikuoja H2O2 ir lipidų peroksidus),

katalazė, kuri peroksisomose skaido H2O2 į vandenį ir deguonį, superoksido dismutazė,

superoksidą paverčianti H2O2, glutationo reduktazė, kuri randasi citoplazmoje, mitochondrijose

(recirkuliuoja glutationo disulfidus atgal į glutationą, naudojant kofermentą NADPH), superoksido dismutazė, kuri randasi citoplazmoje, mitochondrijose, lizosomose (konvertuoja superoksido radikalus atgal į H2O2) [37, 41].

2. Nefermentiniai antioksidantai: pvz. glutationas, vitaminas C, vitaminas E. Šie antioksidantai nutraukia grandinines laisvųjų radikalų reakcijas. Nefermentiniai antioksidantai dar yra skirstomi į lipidinės terpės antioksidantus ir į antioksidantus, stabdančius grandinines laisvųjų radikalų susidarymo reakcijas vandeninėje terpėje (pvz. vitaminas C; citoplazmoje esantys baltymai, turintys tiolio grupę) [37, 41].

Antioksidantai stabilizuoja arba inaktyvuoja laisvuosius radikalus, dažniausiai prieš jiems pažeidžiant biologines ląsteles. Tačiau, jei laisvieji radikalai viršija antioksidantų pajėgumą, šios aktyviosios deguonies ir azoto rūšys gali reaguoti su lipidais, baltymais, DNR ir sukelti struktūrinius ir/arba funkcinius ląstelių, fermentų ir genetinės medžiagos pažeidimus [37]. Antioksidantai sulėtina senėjimo procesus organizme, sumažina lėtinių ligų atsiradimo tikimybę, išlaiko ląstelių struktūrą [37]. Tyrimais nustatyta, jog flavonoidai (rutinas, kvercetinas, hiperozidas ir kt.) taip pat pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, pavyzdžiui, flavonoidas kvercetinas, bei jo metabolitas kvercetin-3-beta-D-gliukuronidas, sugeba apsaugoti ląstelines ir subląstelines membranas nuo aktyviųjų deguonies formų toksinio poveikio[26].

2.4. Flavonoidai

Susidomėjimas šiais junginiais atsirado tuomet, kai buvo įrodyta, jog jie labai svarbūs žmogaus sveikatai. 1990-aisiais metais, paskelbus epidemiologinius tyrimus, buvo įrodyta, jog flavonoidai gali sumažinti sergamumą vėžiu, širdies ir kraujagyslių ligomis [26]. Remiantis literatūros šaltiniais, iki 1990 metų buvo nustatyta daugiau nei 5000 skirtingų flavonoidų [37, 48]. Šiuo metu yra atlikta virš 30 000 mokslinių tyrimų su flavonoidais ir įrodytas jų teigiamas poveikis žmogaus sveikatai [26].

2.4.1. Flavonoidų struktūra, klasifikacija ir šaltiniai

Flavonoidai – polifenolinės kilmės junginiai, turintys benzo-𝛾-pirono struktūrą. Tai heterocikliniai dariniai, pasižymintys rūgštinėmis savybėmis [37]. Visiems flavonoidams būdingas pagrindinis C6-C3-C6 struktūrinis skeletas, sudarytas iš dviejų aromatinių C6 žiedų (A ir B) ir heterociklinio žiedo C, kuriame yra vienas deguonies atomas (4 pav.) [42]. Flavonoidų cheminės savybės priklauso nuo jų struktūrinės klasės, hidroksilinimo laipsnio, kitų pakaitų jungimosi ir polimerizacijos laipsnio [48].

4 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas [48]

Flavonoidai gali būti skirstomi į poklasius: flavonus (apigeninas, liuteolinas), flavonolius (kvercetinas, kemferolis, galanginas), flavanonus (naringeninas, hesperetinas), izoflavonus (ganisteinas), flavan-3-olius (katechinas, epiktechinas, epigalokatechinas), flavanolius (5 pav.) [42]. Individualūs skirtumai tarp flavonoidų poklasių priklauso nuo hidroksilo grupių skaičiaus, alkilinimo pobūdžio [37]. Flavonoidai augaluose gali būti randami kaip aglikonai, glikozidai ar metilinti dariniai. Pagrindinė flavonoidų struktūra yra aglikonas (5 pav.). Šešių narių žiedas kondensuotas su benzeno žiedu arba α-pyronu (flavonoliai ir flavononai) ar jo dihidro derivatai.

Pavyzdžiui, flavonoliai yra flavonoidų pogrupis. Ši grupė tarp C2 ir C3 turi dvigubą jungtį,

keto grupę C4 padėtyje ir hidroksilo grupę C3 padėtyje [48]. Glikozidinės formos turi glikozidinį ryšį 3

arba 7 padėtyje ir prijungtą angliavandenį (pvz. gali prijungta L-ramnozė, D-gliukozė, galaktozės ar arabinozė) [48].

5 pav. Flavonoidų poklasių pagrindinės struktūros [48]

Flavonoidai plačiai paplitę gamtoje, randami augaluose, vaisiuose sėklose ir daržovėse [26; 42;48]. Pavyzdžiui, flavonai (rutinas, liuteolinas, liuteolino glikozidai) yra paplitę vaisiuose, raudonajame vyne, raudonuosiuose pipiruose ir pomidorų odelėje. Flavonolių (kvercetinas, kemferolis, tamariksetinas, miricetinas) yra gausu svogūnuose, alyvuogių aliejuje, raudonamajme kopūste, vynuogių vaisiuose. Ankštinėse daržovėse (pvz. sojų pupelėse) gausu izoflavonų (genistino,

daidzeino), citrusiniuose vaisiuose – flavanonų (naringenino, naringino, taksifolino, hesperidino), įvairiose arbatose – flavanolių (pvz. chrisino, apigenino, katechino) [48].

