CORRELAZIONE TRA IL TEST TRAP-ELISA E L’IMMUNOISTOCHIMICA PER TERT NELLA DETERMINAZIONE DELLA TELOMERASI NEI TESSUTI MAMMARI DI GATTA

Panarese Serena, Fusaro Laura, Brunetti Barbara, Benazzi Cinzia, Sarli Giuseppe Sezione di Patologia Generale e Anatomia Patologica - Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e

Patologia Animale - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Bologna

L’enzima telomerasi è stato ampiamente studiato negli ultimi anni vista la sua presenza nei tessuti tumorali, ragione per la quale viene considerato un promettente marcatore prognostico.

Per la ricerca in esame sono stati impiegati 16 campioni di tessuto mammario di gatta (1 mammella normale, 1 lesioni displasiche, 1 caso di neoplasia benigna e 13 neoplasie maligne) ed un testicolo come controllo positivo, trattati con metodica immunoistochimica (IHC) con l’anticorpo anti-TERT e con la metodica TRAP-ELISA, con la finalità di valorizzare l’IHC come test alternativo al TRAP oggi ancora considerato il gold standard per lo studio dell’enzima.

L’espressione immunoistochimica di TERT è risultata di 3 tipi: nucleolare (più frequente), nucleare diffusa, citoplasmatica (più rara). La positività è stata quantificata con analisi di immagine, separatamente per l’espressione solo nucleolare, solo nucleare, solo citoplasmatica, nucleare e nucleolare contemporaneamente ed, in tutti i casi, espressa come numero medio di cellule positive o come numero corretto per la cellularità (valore percentuale). Dai dati emerge complessivamente che la variabile con maggiore potere discriminante sia nei valori medie che percentuali tra lesioni benigne vs maligne o positivi vs negativi al test TRAP-ELISA è quella che contempla la positività immunoistochimica contemporaneamente nel nucleo e nel nucleolo. La correlazione di Pearson tra il risultato TRAP positivo o negativo e tutte le variabili prese in considerazione ha messo in evidenza una correlazione significativa e direttamente proporzionale solo con la variabile espressione contemporanea nel nucleo e nel nucleolo con un coefficiente di correlazione pari a 0,53 per i dati espressi come media e 0,57 per i dati espressi come percentuale.

L’indagine eseguita ha permesso in primo luogo di stabilire la cross-reazione dell’anticorpo impiegato con tessuti del gatto, dato non presente in letteratura. L’impiego della metodica immunoistochimica per l’individuazione della subunità catalitica TERT della telomerasi permette di apprezzare diversi pattern di espressione ma solo uno, quello con espressione contemporanea nucleare e nucleolare, risulta correlato al risultato della metodica impiegata per la stima dell’attività telomerasica, cioè la TRAP. La correlazione tra le due metodiche è significativa ma con coefficienti di correlazione non elevati, verosimilmente in considerazione del fatto che le due metodiche sono tra loro più complementari che alternative.

Parole chiave: gatto, ghiandola mammaria, IHC, telomerasi, TRAP-ELISA, tumore INTRODUZIONE

La telomerasi è stata molto studiata negli ultimi anni vista la sua presenza nei tessuti tumorali, motivo per cui viene considerata un importante marcatore prognostico. E’ un enzima fondamentale nella replicazione del DNA, agisce in maniera particolare nel meccanismo di allungamento dei telomeri, le parti terminali dei cromosomi lineari, che altrimenti progressivamente si accorcerebbero provocando la morte cellulare. La telomerasi può così contribuire allo sviluppo neoplastico,

Boldrini et al., 2002; Cong et al., 2002; Argyle et Nasir, 2003).

L’enzima è presente sia nelle cellule normali che in quelle tumorali, localizzata nel nucleo, nei nucleoli e a livello citoplasmatico, in quantità più o meno notevole (Kawakami et al., 2000; Poremba et al., 2000; Hiyama et al., 2001; Wei et Younes, 2001; Martin et al., 2002; Panizo et al., 2002, Kyo et al., 2003; Yan et al., 2004; Brustmann, 2005, Luzar et al., 2005).

