Analisi PLS-DA [6]

Anche se i cromatogrammi dei profili aromatici contengono informazioni abbondanti, che possono essere associate alle proprietà macroscopiche del campioni (come la loro qualità, origine, condizioni di processo), l’uso di modelli statistici come la PCA e l’LDA sono necessari per interpretare questi dati in modo fruttuoso, ma ancor di più lo è l’analisi PLS-DA [4, 50, 55, 58-60]. In totale i composti volatili identificati in modo “putativo” nei campioni sono stati 111 (Tabella 2): 32 esteri, 31 terpeni, 18 alcoli, 8 acidi, 7 chetoni, 5 aldeidi, 4 fenoli, 3 eteri e 3 idrocarburi. Mentre nel paragrafo precedente la selezione dei marker è stata effettuata sulla base dei valori di R match, per l’approccio PLS-DA, prima di costruire il modello di classificazione, i dati derivanti da tutti i profili cromatografici dei campioni (sottoforma di TIC) sono stati rielaborati per rimuovere il più possibile la varianza non informativa presente. In particolare, all’inizio è stata effettuata una correzione della linea di base (baseline) di ogni cromatogramma usando l’algoritmo Penalized Asymmetric Least Squares [61, 62], che sfrutta la possibilità di correggere i due metaparametri ʎ e p (che governano, rispettivamente, quanto deve essere piatta la linea di base stimata e in quale misura può includere parti di un picco cromatografico): nello specifico, il valore di ʎ è stato impostato a 103_{, mentre quello di p a 0.005. Successivamente i dati, poiché i cromatogrammi}

possono essere affetti da piccole variazioni dei tempi di ritenzione dei picchi, che può influire sulla qualità del successivo trattamento chemiometrico, sono stati ulteriormente allineati usando

59 iCoshift [63]. Dunque, una volta rielaborati i dati, il data-set è stato suddiviso in due sottoinsiemi, come fatto già in precedenza per l’LDA, il training set e il test set: il training set è utilizzato per costruire il modello di classificazione, le cui prestazioni sono quindi indipendenti, il quale viene poi convalidato sul test set. Operativamente, la scelta dei campioni da includere nei due set è stata effettuata mediante l’applicazione dell’algoritmo Duplex, separatamente, ad ogni categoria: l’uso di questo algoritmo consente di avere in entrambi i set dei dati dei campioni che rappresentino complessivamente la distribuzione, in modo che i risultati della convalida siano il più imparziali possibile. In particolare, 52 campioni (25 birre industriali e 27 birre artigianali) sono stati selezionati come training set, mentre i restanti 27 (12 birre industriali e 15 birre artigianali) sono stati lasciati fuori come set di validazione esterno (test set). La complessità ottimale del modello PLS-DA è stato selezionato come quello che porta alla maggiore precisione di classificazione (cioè la classificazione con errore inferiore) espresso in percentuale, in una procedura di convalida incrociata (cross validation) 7 volte, con il risultato di 3 variabili latenti (LV): i risultati del modello corrispondente sono riportati nella Tabella 4.

I risultati del modello PLS-DA mostrano un tasso di classificazione corretto pari al 96.2% in calibrazione e al 94.2% in cross-validation, con solamente 2 campioni classificati in modo errato dal modello ottimale in calibrazione e 3 campioni in cross-validation. Per la fase di validazione, il modello è stato applicato al test set e solo 1 campione (industriale) su 27 è stato classificato erroneamente, quindi la previsione complessiva (prediction) di precisione è stata pari al 96.3%. In Figura 27 è possibile apprezzare visivamente la differenziazione fornita dal modello tra le due categorie: questa mostra un’evidente separazione tra i campioni di birra ottenuti con processo industriale (in blu) e quelli prodotti con metodo artigianale (in rosso). Inoltre, il grafico delle proiezioni mostra come i campioni di test si estendono nello stesso sottospazio di quelli di training, come previsto dall’algoritmo Duplex.

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Figura 27. Modello PLS-DA che discrimina i campioni di birre artigianali dai campioni industriali. Proiezione

dei dati di training e test nello spazio occupato dalle prime due variabili latenti (LV1, LV2) del modello. Legenda: cerchi rossi - birre artigianali; quadrati blu - birre industriali; i simboli vuoti indicano i campioni di

training mentre quelli pieni indicano il test set.

