V Congresso Nazionale “Le Micotossine nella Filiera Agro-Alimentare” 28-29-30 Settembre 2015 Istituto Superiore di Sanità - Roma
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Michele Solfrizzo**, Rita Bibi*, Martina Ciriaci*, Lucia Gambacorta **, Angela Paoloni*, Ivan Pecorelli*
*Istituto Zooprofilattico Sperimentale Dell’Umbria e delle Marche, Area Sicurezza Alimentare, Via Salvemini 1 - 06126 Perugia
** CNR, Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari, Via Amendola 122/o - 70126 Bari
Progetto di Ricerca Corrente realizzato con i fondi del Ministero della Salute, RC 13/2011 IZSUM
Tempo (min)
Flusso (µL/min)
Fase Mobile A % (H2O 0.1% HCOOH 0.1 mM
AcONH4)
Fase Mobile B % (MeOH 0.1% HCOOH 0.1 mM
AcONH4)
0 500 85 15
1,2 500 85 15
2 500 35 65
7 500 35 65
7,1 500 85 15
12 500 85 15
Molecola/transizione R.T.
(min)
Q1 (amu)
Q3
(amu) DP EP CE CXP
DON 1 2.1 297 249 43 4.3 15 3.7
DON 2 2.1 297 203 43 4.3 18 2.4
AFL G21 4.2 331 313 72 6.5 27 4.3
AFL G2 2 4.2 331 245 72 6.5 40 4.3
AFL G11 4.2 329 243 64 6.0 35 3.1
AFL G12 4.2 329 215 64 6.0 40 3.7
AFL B21 4.3 315 259 70 5.0 37 3.4
AFL B22 4.3 315 287 70 5.0 34 4.2
AFL B11 4.4 313 241 72 3.8 48 2.5
AFL B12 4.4 313 213 72 3.8 56 2.6
HT2 1 4.9 442 263 33 4.0 17 2.2
HT2 2 4.9 442 215 33 4.0 23 2.2
FUMB11 5.0 723 334 87 11.0 56 3.5
FUMB12 5.0 723 352 87 11.0 48 3.9
T2 1 5.3 484 215 37 3.9 26 2.3
T2 2 5.3 484 305 37 3.9 23 4.7
FUMB31 5.7 707 337 92 7.2 45 2.4
FUMB32 5.7 707 355 92 7.2 45 2.4
ZON 1 6.0 319 283 40 5.1 18 4.6
ZON 2 6.0 319 187 40 5.1 26. 2.4
OTA 1 6.1 404 239 43 5.1 30 3.9
OTA 2 6.1 404 221 43 5.1 48 2.9
FUMB21 6.9 707 337 92 7.2 45 2.4
FUMB22 6.9 707 319 92 7.2 52 2.4
Tabella 4: Parametri strumentali di acquisizione degli analiti.
DETERMINAZIONE MULTI-MICOTOSSINA IN CEREALI E MANGIMI
MESSA A PUNTO E VALIDAZIONE DI UNA METODICA IN LC-MS/MS:
ATTIVITÀ SVOLTE NELL’AMBITO DELLA RICERCA CORRENTE FINANZIATA DAL MINISTERO DELLA SALUTE
Tabella 3: Condizioni Cromatografiche Colonna Thermo Hypersil GOLD 5 µ; 100x2.1 mm.