2.4.2. Flavonoidų biologinis poveikis

Flavonoidai pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antivirusiniu poveikiu, turi antitrombocitinių, antikancerogeninių savybių [3]. Pastaruoju metu buvo atlikta nemažai tyrimų, kad nustatyti jų veikimo mechanizmą gydant širdies ir kraujagyslių sutrikimus, atsiradusius dėl hipertenzijos, aterosklerozės, miokardo infarkto ir išemijos žalos. Flavonoidų metabolitai sumažina širdies ligų riziką, be to, aterosklerozės metu reguliuodami monocitų adheziją (žmogaus aortos endotelio ląstelėse) sumažina aktyvių deguonies formų susidarymą [26]. Nustatyta, kad suvartotas flavonoidų kiekis atvirkščiai koreliuoja su plazmos bendro cholesterolio ir mažo tankio lipoproteinų koncentracija. Kai kurie flavonoidai pasižymi vazodilataciniu poveikiu ir sumažina eritrocitų agregaciją [3]. Dėl radikalų surišimo flavonoidai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis ir gali apsaugoti ląsteles nuo oksidacinio streso žalos. Taigi, flavonoidai gali būti apibrėžiami kaip biologiškai aktyvūs junginiai, turintys ląsteles apsaugantį poveikį [3].

Antioksidacinis flavonoidų aktyvumas yra ypač svarbus, nes manoma, jog lipidų peroksidacija ir laisvieji radikalai gali būti aterosklerozės, vėžio ar lėtinio uždegimo atsiradimo veiksnys. Flavonoidai geba neutralizuoti laisvuosius radikalus ir nutraukti jų grandininę reakciją. Kad veiktų kaip antioksidantai turi būti dvi pagrindinės sąlygos:

a) pakankama koncentracija, kad būtų išvengta substrato oksidacijos [31]

b) turi būti stabilūs, kad gebėtų neutralizuoti grandininės reakcijos metu vis daugėjančius laisvuosius radikalus [31].

Pagrindiniai flavonoidų struktūriniai bruožai, reikalingi veiksmingam radikalų sugavimui: 1) 3-4 dihidroksi (katecholio) struktūra B žiede; 2) 2,3 dvigubos jungties konjugacija su 4-keto grupe; 3) hidroksilo grupės C3 ir C5 padėtyje, dėl vandenilinio ryšio suteikimo keto grupei (6 pav.) [31].

6 pav. Flavonoidų struktūriniai bruožai, reikalingi radikalų sugavimui [31]

Augaluose flavonoidai vaidina svarbų vaidmenį ir auksino transportavime, šaknų ir daigo augime, aktyviųjų deguonies formų moduliacijoje. Dėl savo fizinių savybių, jie sąveikauja su įvairiais ląstelių taikiniais [3]. Epidemiologiniai tyrimai parodė teigiamą flavonoidų poveikį gydant ne tik širdies ir kraujagyslių ligas, bet ir neurodegeneracinius sutrikimus. Flavonai (liuteolino) ir flavonoliai (kemferolis, kvercetinas) pasižymi neuroprotekciniu poveikiu ir gali būti plačiai vartojami terapijoje gydant išemiją ar kitas neurodegeneracines ligas. Antioksidacinių sistemų, genų ekspresijos reguliavimas, uždegimo slopinimas yra pagrindiniai jų apsauginiai mechanizmai [20].

2.4.3. Flavonoidų biologinis pasisavinimas

Flavonoidų biologinis pasisavinimas priklauso nuo jų struktūros, bei fizikinių savybių, tokių kaip: molekulės dydis, konfigūracija, lipofiliškumas, tirpumas ir pKa, ar flavonoidas yra glikozidų ar aglikono pavidale. Aglikonai yra lengvai absorbuojami iš plonosios žarnos, o flavonoidų glikozidai turi būti paverčiami į aglikono formą [48]. Po absorbcijos flavonoidai kepenyse konjuguojami su gliukurono rūgštimi, sulfatais, metilinimi arba metabolizuojami į mažesnius fenolinius junginius [48]. Dėl šių konjugacijos reakcijų flavonoidų aglikonai gali būti randami kraujo plazmoje ar šlapime [48].

Pavyzdžiui, flavonoidas kvercetinas (aglikonas) pasižymi geru biologiniu pasisavinimu. Žmonėms, bendra plazmos kvercetino koncentracija (t.y. kvercetino, kvercetino glikozidų) tarp 29 ir 248 ng/ml buvo pasiekta išgėrus apie 50 mg kvercetino. Žiurkėms (Wistar ir Lister veislės) po vienkartinės dozės pavartojimo (75-1000 mg kvercetino, 300 - 4000 mg/kg kūno svorio), kvercetino koncentracija plazmoje (laisvo ar konjuguoto kvercetino ir jo metabolitų) svyruoja tarp 12,2 ir 100 nmol/ml [25]. Nors tolimesni autorių tyrimai in vivo ir in vitro parodė, kad vartojant kvercetiną per os yra absorbuojama apie 60 % dozės, tačiau aktyvaus metabolizmo dėka, tik labai maža nekonjuguotų

kvercetino anglikonų koncentracija cirkuliuoja kraujo plazmoje [25]. Tyrimų metu taip pat buvo nustatyta, jog cukraus liekana (flavonoidų glikoziduose) yra svarbus veiksnys, lemiantis flavonoidų biologinį pasisavinimą. Buvo įrodyta, jog dimerizacija sumažina jų biologinį pasisavinimą ir biologinį poveikį [48].

Manoma, jog apsauginis kvercetino biologinis poveikis nuo daugelio žalingų ligų yra dėl jo gebėjimo patekti į ląstelių membranų lipidų dvisluoksnį. Kvercetinas taip pat gali būti visiškai integruotas į membraną ir tai padidina jo biologinį pasisavinimą. Jo patekimas į membranas labai priklauso nuo pH. Giliausia įsiterpimas vyksta rūgščioje terpėje. Esant tokioms sąlygoms kvercetinas yra neutralus ir visiškai tirpus riebaluose [45].

2.5. Kvercetinas ir jo glikozidai

Flavonoidas kvercetinas ir jo glikozidai (pavyzdžiui, rutinas) yra polifenoliniai junginiai randami daržovėse, vaisiuose, lapuose, sėklose, raudonajame vyne, arbatoje, paprastojo šermukšnio žieduose, raudonųjų svogūnų lūkštuose, hamamelio lapuose ir žieduose ir kt. [38]. Terminas kvercetinas turi būti naudojamas norint apibūdinti aglikoną, nes kvercetino glikozidai susidaro prisitvirtinus glikozidinei grupei (cukraus molekulei, pavyzdžiui, gliukozei, ramnozei arba rutinozei) (7 pav.) [40]. Tiek kvercetinas, tiek kvercetino glikozidai pasižymi plačiu biologiniu poveikiu ir gali būti naudingi gydant inkstų ir kitų organų funkcijos sutrikimų progresavimą [9].