Per valutare in termini chimici le differenze sorte tra i due gruppi di birre analizzati, sono stati calcolati i Variable Importance in Projection (VIP) scores del modello PLS-DA. Gli indici VIP [64] sono indici che quantificano la misura in cui le singole variabili sperimentali contribuiscono al modello PLS-DA: maggiore è il valore degli indici VIP, più rilevante è la variabile. Gli indici VIP sono valori normalizzati, in modo tale che tutti i predittori con un valore VIP > 1 vengono considerati rilevanti: la soglia di 1 rappresenta il valore medio dell’indice su tutte le variabili coinvolte, e consente dunque di identificare quali predittori contribuiscono in misura significativa alla differenziazione delle birre artigianali rispetto alle birre industriali. I VIP scores del modello di classificazione sono presentati in forma grafica in Figura 28: le regioni del cromatogramma che contribuiscono in modo significativo al modello PLS-DA (dunque con VIP > 1) sono evidenziate sul profilo cromatografico medio dei campioni in rosso e in blu, a seconda che il segno del coefficiente di regressione associato sia, rispettivamente, positivo o negativo. Le informazioni ottenute combinando i valori dei coefficienti di regressione PLS con gli indici VIP, suggeriscono quali composti sono rilevanti per discriminare le due tipologie di campioni e forniscono anche un’indicazione del segno della variazione osservata (cioè, se un metabolita è più alto o più basso in una categoria rispetto all’altra). I risultati ottenuti sono riportati nella Tabella 5: complessivamente, solo 13 composti volatili sono stati identificati simultaneamente in tutte le 79 birre analizzate, e sono dunque rilevanti per la discriminazione tra i campioni. Nella tabella, appunto, le celle colorate evidenziano i composti che sono rilevanti per le diverse categorie di

61 birre: il blu indica una maggiore quantità del marker nei prodotti industriali, mentre le celle in rosso nelle birre artigianali. Attraverso la valutazione delle concentrazioni medie, espresse come area (TIC), dei marker così selezionati (Figura 29) sembra che le birre artigianali siano caratterizzate da un contenuto più elevato di etile ottanoato, etil decanoato e β-linalolo, mentre i composti 3-metilbutil acetato, 2-metilpropile 2-metilpropanoato, etilanoanoato, 2-feniletanolo, acido ottanoico e 2-feniletilacetato, sono più concentrati nei campioni industriali. Il contributo della maggior parte di questi volatili è in genere responsabile di varie note aromatiche; infatti, come già trattato nel paragrafo precedente, gli esteri sono spesso caratterizzati da un proprio aroma di frutta [65]: ad esempio, l’etilottanoato e l’etil decanoato sono caratterizzati dall’aroma di mela, mentre, il 3-metilbutil acetato è caratterizzato dall’aroma di banana. I dati statistici, dunque, mostrano che questi composti esterei possono rappresentare possibili marker per discriminare i campioni di birra appartenenti alle due classi. Come anche il 2-feniletanolo, prodotto del metabolismo dei lieviti, che potrebbe essere considerato un marker per i parametri di fermentazione [66]. Anche gli acidi carbossilici, responsabili di aromi particolari (quali frutti, formaggio, grassi), contribuiscono all’amarezza, all’astringenza, oppure a note rancide, come l’acido ottanoico (o acido caprilico) [67]: questo composto è impiegato nella lavorazione degli alimenti per la sua attività antimicrobica, ma può avere effetti tossici sui lieviti Saccharomyces cerevisiae, inibendo la crescita della popolazione fungina ma, di contro, aumentando il tasso medio di fermentazione. L’esanoato di etile (estere dell’acido caprilico) è caratterizzato da caratteristiche aromatiche simili dell’acido ottanoico, mentre i terpeni β-linalolo e β-mircene sono particolarmente importanti poiché, derivando dal luppolo, apportano note floreali [49, 67].

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Figura 28. Interpretazione chimica del modello PLS-DA che discrimina le birre artigianali dai campioni

industriali in base agli indici VIP e ai coefficienti di regressione.

Tabella 5. Elenco dei 13 marker aromatici dedotti dalle informazioni ottenute combinando i valori dei

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Figura 29. Rappresentazione grafica delle concentrazioni (espresse come aree, TIC) per ognuno dei 13 marker identificati per le due categorie di birre.

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PARTE II

Tutela dei prodotti italiani: