ESPRESSIONE NELLA GHIANDOLA MAMMARIA BOVINA E NEL LATTE DI UNA

ISOFORMA DELLA α1-GLICOPROTEINA ACIDA (AGP)

Miranda Ribera Alba, Pocacqua Vanessa, Avallone Giancarlo, Sartorelli Paola, Fortin Riccardo, Lecchi Cristina, Rebucci Raffaella, Scaccabarozzi Licia, Ceciliani Fabrizio Dipartimento di Patologia Animale, Igiene e Sanità Pubblica Veterinaria (DIPAV), Via Celoria 10,

20133 Milano

L'α1-glicoproteina acida è una proteina ad attività immunomodulatoria, espressa dagli epatociti come conseguenza della risposta sistemica della infiammazione. Poichè il nostro gruppo ha recentemente scoperto nel latte la presenza della boAGP, la nostra attenzione si è concentrata sull'epitelio ghiandolare mammario al fine di ottenere informazioni sull’espressione locale di boAGP come punto di partenza per studiare i suoi effetti locali durante le infiammazioni che colpiscono la ghiandola mammaria. Con questo progetto abbiamo indagato se l'isoforma della boAGP presente nel latte deriva dalle cellule della ghiandola mammaria, oppure se si tratta della isoforma epatica presente nel plasma che viene trasferita dal sangue al latte. Questo lavoro si è articolato in varie fasi.

a) caratterizzazione strutturale della isoforma da latte eseguita mediante sequenziamento del cDNA ottenuto da cellule della ghiandola mammaria.

b) studi di espressione sia del gene (RT-PCR) che della proteina matura (immunoistochimica).

La struttura primaria della isoforma epatica e di quella mammaria sono identiche contrariamente al pattern elettroforetico che appare differente. Si può quindi ipotizzare che sia presente un solo gene che codifica per la proteina e che le differenze osservate siano dovute a modificazioni post-traduzionali.

Mediante l’immunoistochimica, nei tessuti l’espressione dell’AGP è stata evidenziata esclusivamente a carico del citoplasma delle cellule epiteliali. L’epitelio della cisterna e del capezzolo erano caratterizzati da positività diffusa ed intensa rispetto a tutte le altre aree mammarie. Gli alveoli in fase di secrezione mostravano positività meno intensa e prevalentemente apicale, mentre i gruppi di alveoli con ridotta attività secretiva o a riposo esibivano positività intensa e diffusa.

In tutte le aree della ghiandola mammaria è stata evidenziata l’espressione del gene dell’AGP mediante RT-PCR.

Parole chiave: α1-glicoproteina acida (AGP), ghiandola mammaria, latte

INTRODUZIONE

L' α 1-glicoproteina acida è una proteina di fase acuta appartenente alla famiglia delle immunoocaline, un gruppo di protine che associano ad una attività di tipo immunomodulatorio anche una funzione di trasporto di piccole molecole idrofobiche (Hochepied et al, 2004). Il peso molecolare della AGP è di 44 kDA, più del 40% dei quali costituito da gruppi oligosaccaridici (Ceciliani et al, 2006). Come tutte le proteine di fase acuta, anche la AGP viene espressa dagli epatociti come conseguenza della risposta sistemica della infiammazione. Poichè il nostro gruppo ha recentemente scoperto nel latte la

di partenza per studiare i suoi effetti locali durante le infiammazioni che colpiscono la ghiandola mammaria.

Il progetto si propone almeno due obiettivi. Da una parte interessa ottenere informazioni più dettagliate sulla presenzadi boAGP a livello di ghiandola mammaria. Queste informazioni sono utili per studiare gli effetti locali della proteina durante le mastiti. Un obiettivo ulteriore è indagare se l’isoforma della boAGP presente nel latte deriva dalle cellule della ghiandola mammaria oppure se si tratta della isoforma epatica presente nel plasma che viene trasferita dal sangue al latte

Parallelamente è stata determinata la sruttura primaria della isofora mammaria mediante sequenziamento del cDNA. Infine si è esguitauna caratterizzazione delle modificazioni post-traduzionali mediante tecniche di proteomica.

MATERIALI E METODI

La boAGP da plasma e da latte è stata purificata secondo il protocollo precedentemente messo a punto nel nostro laboratorio (Ceciliani et al, 2005). La caratterizzaione strutturale è stata eseguita mediante SDS-PAGE ed elettroforesi bi- dimensionali, utilizzando un gradiente lineare di pH di 3-6. L’elettrotrasferimento è stato eseguito tlizzando tecnche convenzionali di Western Blotting. La immunocolorazione è stata eseguita utilizzando un anticorpo policlonale (poly anti-boAGP).

Lo stesso anticorpo è stato utilizzato per gli studi di espressione della proteina matura mediante tecniche di immunoistochimica, eseguite su sezioni criostatiche, utilizzando come cromogeno AEC e controcoloanto con emallume, a livello di diverse sezioni di ghiandola mammaria. In particolare sno state campionate sezioi provenienti dall’epitelio secernente della ghiandolamucosa, dalla mucosa della cisterna del latte e del capezzolo. Parallelamente sono stati eseguiti studi di esapressione del gene della boAGP mediante RT-PCR. Le tecniche di clonaggio e seguenziamento utilizzate per la determinazione della sequenza del gene estratto dalla ghiandola mammaria sono già state precedentemente descritte (Ceciliani et al., 2005).

RISULTATI

La figura 1 illustra come sia presesente mRNA codificante per boAGP a livello di epitelio secernente della ghiandola mammaria.