2.5.1. Kvercetinas

7 pav. Kvercetino strukūrinė formulė [23]

Kvercetino struktūroje yra penkios hidroksilo grupės, kurios nulemia junginio biologinį aktyvumą ir galimą kvercetino darinių skaičių (7 pav.). Kvercetinas yra geltonos spalvos, visiškai netirpus šaltame vandenyje, blogai tirpsta karštame vandenyje (dėl hidrofobinių savybių), tačiau gana

gerai tirpus alkoholyje ir lipiduose [40]. Pasižymi ir priešuždegiminėmis, antiproliferacinėmis savybėmis [15]. Jis yra gerai žinomas kaip laisvųjų radikalų surišėjas, tačiau didele kliūtimi gydant CNS ligas tampa jo mažas bioprieinamumas [14]. Kvercetinas taip pat pasižymi priešuždegiminiu, antialerginiu, antivirusiniu ir priešvėžiniu poveikiu, atlieka apsauginę funkciją sergant kepenų ligomis, katarakta širdies ir kraujagyslių ligomis. Buvo įrodyta, jog kvercetinas sumažina reperfuzijos paveiktų audinių pažeidimus, išemija sergantiems pacientams [11].

Atlikti tyrimai in vivo ir in vitro patvirtino kvercetino antioksidacines savybes. Buvo įrodyta, jog kvercetinas pasižymi apsauginiu poveikiu smegenims, širdžiai ir kitiems audiniams po išeminio reperfuzinio pažeidimo, toksiškų junginių poveikio ir kitų veiksnių, kurie gali sukelti oksidacinį stresą. Tyrimuose in vitro, kuomet žiurkės ilgą laiką buvo šeriamos kvercetinu (20 mg/per dieną), žiurkių kepenyse padidėjo alfa tokoferolio koncentracija ir reikšmingai sumažėjo malono rūgšties dialdehido koncentracija, padidėjo GSH koncentracija ir glutationo reduktazės aktyvumas. Ilgalaikio tyrimo (kasdien žiurkėms suvartojant 1 mg/dieną kvercetino) rezultatai parodė teigiamą kvercetino poveikį gyvūnų antioksidantinei gynybos sistemai [40].

Smegenų išemija ir reperfuzija sukelia oksidacinį stresą, ypač vyresnio amžiaus asmenims. Tyrimo metu buvo siekiama įvertinti nanokapsuliuoto kvercetino gydomąjį poveikį, kovojant su išemijos-reperfuzijos sukelta neuronų pažaida, jaunų ir vyresnių žiurkių smegenyse [14]. Smegenų išemija buvo sukeliama okliuzijos būdu tiek jaunoms, tiek vyresnėms žiurkėms užspaudžiant miego arterijas, po to reperfuzija (30 min trukmės). Nanokapsuliuotas kvercetinas (2,7 mg/kg) buvo įvedamas zondu per burną abiems gyvūnų grupėms prieš dvi valandas iki išeminio insulto, taip pat po operacijos dar 3 dienas. Po smegenų išemijos sukėlimo ir 30 minučių trunkančios reperfuzijos padidėjo lipidų peroksidacijos lygis (lipidų peroksidacija yra viena iš pagrindinių oksidacinio streso veiksnių, žalojančių membranas), sumažėjo antioksidacinių fermentų aktyvumas, padidėjo audinių osmosinis slėgis skirtingose smegenų regionuose. Taip pat sumažėjo mitochondrijų membranų klampumas, padidėjo aktyviųjų deguonies formų kiekis (ir jaunų ir vyresnių žiurkių skirtingose smegenų srityse). Be to, tris dienas po išemijos trunkanti reperfuzija sukėlė didelę žalą neuronų ląstelėms [14]. Buvo pastebėta, kad girdant žiurkes nanokapsuliuotu kvercetinu (2,7 mg/kg) padidėjo antioksidantinės sistemos veikla ir apsaugos lygis. Nanokapsuliuotas kvercetinas (nanokapsulėje yra 80 % kvercetino) apsaugojo tiek jaunų, tiek vyresnių žiurkių smegenis nuo išemijos pažaidos [14].

Taip pat buvo tiriamas kvercetino apsauginis poveikis inkstams po cisplatinos sukelto toksiškumo in vitro. Cisplatina – antinavikinis vaistas, kurį vartojant didesnėmis dozėmis gali išsivystyti sunkus inkstų pažeidimas [32]. Vyriškos lyties žiurkėms po oda buvo inokuliuotos krūties adenokarcinomos ląstelės. Po 7 dienų žiurkės buvo suskirstytos į dvi grupes. Pirmajai grupei į pilvaplėvės ertmę kasdien buvo leidžiamas kvercetinas (50 mg/kg/per parą) kartu su cisplatina (4

mg/kg), o antrajai grupei tik cisplatina (4 mg/kg). Viso eksperimento metu buvo stebimas naviko augimas ir inkstų funkcija. Po 6 dienų žiurkės žuvo, jų inkstų funkcija ir navikai buvo ištirti. Žiurkių grupei, kuriai buvo leidžiama cisplatina be kvercetino, buvo stebimas didesnis inkstų glomerulų filtracijos greičio sumažėjimas, didesnė kanalėlių nekrozė ir lipidų peroksidacija, sumažėjęs antioksidantinės sistemos pajėgumas, taip pat daugiau uždegimo žymenų, lyginant su žiurkių grupe, kuriai buvo skiriama cisplatina su kvercetinu. Taip pat sumažėjęs naviko dydis ir svoris. Kuomet žiurkėms buvo leidžiama cisplatina kartu su kvercetinu, buvo stebimas kvercetino nefroprotekcinis poveikis: mažesnė kanalėlių ląstelių apoptozė ir inkstų uždegimas, geresnė inkstų ekskrecijos funkcija, didesnis inkstų parenchimos vientisumas [32].

2.5.2. Izokvercitrinas

8 pav. Izokvercitrino struktūrinė formulė [23]

Flavonoidų grupei priskiriamas junginys, kvercetino 3-O-gliukozidas (8 pav.). Dideli jo kiekiai randami manguose, obuoliuose, svogūnuose. Buvo nustatyta, kad izokvercitrinas gerina kraujotaką, todėl medicinoje naudojamas gydant tokias ligas kaip hemorojus, venų varikozė. Izokvercitrinas pasižymi ir neuroprotekcinėmis savybėmis [2]. Atlikti tyrimai parodė teigiamą izokvercitrino poveikį gydant progresuojančią Alchaimerio ligą, nes dėl pagerėjusios kraujotakos, pagerėja ir smegenų funkcija. Taip pat pasižymi antidirginančiomis, priešuždegiminėmis savybėmis, reguliuoja gliukozės kiekį kraujyje, gerina kasos funkciją. Izokvercitrinas pasižymi ir antioksidacinėmis savybėmis, sulėtina senėjimo procesus organizme, apsaugo ląsteles nuo laisvųjų radikalų poveikio, bei slopina laisvųjų radikalų susidarymą [13].

Laisvieji radikalai sukelia neurodegeneracinius sutrikimus ir tai yra viena iš daugelio Parkinsono ligos atsiradimo priežasčių. Tyrimo metu buvo vertinamas flavonolio izokvercitrino neuroprotekcinis poveikis žiurkių feochromocitomos ląstelėms po 6-hidroksidopamino (6-OHDA)

sukelto toksiškumo [2]. Šios ląstelės išskiria neuromediatorių dopaminą. Žiurkių ląstelės buvo padalintos į dvi grupes: paveiktos skirtingų koncentracijų izokvercetrino tirpalais (10 μM; 50 μM ir 100 μM) ir nepaveiktos (kontrolinės grupės). Abi žiurkių ląstelių grupės buvo inkubuotos 4; 8 ir 12 valandų su 100 μM 6-hidroksidopaminu (dėl oksidacinės žalos ląstelėms sukėlimo). Rezultatai parodė apsauginį izokvercitrino poveikį. Izokvercitrinu paveiktose ląstelėse, antioksidantinių fermentų kiekis (superoksido dismutazės, katalazės, glutationo peroksidazės ir glutationo) buvo didesnis, lyginant su izokvercitrinu nepaveiktomis ląstelėmis. Taip pat izokvercitrinas sumažino lipidų peroksidaciją 6-hidroksidopaminu paveiktose ląstelėse. Labiausiai lipidų peroksidaciją PC12 ląstelėse slopino 100 μM izokvercitrino koncentracija ir tai rodo nuo dozės priklausomą poveikį. Tyrimo rezultatai parodė, kad dėl savo antioksidacinių savybių izokvercitrinas apsaugojo feochromocitomos ląsteles nuo 6-hidroksidopamino sukelto oksidacinio streso [2].

2.5.3. Rutinas

9 pav. Rutino struktūrinė formulė [23]

Tai – bioflavonoidas, kvercetino ir disacharido rutinozės darinys (9 pav.). Santykinai dideli jo kiekiai randami raudonosiose vynuogėse, grikiuose, obuoliuose, įvariose arbatose [13]. Aglikonas – kvercetinas. Tirpus vandenyje. Pasižymi analgetiniu, antioksidaciniu, priešuždegiminiu poveikiu [38]. Rutinas plačiai žinomas medicinoje dėl savo sukeliamų farmakologinių poveikių, tokių kaip: kapiliarų sieneles stiprinantis ir jų pralaidumą mažinantis poveikis, aterosklerozės riziką ir trombocitų agregaciją slopinantis poveikis. Taip pat rutinas pasižymi antioksidacinėmis savybėmis ir apsauginiu poveikiu širdies mitochondrijų funkcijoms. Yra atlikta tyrimų, kurie rodo teigiamą rutino poveikį slopinant mažo tankio lipoproteinų peroksidaciją. Atlikti tyrimai taip pat patvirtino jo apsauginį poveikį etanolio sukeltiems pažeidimams [39].

Buvo tirtas rutino (30 mg/kg) antioksidacinis poveikis kadmio jonų (200 ppm) sukeltai lipidų peroksidacijai ir ląstelės antioksidacinėje apsaugoje dalyvaujančių fermentų aktyvumui [12].

Rezultatai parodė, kad kadmis sukėlė padidėjusią lipidų peroksidaciją, sumažino spermatozoidų skaičių ir sumažino testosterono koncentraciją kraujo plazmoje, sutrikdė fermentų veiklą. Ūmus apsinuodijimas kadmiu žymiai sumažėjo skyrus rutiną: išaugo antioksidantinėje apsaugoje dalyvaujančių fermentų - superoksido dismutazės, katalazės, glutationo peroksidazės, glutationo reduktazės ir glutationo S-transferazės aktyvumas [12].

Taip pat buvo ištirtas ir rutino apsauginis poveikis inkstams, po hekschlorbutadieno (HCBD) injekcijos. Heksachlorbutadienas (HCBD) yra stiprus nefrotoksinas, kuris gali būti kraujavimo, auglių, nesubrendusių nefrono ląstelių atsiradimo ir kitų sutrikimų inkstuose priežastimi. Žiurkių patelės buvo suskirstytos į penkias grupes: pirmai ir antrai grupei buvo skiriama tik heksachlorbutadieno injekcija (100 mg/kg), o 3-5 grupėms prieš heksachlorbutadieną buvo skiriamas rutinas (100; 500 ir 1000 mg/kg). Tyrimo metu buvo matuojamas karbamido ir kreatinino kiekis, lipidų peroksidacijos lygis, taip pat gliukozės, bei baltymų kiekis. Praėjus 24 val po heksachlorbutadieno paskyrimo, buvo stebimas kreatinino ir karbamido kiekio padidėjimas. Taip pat didesnis gliukozės ir baltymų lygis, bei mažesnis bendras tiolių kiekis, padidėjusi lipidų peroksidacija, lyginant su grupe, kuriai buvo skiriamas heksachlorbutadienas (100 mg/kg) kartu su rutinu (100; 500 ir 1000 mg/kg). Rutino skyrimas reikšmingai sumažino kreatinino ir karbamido kiekį, taip pat baltymų koncentraciją. Rutinas taip pat padidino HCBD sukeltą tiolių kiekio sumažėjimą ir sumažino lipidų peroksidaciją inkstuose. Šio tyrimo rezultatai parodė, kad rutinas gali susilpninti heksachlorbutadieno sukeltą nefrotoksiškumą ir gali būti laikomas nefroprotekciniu agentu [47].

Tyrimuose in vitro buvo tirtas rutino apsauginis poveikis inkstams po kalio bromato (KBrO3)

sukelto toksiškumo. Toksikologiniai tyrimai parodė, kad KBrO3 yra oksidatorius, sukeliantis toksinį

poveikį inkstams, t.y. kalio bromatas pasižymi kancerogeninėmis savybėmis ir gali skatinti piktybinių navikų atsiradimą inkstuose (sukeldamas chromosomų, genų ekspresijos pakitimus, genų mutacijas). Žiurkių patelės buvo suskirstytos į kelias grupes: pirma grupė buvo kontrolinė, antrai grupei į skrandį buvo leidžiamas kalio bromatas (20 mg/kg kūno svorio), trečiai grupei buvo skirimas kalio bromatas (20 mg/kg kūno svorio) kartu su rutinu (50 mg/kg kūno svorio), ketvirtai grupei buvo skiriamas KBrO3

(20 mg/kg kūno svorio) ir didesnė rutino koncentracija (70 mg/kg kūno svorio), o penktai grupei buvo skiriamas tik rutinas (70 mg/kg kūno svorio). Rezultatai parodė, kad KBrO3 (20 mg/kg kūno svorio)

skyrimas žiurkėms reikšmingai padidino šlapalo, kreatinino, urobilinogeno, baltymų lygį, taip pat sumažino pH ir kreatinino klirensą, lyginant su kontroline grupe. Žiurkių grupėje, kuriai buvo skiriamas KBrO3 kartu su rutinu (50 mg/kg kūno svorio), šie parametrai buvo geresni, lyginant su

grupe, kuriai buvo skiriamas tik KBrO3. Tačiau geresni parametrai buvo toje žiurkių grupėje, kuriai

kartu su KBrO3 buvo skiriama didesnė rutino koncentracija (70 mg/kg kūno svorio) ir tai rodo nuo

dozės priklausomą poveikį. Taip pat po KBrO3 skyrimo buvo pastebėti inkstų histologiniai pokyčiai:

grupe. Grupei, kuriai buvo skiriamas KBrO3 (20 mg/kg kūno svorio) kartu su rutinu (50 mg/kg kūno

svorio) šie pokyčiai buvo mažesni: mažesnė kanalėlių degeneracija, mažesnis kanalėlių išsiplėtimas, nepakitusi glomerulų kapsulė. Grupei, kuri buvo gydoma tik rutinu (70 mg/kg kūno svorio) nepastebėti histopatologiniai pokyčiai inkstuose. Žiurkių organizme, kurioms buvo skiriamas tik KBrO3 (20 mg/kg

kūno svorio), antioksidacinių fermentų (katalazės, superoksido dismutazės, glutationo peroksidazės ir kt.) veikla buvo silpnesnė, lyginant su kontroline grupe. Grupei, kuriai buvo skiriamas KBrO3 (20

mg/kg kūno svorio) kartu su rutinu (50 mg/kg kūno svorio), antioksidacinių fermentų aktyvumas buvo didesnis, lyginant su žiurkių grupe, kuriai buvo skiriamas tik kalio bromatas. Rezultatai parodė, jog rutinas gali reikšmingai sumažinti kalio bromato sukeltą toksiškumą inkstams [51].

2.5.4. Hiperozidas

10 pav. Hiperozido struktūrinė formulė [44]

Hiperozidas – flavonoidų grupei priskiriamas junginys, kvercetino 3-O-galaktozidas (10 pav.). Pasižymi priešuždegiminėmis savybėmis, naudingu poveikiu sergant širdies ir kraujagyslių ligomis, taip pat apsaugo ląsteles nuo oksidacinio streso, didina antioksidacinių fermentų aktyvumą [44], mažina bendro cholesterolio kiekį ir aktyvina superoksido dismutazės veiklą, apsaugo žiurkių kardiomiocitus nuo apoptozės, kuri atsiranda dėl išemijos ir reperfuzijos [17].

Tyrimuose, atliktuose su ląstelėmis (PC12), buvo įvertintas apsauginis hiperozido poveikis. Vandenilio peroksidas (H2O2) ir tertbutilhidroperoksidas (t-BuOOH) yra cheminiai oksidantai. Buvo

įrodyta, jog jie gali sukelti ląstelių apoptozę, įskaitant PC12 ląsteles ir fibrolastus. Taip pat jie gali pažeisti neuronus (dėl mažo antioksidantininių fermentų kiekio ir jų priklausomybės nuo mitochondrijų kvėpavimo). Tyrimo metu PC12 ląstelės 3 valandas buvo veikiamos vandenilio peroksidu (150 μM) ir tertbutilhidroperoksidu (300 μM), bei įvertintas apsauginis hiperozido (160 mg/ml ir 100 mg/ml) poveikis, bei jo antioksidacinės savybės. Rezultatai parodė, jog hiperozidas efektyviai apsaugojo PC12 ląsteles nuo citotoksinio junginių poveikio: sumažino ląstelių apoptozę,

efektyviai slopino aktyvių deguonies formų susidarymą. Tyrimo metu hiperozido apsauginis poveikis buvo įvertintas ir atliekant LDH tyrimą. LDH – stabilus citoplazmos fermentas visose ląstelėse. Jei plazminė ląstelių membrana pažeista oksidantų, jis greitai išeina iš ląstelių ir jo pokyčiai gali būti laikomi pažeistų ląstelių indikatoriumi. Po ląstelių paveikimo hiperozidu, LDH aktyvumas sumažėjo 75 %, lyginant su kontroline grupe. Rezultatai parodė, jog hiperozido antioksidacinės savybės gali apsaugoti PC12 ląsteles nuo citotoksinio poveikio, kurį sukelia H2O2 ir t-BuOOH [43].

Tyrimo metu in vitro buvo tirtas hiperozido apsauginis poveikis kepenims, kuomet pelių kepenų ląstelės buvo veikiamos anglies tetrachloridu (20 mikromol/kg (-1), kuris ir sukėlė kepenų pažeidimą. Hiperozidas susilpnino hepenų uždegimą, sumažino nekrozės procesą ir ląstelių hiperplaziją. Taip pat hiperozidas sumažino anglies tetrachlorido sukeltą lipidų peroksidaciją ir glutationo kiekio sumažėjimą kepenyse. Šie rezultatai rodo, kad hiperozidas turėjo apsauginį poveikį nuo anglies tetrachlorido sukelto ūminio kepenų pažeidimo, nes sustiprina antioksidantinę gynybos sistemą ir stabdo uždegimą [8].

2.6. Kvercetino ir jo glikozidų poveikis mitochondrijų funkcijoms

Polifenoliai pasižymi plačiu biologiniu poveikiu: geba neutralizuoti laisvuosius radikalus, dalyvauja fermentų moduliacijoje ir metalų chelatinime. Jie pasižymi ir inkstus apsaugančiu poveikiu. Atlikti tyrimai patvirtino, jog kvercetinas slopina transkripcijos procesus, susijusius su uždegiminių procesų inkstuose atsiradimu [9]. Taip pat kvercetinas pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis ir geba mažinti oksidacinę žalą dėl gebėjimo 1) neutralizuoti laisvuosius radikalus; 2) slopinti ROS gaminančius fermentus (tokius kaip ksantino oksidazė, NAD(P)H-oksidazė) ir mitochondrijų kompleksą I. Taip pat kvercetinas geba sustiprinti antioksidacinėje gynybos sistemoje dalyvaujančių fermentų veiklą, užkirsti kelią padidėjusiam kraujospūdžiui, širdies ir inkstų hipertrofijai, inkstų parenchimos ir kraujagyslių pažeidimui [9]. Teigiamas polifenolių poveikis sveikatai yra ne tik dėl jų antioksidacinių savybių, bet ir dėl antibakterinių, priešuždegiminių ir priešvėžinių savybių. Taip pat neseniai buvo nustatytas ir jų teigiamas, apsauginis poveikis mitochondrijų funkcijoms [21].

Tyrimo tyrimo metu buvo vertinamas polifenolių (kvercetino, rutino, resveratrolio, epigalokatechingalato) apsauginis poveikis mitochondrijų funkcijoms, žarnyno epitelio Caco-2 ląsteles paveikus indometacinu. Indometacinas sumažino ATP kiekį ir mitochondrijų membranos potencialą Caco-2 ląstelėse, slopino mitochondrijų I komplekso aktyvumą ir sukėlė NADH kaupimąsį. Tyrimo metu mitochondrijos, izoliuotos iš Caco-2 ląstelių, buvo veikiamos (20 min) kvercetinu (0.01 mg/ml), resveratroliu (0.1 mg/ml) ir rutinu (1 mg/ml). Buvo pastebėtas jų apsauginis poveikis Caco-2 ląstelėms

po indometacino sukelto mitochondrijų funkcijos sutrikdymo. Kvercetino apsauginis poveikis mitochondrijoms gali būti dėl jo gebėjimo patekti į ląsteles ir kauptis mitochondrijose. Be to, dėl savo struktūrinio panašumo į rotenoną, galėtų sudaryti palankias sąlygas apsaugant mitochondrijų I kompleksą nuo inhibitorių, tokių kaip indometacinas ar rotenonas. Šie rezultatai rodo galimą naują polifenolių apsauginį vaidmenį mitochondrijoms [21].

In vitro tyrimo metu buvo ištirtas ir flavonoidų (rutino, kvercetino, hiperozido, kvercitrino)

poveikis oksidaciniam fosforilinimui žiurkių širdies mitochondrijose. Nustatyta, kad esant 0,05; 0,82; 0,93 ir 1.14 ng/ml tiriamųjų junginių koncentracijai, kvercetinas, hiperozidas, kvercitrinas ir rutinas neturėjo įtakos mitochondrijų kvėpavimo greičiui antroje metabolinėje būsenoje (t.y. greičiui, nesusijusiam su ATP sinteze) [4]. Mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje padidėja (atskiriami oksidacijos ir fosforilinimo procesai), panaudojus didesnę flavonoidų koncentraciją (efektyviausias buvo kvercetino poveikis). Net maža kvercetino koncentracija (1.1 ng/ml) mitochodrijų kvėpavimo greitį antroje metabolinėje būsenoje stimuliuoja 100 %. Hiperozidas ir rutinas buvo mažiau efektyvūs, panašiam efektui pasiekti reikėjo 15,2 ng/ml hiperozido ir 44.4 ng/ml rutino. Kvercitrinas turėjo mažiausią poveikį - maksimalaus kvėpavimo antroje metabolinėje būsenoje stimuliavimas sudarė tik 25 % [4]. Nustatytos koncentracijos, kurioms esant kvercetinas (1,08 ng / ml ir didesnės), hiperozidas (10 ng/ml ir didesnės) ir rutinas (60 ir 115 ng/ml) mažina mitochondrijų kvėpavimo greitį trečioje metabolinėje būsenoje (t.y. ATP sintezę), bei kokios koncentracijos neturi įtakos šiam greičiui. Kvercitrino poveikis nežymus [4]. Flavonoidai yra silpnos rūgštys, turinčios hidrofobinių savybių. Rezultatai parodė, kad net labai maža kvercetino ir jo darinių koncentracija (nM ribose) sukelia širdies mitochondrijų oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimą [4].

Laikantis dietos, kurioje gausu flavonoidų, sumažėja rizika susirgti širdies ir kraujagyslių ligomis, tokiomis kaip miokardo infarktas. Tyrimo metu in vitro, žiurkėms po oda buvo suleistas izoproterenolis ir tokiu būdu sukeltas toksinis jo poveikis širdžiai. Izoproterenolis sukėlė mitochondrijų lipidų peroksidacijos produktų padidėjimą, taip pat labai sumažino mitochondrijų antioksidantinių fermentų veiklą ir ATP sintezės aktyvumą. Buvo pastebėtas serumo laktato dehidrogenazės–1 padidėjmas. Paskyrus rutiną (80 mg/kg per parą) 42 dienas, šie biocheminiai pokyčiai buvo sumažinti. Mikroskopiniai tyrimai taip pat patvirtino rutino apsauginį poveikį širdies mitochondrijų struktūrai. Taigi, rutinas sumažino izoprotenerolio sukeltą pažeidimą mitochondrijoms ir padėjo išvengti širdies mitochondrijų disfunkcijos. Rutinas sumažino laisvųjų radikalų kiekį, lipidų peroksidaciją, lipidų ir kalcio kiekio padidėjimą, pagerino multifermentinių sistemų veiklą, normalizavo glutationo kiekį, ATP kiekį ir taip turėjo apsauginį poveikį širdies mitochondrijų struktūrai ir funkcijoms [18].

3. TYRIMO METODIKA IR METODAI

3.1. Tyrimų pobūdis

Magistriniame darbe buvo tiriamas flavonoido kvercetino ir jo glikozidų poveikis žiurkės inkstų mitochondrijų funkcijoms. Tyrimams naudojome Wistar veislės žiurkes (leidimo atlikti bandymus su laboratoriniai gyvūnais Nr. 0217). Tyrimų pobūdis – in vitro.