Performance del metodo (Recupero % e Ripetibilità) MANGIMI
DON AFLG2 AFLG1 AFLB2 AFLB1 FUM B1 HT2 FUM B3 FUM B2 T2 OTA ZON
Calibrazione Esterna
Recu pero
%
72 87 82 80 68 88 102 87 85 78 86 66
DS 7 10 6 10 1 5 8 7 8 8 10 12
RSDr
% 9 11 7 13 1 6 8 8 9 11 11 18
Calibrazione interna
Recu pero
%
80 95 78 79 72 94 102 100 94 76 86 55
DS 11 13 10 17 6 5 2 12 3 1 4 22
RSDr
% 14 14 13 21 8 5 2 12 4 1 5 39
Performance del metodo (Recupero % e Ripetibilità) MAIS
DON AFLG2 AFLG1 AFLB2 AFLB1 FUM B1 HT-2 FUM B3 FUM B2 T-2 OTA ZON
Calibrazione Esterna
Recupe
ro % 81 87 73 87 75 71 82 73 69 50 103 61
DS 11 5 24 6 10 24 25 24 27 28 56 16
RSDr% 14 6 32 7 14 34 31 33 40 55 54 27
Calibrazione interna
Recupe
ro % 87 85 88 78 75 73 99 89 78 70 82 61
DS 13 9 13 2 8 22 14 20 22 7 22 17
RSDr% 15 10 15 3 11 30 14 22 28 10 26 28
Le micotossine sono metaboliti secondari prodotti da funghi microscopici che infestano un gran numero di alimenti destinati al consumo umano e zootecnico. A causa dei loro molteplici ed importanti effetti tossici la loro presenza costituisce un serio pericolo per la salute degli uomini e degli animali.
Al fine di tutelare la salute pubblica, l’Unione Europea, ha stabilito una serie di tenori massimi di tali sostanze ammessi negli alimenti e nei mangimi. La letteratura scientifica riporta non solo casi di contaminazione multipla da micotossine negli alimenti e mangimi, ma anche, effetti sinergici dovuti all’assunzione di più micotossine contemporaneamente.
E’ quindi necessario mettere a punto metodiche analitiche che consentano la rilevazione simultanea di tutte le molecole per le quali il Legislatore Comunitario ha fissato dei limiti massimi in alimenti e mangimi, che al contempo, forniscano dati sulla loro simultanea presenza al fine della valutazione del rischio complessivo. A tale scopo è stata messa a punto e validata una metodica analitica multiresiduo e multiclasse che consente, per mezzo della spettrometria di massa tandem accoppiata all’HPLC, la contemporanea rilevazione di aflatossine B
1, G
1, G
2, B
2, Ocratossina A, Zearalenone, Deossinivalenolo, Tossina T-2, HT-2, Fumonisine B
1, B
2e B
3in cereali ed alimenti ad uso zootecnico con purificazione mediante colonnine di immunoaffinità multianticorpo in tandem di tipo AOF (AFL/OTA/ZON) e DZT (DON/ZON/T2HT2).
La separazione e rivelazione è stata ottenuta mediante un'unica corsa cromatografica con interfaccia di tipo ESI
+. Il metodo è stato validato su alimenti a base di cereali ed alimenti ad uso zootecnico verificando le performance in termini di linearità strumentale, effetto matrice, limite di quantificazione (LOQ), recupero, precisione in condizioni di ripetibilità. La metodica consente di rilevare tutte le molecole oggetto dello studio a livelli compatibili con i limiti di legge ed ha delle performance in linea con quanto previsto dalla normativa vigente.
La metodica prevede l’estrazione degli analiti dalla matrice mediante miscela binaria MeOH/H
2O. La miscela di estrazione viene tamponata con PBS e purificata mediante colonnine IAC in tandem. Dopo lavaggio, le colonnine IAC, vengono eluite con MeOH e H
2O e gli estratti purificati e concentrati vengono iniettati in LC-MS/MS monitorando due transizioni per ciascuna molecola. Gli analiti vengono quantificati mediante retta di calibrazione esterna in solvente per la matrice zootecnica e mediante calibrazione interna ed esterna in solvente (a seconda della molecola utilizzando gli analoghi marcati
13
C) per quanto concerne gli alimenti destinati all’uomo.
La metodica proposta, che ha come suo punto di forza la semplicità da un punto di vista operativo, permette con un unico processo di estrazione/purificazione la contemporanea rivelazione e quantificazione di tutte le micotossine attualmente normate dalla UE (+
Fumonisina B3) negli alimenti e nei mangimi tenendo conto rispettivamente, degli specifici tenori massimi e dei tenori di riferimento previsti dalla legislazione. I risultati ottenuti dalla validazione sono conformi alle prescrizioni della normativa europea di settore e, di conseguenza, il metodo può essere utilizzato per il controllo ufficiale di micotossine in alimenti e mangimi. Gli ottimi risultati dello studio di validazione del metodo analitico e i valori di z-score ottenuti dalla partecipazione ai PT, confermano la robustezza del metodo messo a punto in questo studio.
