Pre-trattamento dei campioni e materiali utilizzat

La prima parte del lavoro ha previsto l’utilizzo della tecnica analitica di estrazione solvent-free HS- SPME e della tecnica cromatografica altamente sensibile GC-MS, visto che nei distillati, come nelle matrici alimentari in genere, le concentrazioni assolute e la tipologia dei composti volatili non sono note: infatti, le sostanze aromatiche si formano e si degradano continuamente attraverso una miriade di complesse reazioni chimiche, funzione di parametri quali temperatura, umidità, pressione, pH, ecc. Tuttavia, informazioni riguardo un’analisi quantitativa relativa possono essere ottenute analizzando i campioni in condizioni costanti e misurando il conseguente risultato in produzione/rilascio dei composti volatili: i campioni di distillati sono stati trattati in modo da ottenere una matrice omogenea che garantisca una costante superficie di rilascio dei componenti volatili, con particolare attenzione ad eventuali perdite dei composti soprattutto durante la fase di pre-trattamento del campione, trattandosi di analisi di sostanze altamente volatili. Inoltre, prima dell’analisi SPME, è stata effettuata una diluizione del campione perché l’alto contenuto di etanolo nei distillati (40% v/v) genera competizione tra l’etanolo e le altre sostanze volatili, con conseguente riduzione dell’efficienza di estrazione e produzione di interferenti nella separazione cromatografica. Alcuni autori hanno dimostrato, infatti, che la diluizione a meno del 10% di etanolo provoca una perdita di sensibilità per diversi composti volatili; pertanto, sia la soluzione di standard interno (SI), utilizzato come riferimento, e sia i campioni sono stati diluiti per ottenere una concentrazione di etanolo finale del 10% [93]. Di conseguenza, per l’analisi HS-SPME/GC-MS i campioni reali sono stati così preparati: 1 mL di campione è stato diluito a 10 mL con acqua deionizzata ottenuta con sistema di purificazione Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA), addizionato la soluzione di SI a 10 mg/L e trasferito in una vial in vetro da autocampionatore da 20

86 mL contenente 2.5 g di cloruro di sodio (NaCl, 25% p/v), al fine di migliorare l’efficienza di estrazione dei composti volatili nello spazio di testa [19]. Le vials contenenti i campioni sono state immediatamente chiuse ermeticamente con setto in PTFE/silicone e ghiera in alluminio (Macherey-Nagel, Betlemme, Pennsylvania, USA) e conservate a +4°C prima di ogni analisi. Come SI è stato utilizzato 3-ottanolo (1 g/L), disciolto in etanolo (Sigma-Aldrich, Milano, Italia); la soluzione è stata successivamente diluita con acqua Milli-Q per ottenere un contenuto finale di etanolo del 10% (v/v). La seconda parte del lavoro ha previsto l’utilizzo della tecnica HPLC-DAD, utilizzata solitamente per il controllo della qualità e della sicurezza in ambito alimentare. Si tratta di una tecnica che permette l’analisi di sostanze non volatili e termicamente instabili, quali appunto i polifenoli e gli acidi organici presenti in piccole quantità nei distillati, che sono facilmente individuabili ed analizzabili anche a basse temperature. Tra gli altri vantaggi, l’utilizzo di piccole quantità di campione: operativamente, infatti, sono stati iniettati 20 μL di previa filtrazione (filtri in PTFE 0.45 µm). Tutte le analisi dei campioni sono state effettuate in duplicato. Come solventi per la preparazione della fase mobile sono stati utilizzati: acqua Milli-Q, acetonitrile (per HPLC 99.9%, Chromasolv® Sigma-Aldrich), acido formico (per HPLC ≥95%, Sigma-Aldrich). I composti polifenolici analizzati come standard di riferimento sono stati tutti acquistati con purezza maggiore del 95% (Sigma-Aldrich) (Figura 36): acido caffeico (acido idrossicinnamico, HCA), acido clorogenico (acido idrossicinnamico, HCA), acido gallico (acido idrossibenzoico, HBA), epicatechina (catechina, sottoclasse dei flavonoli o flavan-3-oli), gallocatechina (catechina, sottoclasse dei flavonoli o flavan-3-oli).

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Figura 35. Cartina geografica di Trentino Alto Adige (a sinistra) e Veneto (a destra): i punti corrispondono

alle zone di produzione dei campioni analizzati.

Figura 36. Strutture chimiche di composti standard di riferimento: acido caffeico (a), acido clorogenico (b),

89 3.1.3 Ottimizzazione dell’analisi HS-SPME/GC-MS

Il profilo aromatico dei campioni di distillati è stato determinato utilizzando un gascromatografo Trace GC-UItra dotato di un iniettore PTV (rivestimento in vetro, 2 mm i.d., 2.75 mm o.d., 120 mm) e di un autocampionatore TriPlus RSH (Thermo Fisher Scientific, Whaltam, MA, USA). Il GC è stato interfacciato con uno spettrometro di massa PolarisQ a trappola ionica (Thermo-Finnigan). L’analisi GC ha previsto l’utilizzo di una colonna capillare PEG (polietileneglicole) VF-WAXms (30 m, 0.25 mm i.d., 0.25 μm) Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA), e come gas di trasporto l’elio (He) ad una flusso costante di 1 mL min-1_{. L’iniezione è stata eseguita in modalità split, con}

split flow di 20 mL min-1_{. L’estrazione HS-SPME è stata effettuata utilizzando una fibra trifasica}