Eksperimentinės žiurkės buvo užmigdytos anglies dioksido dujomis. Po to išimamas inkstas. Žiurkės inkstų mitochondrijos izoliuotos diferencinio centrifugavimo metodu. Flavonoidų poveikis žiurkės inkstų mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai buvo tiriamas naudojant poliarografinį metodą. Kiekvienas eksperimentas buvo kartojamas mažiausiai 3 kartus, vidurkiai apskaičiuoti su standartinėmis paklaidomis. Eksperimentinė dalis buvo atlikta Lietuvos Sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto biochemijos laboratorijoje, naudojantis jų įranga ir medžiagomis.

3.2. Terpės, aparatūra, indai

3.2.1 Aparatūra, indai

Eksperimentinėje dalyje buvo naudojama CO2 kamera; audinio susmulkinimui -

homogenizatorius (Sartorius); centrifuga; ledų vonelė; magnetinė maišyklė; 37 o

C vandeninis termostatas; spektrofotometras; Klarko tipo deguonies elektrodas; Biomed poliarografinė sistema su kompiuteriu; cilindrai; mėgintuvėliai; kiuvetės; mikrošvirkštai (Hamilton).

3.2.2. Terpės

Mitochondrijų izoliavimo terpės sudėtis (pH 7,3; temperatūra: 0-4 o_{C): 250 mM sacharozė, 10}

mM Tris-HCl, 1 mM etilendiaminotetraacto rūgštis (EDTA).

Mitochondrijų kvėpavimo greičio matavimui naudotos inkubacijos terpės sudėtis: 150 mM KCl; 5 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 10 mM Tris-HCl. (pH 7,2; temperatūra: 37 oC).

3.3. Mitochondrijų išskyrimas

Diferencinio centrifugavimo metodu izoliuojame mitochondrijas. Izoliavimo procedūros temperatūra 4 o_{C. Nuo išskirtų iš laboratorinės žiurkės inkstų nuimama plėvelė ir inkstai praplaunami}

0,9 % KCl (4 oC). Išimame audinį iš KCl tirpalo, žirklutėmis susmulkiname stiklinėlėje, kuri padėta ant ledo gabaliukų. Pripilame izoliavimo terpės ir audinį homogenizuojame.

Gautą homogenatą centrifuguojame du kartus. Pirmą kartą centrifuguojame 750 x g, 5 min, po to gautą po centrifugavimo tirpalą perpilame per dvigubą marlės sluoksnį (filtras) ir centrifuojame antrą kartą 10000 x g greičiu, 10 min. Baigę centrifuguoti, supernantą atsargiai nupilame ir izoliavimo terpėje (~25 ml) suspenduojame mitochondrijų nuosėdas. Dar kartą centrifuguojame 10 min 10000 x g greičiu. Po centrifugavimo mitochondrijas suspenduojame 250 μl izoliavimo terpėje. Mitochondrijų suspensiją laikome lede.

3.4. Baltymo kiekio mitochondrijų suspensijoje nustatymas biureto metodu

Mitochondrijų suspensijoje esantis baltymo kiekis nustatomas biureto metodu [54]. Į mėgintuvėlį įpilame 25 µl mitochondrijų suspensijos, 975 μl 0,33 % dezoksicholato tirpalo ir 4 ml biureto reagento. Talpiname mėgintuvėlį į 37 °C vandens termostatą (30 min). Spektrofotometru išmatuojame tirpalų optinį tankį, 536 nm bangos ilgyje. Baltymo kiekis nustatomas pagal kalibracinę kreivę.

3.5. Mitochondrijų kvėpavimo greičio įvertinimas

Mitochondrijų kvėpavimo greitį inkubacijos terpėje (esant 37 o

C), įvertiname poliarografiškai

(BioMed poliarografine sistema, terpės sudėtis pateikta 3.2.2. skyrelyje). Tyrimo metu mitochondrijų kvėpavimo greitį (O2 sunaudojimas terpėje per laiko vienetą) stebėjome naudojant substratus –

glutamatą (5 mM) ir malatą (2 mM). Į matavimo terpę pirmiausiai įvedėme substratus, o kuomet greitis tapo pastovus – įvedėme 0,5 mg/ml mitochondrijų suspensiją ir stebėjome mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje metabolinėje būsenoje (V2), kuomet terpėje yra deguonies, mitochondrijų, bei

oksiduojamųjų substratų.

Kuomet mitochondrijų kvėpavimo greitis tapo pastovus, į terpę pridėjome flavonoidų, siekiant įvertinti jų poveikį baziniam (V2) mitochondrijų kvėpavimui. Į matavimo kiuvetę pridėjome skirtingus

paruošto atitinkamo flavonoido tirpalo, galutinė flavonoido koncentracija kiuvetėje buvo 3 nM. Tyrimams buvo naudojami etanoliniai tiriamųjų junginių (kvercetino, rutino, hiperozido, izokvercitrino) tirpalai (kaip tirpiklis naudotas 96 % etanolis). Eksperimentuose naudoti 96 % etanolio kiekiai poveikio mitochondrijų funkcijoms neturėjo. Paruošti etanoliniai flavonoidų tirpalai buvo pridedami: a) antroje metabolinėje būsenoje (nesant ADP); b) trečioje metabolinėje būsenoje (esant ADP). Vėliau į terpę įdėjome ADP (6 mM). Adenozino difosfatą pradeda fosforilinti ATP sintazė. Mitochondrijų kvėpavimo greitis, po ADP pridėjimo, vadinamas mitochondrijų trečiąja metaboline būsena (V3). Trečioje metabolinėje būsenoje (V3) stebime mitochondrijų gebėjimą sintetinti ATP.

Nustatyta, kad 37 oC temperatūroje, 1 ml inkubacinės terpės yra ištirpę 420 nanomolių deguonies. Kvėpavimo greitis išreiškiamas nmolO/min/mg mitochondrijų baltymo. Flavonoidų poveikis (efektas %) mitochondrijų kvėpavimo greičiui antroje ar trečioje metabolinėse būsenose išreiškiamas kaip kvėpavimo greičio atitinkamoje metabolinėje būsenoje padidėjimas (%) į matavimo terpę įdėjus atitinkamą kiekį flavonoido. Apskaičiuojame pagal formulę:

a) Flavonoidų poveikis į V2 (%) =





V2 – mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje.

b) Flavonoidų poveikis į V3 (%) =





V3 – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje.