TEST VERITAS MA 1550 A-1 (Mais)
AFL B1 AFL B2 AFL G1 AFL G2 FUM B1 FUM B2 FUM B1+ B2
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score Metodo Mult-
imicotossina (LC-
MS/MS) 14,00
18,10 0,96
1,25
1,71 1,62
5,06
8,80 3,36
Non assegnato
0,89 --
4326
4696 0,34
Non assegnato
506 --
5202
5202 0,00
Metodo utilizzato nel laboratorio
14,05 0,00* 1,32 0,20* 6,60 1,40* 1,02 -- N.A. -- N.A. -- 3640 -1,20
HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL ELISA
TEST VERITAS MA 1550 A-2 (Mais)
AFL B1 AFL B2 AFL G1 AFL G2 FUM B1 FUM B2 FUM B1+ B2
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score Metodo Multi-
micotossina (LC-
MS/MS) 5,99
7,30 1,00
0,51
0,64 0,76
Non assegnato
3,20 --
Non assegnato
ND --
1755
1893 0,31
Non assegnato
192 --
2085
2085 0,00
Metodo utilizzato nel laboratorio
6,26 0,20* 0,57 0,50* 3,74 -- 0,47 -- N.A. -- N.A. -- 1093 -1,90
HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL ELISA
TEST VERITAS F1553 A-1 (Mangime)
AFL B1 OTA
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score Metodo Multi-
micotossina (LC-
MS/MS) 16,78
19,00 0,50*
< 0,50
< 20,00 Soddisfacent e*
Metodo utilizzato nel laboratorio
21.10 0,87 < 25,00 soddisfacente
HPLC-FL HPLC-FL
TEST VERITAS 1576 A (Mais) DON
Valore assegnato
(mg/Kg)
Valore rilevato (mg/Kg)
Z-score Metodo Multi-
micotossina (LC- MS/MS)
1,230
1,518 1,06 Metodo utilizzato nel
laboratorio (KIT ELISA)
1,276 0,20
Per verificare le performance analitiche del metodo, il laboratorio ha partecipato ad una serie di PT. Nelle tabelle sono riportati i risultati ottenuti con il metodo multi-micotossina confrontati con quelli ottenuti con i metodi standard attualmente utilizzati dal Laboratorio.
I valori di z-score contrassegnati con asterisco sono ricavati dai dati del PT
Il metodo è stato validato verificando le performance in termini di recupero % e ripetibilità su alimenti ad uso umano a base di mais e su mangimi. Le due matrici sono state fortificate a tre diversi livelli di concentrazione di ciascuna micotossina. I livelli di fortificazione variano tra 0,14-1609 µg/kg per gli alimenti e 0,58-4024 µg/kg per i mangimi. Il LOQ è stato verificato valutando le performance sperimentali al livello di concentrazione opportuno. I valori globali ottenuti per le due matrici sono riportati nelle tabelle 1 e 2. I risultati ottenuti con rette di calibrazione con e senza standard marcati con 13C sono comparabili grazie all’efficienza della purificazione su colonnine ad immunoaffinità ed alla buona separazione cromatografica.
Figura. 1: Total Ion Current (TIC) delle micotossine in LC-MS/MS
TEST VERITAS F1553 A-2 (Mangime)
AFL B1 OTA
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score
Valore assegnato
(µg/Kg)
Valore rilevato (µg/Kg)
Z-score Metodo Multi-
micotossina (LC-
MS/MS) < 0,50
< 2,00 Soddisfacen
te* 17,10
< 20,00 Soddisfacent e*
Metodo utilizzato nel laboratorio
< 2,00 soddisfacent
e < 25,00 soddisfacente HPLC-
FL HPLC-FL
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PARTECIPAZIONE A PROFICIENCY TEST.
Tabella 1 Tabella 2