StableFlex Supelco (50/30 μm, 2 cm) composta da DVB/CAR/PDMS (divinylbenzene/carbone/polydimethylsiloxane) (Bellefonte, PA, USA). Come è noto, la tecnica SPME richiede l’ottimizzazione di diversi parametri sperimentali che influenzano significativamente l’efficienza di estrazione: secondo dati di letteratura [94-96] la fibra DVB/CAR /PDMS, combinando le caratteristiche di tre diverse fasi stazionarie, è in grado di assorbire una vasta gamma di composti volatili con diverse polarità, condizione essenziale quando vengono analizzate matrici notevolmente ricche di composti aromatici, come le bevande distillate. Dopo prove preliminari della fibra trifasica per verificare la capacità di estrazione della componente aromatica dai distillati, i risultati ottenuti hanno confermato la buona prestazione della fibra per diverse classi di composti volatili nei campioni analizzati [88]. Anche il volume del campione influisce sull’efficienza del processo di assorbimento della fibra: i test preliminari sono stati eseguiti riempiendo una fiala da 20 mL con 5, 10 e 15 mL di campione. I migliori risultati sono stati raggiunti con un rapporto volumetrico della fase liquida e spazio di testa di 1: 1; pertanto, per ulteriori test è stato scelto un volume di 10 mL, corrispondente a una concentrazione di etanolo finale del 10% (v/v). La temperatura di incubazione è un altro parametro importante: in effetti, il riscaldamento del campione fornisce ai composti volatili l’energia necessaria per superare le barriere energetiche che li legano alla matrice, aumentando la tensione di vapore degli analiti e quindi facilitando il rilascio dei composti volatili nello spazio di testa [97,98]. Sono state studiate diverse temperature di estrazione tra 20 e 50°C : sono stati selezionati otto composti, identificati nel campione di grappa preso come test, al fine di essere monitorati per ottimizzare la temperatura di estrazione. L’identificazione di questi composti è stata eseguita utilizzando una libreria di composti aromatici costruita in uno studio precedente [2], mediante la deconvoluzione e l’identificazione della massa spettrale (software di sistema, AMDIS). Gli otto composti monitorati sono: 2-metil-1-propanolo, 1-esanolo, esanale, butirrato di etile, nonanoato di metile, acido esanoico, acido ottanoico e furfurale. Tutti gli esperimenti per l’ottimizzazione della

90 temperatura di estrazione sono stati eseguiti in triplicata e i campioni sono stati mantenuti sotto agitazione costante. I risultati, ottenuti mediante il monitoraggio dell’area di picco dei composti target a diverse temperature di estrazione, ha mostrato che la concentrazione nello spazio di testa aumentava con l’aumentare della temperatura da 20 a 40°C per tutti i composti selezionati, mentre a 50°C la quantità di esteri e acidi monitorati iniziava a diminuire. Sulla base delle prove discusse, la temperatura di 40°C ha mostrato un tasso di recupero più elevato ed è stata quindi scelta per ulteriori analisi. Il tempo di assorbimento ottimale è stato infine valutato aumentando progressivamente il tempo di esposizione della fibra da 10 a 50 minuti, mantenendo il campione sotto agitazione ad una temperatura di 40°C. Per i composti target, un periodo di 20 minuti è stato sufficiente per raggiungere l’equilibrio tra le tre fasi (rivestimento polimerico, spazio di testa e campione). Dunque, un tempo di esposizione di 20 minuti e una temperatura di estrazione di 40°C sono risultati sufficienti per ottenere un’estrazione con una buona riproducibilità, come confermato anche da altri autori [93,99]. Per le analisi SPME, dunque, i campioni sono stati mantenuti per 10 minuti a 40°C per stabilire l’equilibrio tra spazio di testa e campione; dopo il tempo di incubazione, la fibra è stata esposta nello spazio di testa per 20 minuti alla stessa temperatura, ed il campione è stato mantenuto sotto agitazione; dopo il tempo di estrazione, la fibra è stata automaticamente introdotta nell’iniettore GC, in cui i composti volatili sono stati desorbiti termicamente per 3 minuti a 230°C. La temperatura del forno GC è stata programmata a 40°C per 5 minuti (costante), poi un riscaldamento fino a 150°C (alla velocità di 6°C/min) e successivamente un rapido riscaldamento fino a 230°C (alla velocità di 15°C/min); infine è stata mantenuta una temperatura costante a 230°C per 3 minuti. L’identificazione dei composti è stata eseguita con spettrometro di massa con sorgente di ionizzazione ad impatto elettronico (EI) operante a 70 eV, la modalità di acquisizione è stata in Full Scan nel range di 40-350 amu. La sorgente ionica e la temperatura della transfert line sono state mantenute entrambe a 250°C. I cromatogrammi sono stati acquisiti in modalità di corrente ionica totale (TIC). L’identificazione dei composti volatili è stata eseguita confrontando gli spettri di massa sperimentali con quelli disponibili nel database della libreria NIST MS (Mass Spectral Library, versione 2.2); l’identificazione è stata considerata soddisfacente solo per composti con R match superiore a 800. Tuttavia, come riportato anche nel caso del lavoro relativo alle birre artigianali, l’identificazione effettuata in questo modo può non essere univoca, dato che si può ottenere un’identificazione incerta nel caso di composti caratterizzati da uno spettro di frammentazione simile. Ad ogni modo, in conformità con i criteri definiti dalla Metabolomics Standards Initiative [52], i risultati qualitativi basati sulla somiglianza spettrale con il database NIST MS, senza l’uso di standard chimici di riferimento, possono essere considerati come identificazione “putativa” dei composti. Inoltre, come prova spettrale per confermare i composti identificati, sono stati determinati gli

91 indici di ritenzione di Kovats (KI) utilizzando una serie omologa di idrocarburi alifatici (C8-C20) (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) come riferimenti esterni, e molti di essi sono risultati identificabili con quelli disponibili in letteratura [S11, 53].