3.6. Statistinė analizė

Gautų duomenų vidurkiai pateikiami su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis. Kiekvienas eksperimentas buvo kartojamas mažiausiai 3 kartus. Duomenų vidurkiai statistiškai palyginti (student‘s t-test), skirtumai tarp vidurkių statistiškai reikšmingi, jei p < 0,05. Statistinė analizė atlikta naudojant programą SigmaPlot 11.0.

4. TYRIMO REZULTATAI

4.1. Kvercetino ir jo glikozidų poveikio oksidacinio fosforilinimo sistemai žiurkės

inkstų mitochondrijose tyrimas

Siekiant įvertinti kvercetino ir jo glikozidų (rutino, hiperozido, izokvercetrino) poveikį žiurkių inkstų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms, buvo tirta glutamato ir malato oksidacija. Buvo įvertintas kvercetino ir jo glikozidų poveikis žiurkės inkstų mitochondrijų kvėpavimo greičiams antroje ir trečioje metabolinėse būsenose.

4.1.1. Kvercetino ir jo glikozidų poveikis mitochondrijų kvėpavimui antroje

metabolinėje būsenoje

Pirmiausiai ištyrėme kvercetino ir jo glikozidų (rutino, hiperozido, izokvercitrino) poveikį mitochondrijų kvėpavimo greičiui antroje metabolinėje būsenose (t.y. greičiui, nesusijusiam su ATP sinteze), oksiduojant substratus: glutamatą ir malatą. Pridėjus 0,5 μl kvercetino (3 nM), mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo stimuliuojamas 28 % (p < 0,05) (11 pav.). Toliau didinant kvercetino koncentraciją, efektas išliko panašus (25 - 32 %). Didžiausias kvercetino poveikis buvo stebimas padidinus jo koncentraciją iki 48 nM (įdėjus 8 µl kvercetino tirpalo), nes mitochondrijų kvėpavimas buvo stimuliuojamas net 39 %. Taigi, kvercetinas padidino inkstų mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje metabolinėje būsenoje 25 - 39 %, t.y. atskyrė oksidacijos ir fosforilinimo procesus.

11 pav. Kvercetino poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui antroje metabolinėje būsenoje, oksiduojant substratus glutamatą (5 mM) ir malatą (2 mM).

*p < 0,05 lyginant su kontrolinių (t.y. terpėje nesant kvercetino) mitochondrijų kvėpavimo

greičiu antroje (V2) metabolinėje būsenoje. n = 3 - 6. Kontrolinių mitochondrijų kvėpavimo greičio

vidurkis V2 = 40 ± 6 nmolO/min/mg mitochondrijų baltymo; V3 = 200 ± 15 nmolO/min/mg

mitochondrijų baltymo.

Palyginimui ištyrėme kvercetino glikozido – hiperozido (kveretino 3-O-galaktozido) poveikį šiam parametrui. Įdėjus 0,5 µl hiperozido tirpalo (3 nM), mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje (V2) statistiškai reikšmingai padidėjo 12 %, t.y. du kartus mažiau, nei esant tai

pačiai kvercetino koncentracijai. Padidinus jo koncentraciją iki 6 nM, mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo 15 % (p < 0,05), bet taip pat išliko du kartus mažesnis, nei kvercetino atveju. Maksimalus poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui (V2) pasireiškė įdėjus 2 µl ir 4 µl hiperozido tirpalo (12 -

24 nM), nes stimuliavimas padidėjo 25 %. Toliau didinant hiperozido koncentraciją (48 nM), mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje išliko 17 % didesnis, nei nesant flavonoido (12 pav.). Tokie atvejai stebimi naudojant klasikinius oksidacijos ir fosforilinimo procesų skyriklius (CCCP ir FCCP), kai toliau didinant jų koncentraciją, atskyrimo efektas nebedidėja, o priešingai – ima mažėti, tačiau išlieka didesnis, nei pats mitochondrijų kvėpavimas antroje metabolinėje būsenoje.

12 pav. Hiperozido poveikis mitochondrijų kvėpavimo greičiui antroje metabolinėje būsenoje,

oksiduojant substratus glutamatą (5 mM) ir malatą (2 mM).

*p < 0,05 lyginant su kontrolinių (t.y. terpėje nesant hiperozido) mitochondrijų kvėpavimo

greičiu antroje (V2 ) metabolinėje būsenoje. n = 3 - 6. Kontrolinių mitochondrijų kvėpavimo greičio

vidurkis V2 = 40 ± 6 nmolO/min/mg mitochondrijų baltymo, V3 = 200 ± 15 nmolO/min/mg

mitochondrijų baltymo.

Mažiausiu poveikiu mitochondrijų kvėpavimui antroje metabolinėje būsenoje (V2)

mitochondrijų kvėpavimo greičiui, nesusijusiam su ATP sinteze (V2), statistiškai reikšmingo poveikio

neturėjo (13 pav.). Padidinus rutino tirpalo kiekį iki 8 µl (48 nM), mitochondrijų kvėpavimas statistiškai reikšmingai padidėjo net 19 % (p < 0,05). Rezultatai parodė, kad tik esant didesnėms rutino koncentracijoms atskiriami oksidacijos ir fosforilinimo procesai, tačiau efektas yra ryškiai mažesnis, nei kvercetino.

13 pav. Rutino poveikis mitochondrijų mitochondrijų kvėpavimo greičiui antroje metabolinėje būsenoje, oksiduojant substratus glutamatą (5 mM) ir malatą (2 mM).

*p < 0,05 lyginant su kontrolinių (t.y. terpėje nesant rutino) mitochondrijų kvėpavimo

greičiu antroje (V2 ) metabolinėje būsenoje. n = 3 - 6. Kontrolinių mitochondrijų kvėpavimo greičio

vidurkis V2 = 40 ± 6 nmolO/min/mg mitochondrijų baltymo, V3 = 200 ± 15 nmolO/min/mg

mitochondrijų baltymo.

Izokvercitrinas (kvercetino 3-O-gliukozidas) mitochondrijų kvėpavimo greitį antroje metabolinėje būsenoje stimuliavo nuo 18 % iki 34 %. Mažiausias poveikis šiam parametrui buvo įdėjus 0,5 µl izokvercitrino tirpalo (3 nM), nes stimuliavimas siekė tik 18 %. Didžiausias poveikis buvo padidinus izokvercitrino koncentraciją iki 6 nM, nes mitochondrijų kvėpavimo greitį (V2)

padidino iki 34 % (14 pav.). Toliau didinant izokvercitrino koncentraciją efektas išliko panašus (23 - 31%).