Ad oggi per la valutazione semi-quantitativa dell’enzima sono state utilizzate tecniche di

esprime (Matthews et Jones, 2001; Hiyama et Hiyama, 2003).

Con la colorazione immunoistochimica, invece, è possibile non solo localizzare la componente telomerasica a livello della singola cellula ma anche quantificarla (Poremba et al., 2000).

Scopo del lavoro è stato l’impiego della metodica immunoistochimica in una casistica di 16 casi di tessuto mammario di gatta con la finalità:

1. di valutare con metodica immunoistochimica l’espressione della subunità catalitica della telomerasi (TERT);

2. oggettivare mediante analisi di immagine

l’entità della positività immunoistochimica;

3. confrontare i risultati dell’indagine immunoistochimica con i risultati della TRAP.

Dal momento che la subunità catalitica dell’enzima è il fattore limitante l’attività enzimatica stessa, lo scopo finale della sperimentazione è valutare se i risultati ottenuti con le due metodiche siano sovrapponibili, e quindi si possa valorizzare l’immunoistochimica, metodica più semplice e meno costosa della TRAP, per la valutazione di questo importante marcatore tumorale. MATERIALI E METODI

Sono stati impiegati per l’indagine 16 campioni di tessuto mammario provenienti da mastectomie eseguite presso il Dipartimento clinico veterinario della facoltà di Medicina Veterinaria dell’Università di Bologna e presso cliniche veterinarie private.

I tessuti sono giunti presso il laboratorio entro 6 ore dall’intervento. Sono stati campionati, mediante l’estrazione dalla massa, pezzetti di tessuto di circa 0,5 cm³, successivamente divisi in due metà di cui una fissata in formalina per l’esame istologico e l’indagine immunoistochimica (IHC) e l’altra congelata in azoto liquido e poi stoccata a -80°C in attesa di essere processata con la metodica TRAP. I campioni fissati in formalina sono stati poi

colorazione con ematossilina-eosina (E-E) per la diagnosi istologicae per l’indagine IHC. La casistica comprendeva 1 mammella normale, 1 lesione displasica, 1 tumore benigno e 13 neoplasie maligne.

La diagnosi istologica è stata eseguita seguendo i criteri classificativi di Misdorp et al. (1999) e, limitatamente alle lesioni neoplastiche maligne, si è proceduto anche alla stadiazione secondo Gilbertson et al. (1983) adattata alla gatta da Mandelli et al. (1987) in: 1. stadio istologico 0, o tumore maligno non

infiltrante, quando la proliferazione neoplastica non appariva superare la membrana basale;

2. stadio istologico I, o tumore maligno infiltrante con invasione stromale, cioè superamento della membrana basale ed invasione dello stroma;

3. stadio istologico II, o tumore maligno infiltrante con emboli nei vasi linfatici o ematici e/o metastasi al linfonodo regionale (inguinale superficiale o ascellare ipsilaterale).

Immunoistochimica

Le sezioni sono state deparaffinate, reidratate e sottoposte a trattamento di inibizione delle perossidasi endogene con una soluzione alcolica (metanolo) allo 0,3% di acqua ossigenata (H2O2) per 30 minuti a temperatura

ambiente. Le sezioni sono state poi immerse in tampone citrato a pH 6.0 e trattate con forno a microonde a 750 W per due cicli di 5 minuti ciascuno e quindi lasciate raggiungere la temperatura ambiente per 20 minuti. In seguito sono state incubate per una notte a 4°C con l’anticorpo anti-telomerasi-subunità catalitica (clone 44F12) (Novocastra) ad una diluizione di 1:50 con PBS. Per la rivelazione della reazione IHC è stato impiegato un metodo streptoavidina-biotina-perossidasi utilizzando un kit commerciale (DAKO LSAB Kit peroxidase). Come cromogeno, infine, è stata utilizzata la diaminobenzidina alla concentrazione di 0,04% per 7 minuti e come colorazione di contrasto l’ematossilina di Papanicolau. Nella casistica è stato incluso anche un controllo sicuramente positivo rappresentato da una sezione di testicolo di