Materiali e metod

3.1.1 Selezione e conservazione del set di campioni

I campioni di birra analizzati nel presente lavoro di tesi sono stati acquistati in Italia presso grandi catene di distribuzione (GDO) e in negozi specializzati nella vendita di prodotti artigianali (beer shop). La selezione dei campioni è stata effettuata considerando come fattori discriminanti il prezzo di vendita e le informazioni riportate in etichetta dal produttore: nello specifico, birre industriali formato largo consumo che si posizionano come brand e costo medio/basso (prodotti ottenuti con procedimento industriale, pertanto sottoposti a pastorizzazione/microfiltrazione, ma per i quali il dettaglio del processo non è riportato in etichetta); birre artigianali ottenute secondo metodi tradizionali, selezionate per fascia di prezzo medio/alta e per le quali le condizioni di processo definite per legge sono riportate in etichetta (ad esempio, prodotto “non filtrato”, “non pastorizzato”, o “birra artigianale”). Sono state così raccolte 79 birre Lager in stile Pilsner, provenienti da diversi Paesi: 42 birre artigianali e 37 birre industriali. I campioni sono stati trattati in modo da evitare eventuali perdite dei composti volatili durante la fase di pretrattamento ed in modo da ottenere una matrice omogenea, garantendo così una superficie di rilascio dei composti volatili costante (tenendo in considerazione, per esempio, la formazione di schiuma). Prima dell’analisi, tutti i campioni sono stati conservati a 4°C e sono stati analizzati prima della data di scadenza. Per una maggiore rappresentatività, tutti i campioni sono stati aperti e immediatamente sottoposti alla procedura di preparazione del campione: dopo aver aperto la bottiglia, 5.00 g. di ciascun campione sono stati trasferiti in una vial in vetro (per autocampionatore) da 20 mL e sono stati degassati in bagno a ultrasuoni per 5 minuti a 5°C, al fine di rimuovere la CO2 presente. Successivamente, sono stati aggiunti 2.00 g. di cloruro di sodio

(NaCl, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) per preservare i campioni e migliorare l’efficienza di estrazione dei composti volatili nello spazio di testa, a causa dell’effetto salting-out [19]. Le fiale sono poi state sigillate con un setto in PTFE/silicone e ghiera in alluminio (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA), ed analizzate immediatamente.

3.1.2 Ottimizzazione dell’analisi HS-SPME/GC-MS

Il profilo aromatico dei campioni di birra raccolti è stato determinato utilizzando un gascromatografo Trace GC-UItra dotato di un iniettore PTV (rivestimento in vetro, 2 mm i.d., 2.75

49 mm o.d., 120 mm) e di un autocampionatore TriPlus RSH (Thermo Fisher Scientific, Whaltam, MA, USA). Il GC è stato interfacciato con uno spettrometro di massa quadrupolare ISQ LT (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). L’estrazione HS-SPME è stata effettuata utilizzando una fibra trifasica StableFlex Supelco (50/30 μm, 2 cm) composta da DVB/CAR/PDMS (divinylbenzene/carbone/polydimethylsiloxane) (Bellefonte, PA, USA). La fibra è stata precondizionata prima dell’analisi, e poi sono state eseguite due iniezioni a 270°C, secondo le istruzioni del produttore. L’analisi GC ha previsto l’utilizzo di una colonna capillare PEG (polietileneglicole) HP-INNOWAX (30 m, 0.25 mm, 0.15 μm) Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA), e come gas di trasporto l’elio (He) ad una flusso costante di 1 ml/min. L’iniezione è stata eseguita in modalità splitless (tempo = 1 min), con uno split ratio (rapporto di divisione) pari a 10. La temperatura dell’iniettore PTV è stata programmata da 60°C a 230°C a 14.5°C/s, mantenuta per 5 minuti. Tutti i campioni sono stati incubati per 5 minuti a 20°C, e la fibra è stata successivamente esposta per 10 minuti nello spazio di testa, alla stessa temperatura. Dopo il tempo di estrazione, la fibra è stata inserita nell’iniettore GC, in cui i composti volatili sono stati desorbiti termicamente per 3 minuti a 230°C. È stato poi applicato il seguente programma di temperatura del forno GC: inizialmente una temperatura costante di 40°C per 3 minuti, poi 150°C alla velocità di 5°C/min, un riscaldamento rapido (alla velocità di 15 °C/min) fino a 200°C, ed infine la T costante di 200°C è stata mantenuta per 2 minuti. Il rilevamento dello spettrometro di massa è stato eseguito sotto ionizzazione per impatto elettronico (EI) a 70 eV, operando nella modalità di acquisizione Full Scan nel range di 40-350 amu. La sorgente ionica e la temperatura della transfert line sono state mantenute entrambe a 250°C. L’acquisizione dei dati è stata effettuata nella modalità di corrente ionica totale (TIC). L’identificazione dei composti volatili è stata eseguita confrontando gli spettri di massa sperimentali con quelli disponibili nel database della libreria NIST MS (Mass Spectral Library, versione 2.2), impostando una soglia di R match (Ricerca di indici inversa) di almeno 800 per ciascun composto rilevato nei campioni. Tuttavia, l’identificazione effettuata in questo modo può non essere univoca, dato che si può ottenere un’identificazione incerta nel caso di composti caratterizzati da uno spettro di frammentazione simile (ad esempio nel caso degli isomeri); ad ogni modo, in conformità con i criteri definiti dalla Metabolomics Standards Initiative [52], i risultati qualitativi basati sulla somiglianza spettrale con il database NIST MS, senza l’uso di standard chimici di riferimento, possono essere considerati come identificazione “putativa” dei composti. Inoltre, come prova spettrale per confermare i composti identificati, sono stati determinati gli indici di ritenzione di Kovats (KI) utilizzando una serie omologa di idrocarburi alifatici (C8-C20) (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) come riferimenti esterni, e molti di essi sono risultati identificabili con quelli disponibili in letteratura [S11, 53]. Il calcolo degli indici di Kovats rappresenta uno strumento utile ai fini dell’identificazione, essendo

50 indipendente dalle condizioni operative, eccetto per la polarità della fase stazionaria usata. Inoltre, quando devono essere analizzate matrici complesse contenenti centinaia di sostanze volatili, come in questo caso, questo approccio evita l’iniezione degli standard puri che può rappresentare un fattore limitante, sia per il costo e il dispendio del tempo dell’analisi, sia perché diversi composti potrebbero non essere disponibili in commercio.

3.1.3 Analisi statistica e software

Una volta acquisiti i profili cromatografici di tutti i campioni, grazie alla libreria MS NIST, è stato possibile identificare un elevato numero di composti aromatici. Successivamente, per individuare eventuali relazioni esistenti tra i composti identificati ed i trattamenti adottati in fase di produzione, ai dati grezzi, costituiti dalle aree dei picchi cromatografici, sono state applicate tecniche di analisi statistica multivariata elaborate mediante software UnscramblerX (CAMO) ed il software R (R Development Core Team, https://www.r-project.org/) per quanto riguarda la parte di PCA e LDA, mentre la parte di PLS-DA è stata eseguita utilizzando il software Matlab (The Mathworks, Natick, MA), ad eccezione dell’allineamento cromatografico dei dati, eseguito usando la toolbox iCoshift v3.0 (liberamente scaricabile da http://www.models.life.ku.dk/icoshift; ultimo accesso 8 marzo 2019).