La figura 2 illustra i risultati della caratterizzazione strutturale, che si è concentrata principalmente sullo studio mediante immunocolorazione delle due

mammaria (lane A) è più alto di circa 2 kDa rispetto alla isoforma plasmatica (lane B). Sono apprezzabili alcune glicoforme con un peso molecolare di circa 60 kDa assenti nella isoforma plasmatica. L’isoforma plasmatica assume la tendenza a dimerizzare, come si può apprezzare dalla banda identificata Queste differenze si possono evidenziare anche nell’elettroforesi bidimensionale. Si possono inoltre identificare nella isoforma mammaria alcune proteine a basso peso molecolare che probabilmente sono dovute a fenomeni di deglicosilazione o a parziale glicosilazione. Nella isoforma plasmatica si evidenziano invece glicoforme ad alto punto isoelettrico, che possono essere dovute a isoforme parzialmente desialilate. Parallelamente agli studi di caratterizzazione strutturale, è stato eseguito anche un sequenziamento del cDNA codificante per la proteina estratto dalla ghiandola mammaria. Allo stato attuale sono dispobili unicamente risultati parziali, che comunque suggeriscono che la sequenza della isoforma da latte è identica a quella epatica presente nel plasma.

La localizzazione del gene e della proteina sono state seguite mediante tecniche di RT- PCR ed immunoistochimica. Per quello che riguarda la localizzazione della proteina, i risultati degli esperimenti sono stati presentati nella figura 3. In particolare nei tessuti l’espressione della boAGP è stata evidenziata esclusivamente a carico del citoplasma delle cellule epiteliali con intensità differente nei vari distretti anatomici, come indicato nella figura 3. In particolare,

Gli alveoli con ridotta attività secretiva esibiscono una positività intensa e diffusa (figura 3 A): al contrario, gli alveoli in fase di secrezione dimostrano un poositività meno diffusa, e prevalentemente apicale (figura 3 B). Un positività intensa e diffusa si può apprezzare anche lungo l’epitelio della cisterna del latte (figura 3 C indicata dalle frecce) e della mucosa del capezzolo (figura 3 D). Nella figura 4 sono invece presentati i risulati degli studi di espressione mediante RT-PCR. Benché non sia stata eseguta una valtazione di tipo quantitativo, è possibile evidenziare come alla espressione della proteina corrisponda anche la

della ghiandola mamaria, e che viene espressa insieme alle altre proteine nel latte.

DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

L’obiettivo che volevamo aggiungere con questo lavoro consisteva nella valutazione della spressione della boAGP nel atte: in mdo articolare ci interessava studiare la origine della proteina. Un nostro lavoro precedente aveva dimostrato che la proteina veniva effettivamente espresa dall’epitelio della ghiandola mammaria eon dalle cellule somatiche (Ceciliani et al, 2005). Con questi dati abbiamo confermato il risultato precedente, che è stato inoltre completato dai dati di immunolocalizazione. Abbiamo inoltre dimostrato che le due proteine subiscono un

processamento post-traduzionale completamente differente, a conferma della

ipotesi che la boAGP viene probabilmente espressa da un unico gene, ma viene però processata in modo dfferente in relazione al tipo cellulare che la esprime. La maggior parte delle proteine di fase acuta sono state inizialmente identificate come proteine di produzione epatica, ma esiste una crescene evidenza che molte di queste proteine vengono espresse anche a livello locale. L’attività e la regolazione della espressione a livello locale possono essere anche molto differenti: per esempio l’albumina espressa dalla ghiandola mammaria è una proteina di fase acuta positva, al contrario di quella espressa dal fegato che

risulta invece essere una proteina di fase acuta negativa.

Il significato biologico dei nostri dati risulta al momento ancora oscuro. E’ sicuramente necessario un approfondimento più dettagliato per quello che riguarda la localizzazione, nonché per quello che riguarda le vie di controlo della espressione: dal momento che una delle attività principali della AGP è quella immunomodulatoria, risulterebbe interessante valutare per esempio se la espressione della proteina è correlata a particolari stadi di lattazione. Un altro aspetto interessante da valutare è rappresentato dalla differente attività delle isoforme. E’ infatti evidente come nel latte possano esistere conemporaneamente almeno due isoforme, quella mammaria, espressa dall’epitelio della giandola, e quella plasmatica, che viene espressa dal fegato ma che può essere presente nel latte a seguitodella formazione di essudato infiammatorio in corso di mastite. Saranno queste le tematiche che probabilmente verranno indagate nella fase successiva del lavoro.

BIBLIOGRAFIA

1. Ceciliani et al. (2005) Vet Res. Sep-Dec;36(5- 6):735-746.

2. Ceciliani et al. (2006) Curr Prot Pep Science, in press

3. Hochepied T., (2004) Cyt Growth Factors Review, 14, 23-34.

Figura 2. Caratterizzazione strutturale della isoforma plasmatici e della isoforma mammaria della AGP.

Nella lane A è stata caricata una aliquota di AGP purificata da latte. Nella lane B è stata caricata una aliquota di AGP purificata da sangue.

Figura 3. Localizzazione istochimica della AGP nella ghiandola mammaria bovina: A) Alveoli con ridotta attività secretiva (400X); B) Alveoli in secrezione (400X); C) Epitelio della cisterna (100X) positività indicata dalle frecce; D) Mucosa del capezzolo (200X).

Figura 4 Studi di espressione mediante RT (reverse transcription) PCR. Sono state eseguite retrotrascrizioni a partire da due quarti di ghiandola mammaria (tessuto secernente). Ogni campione è stato riprodotto in duplicato con due concentrazione (tal quale ed 1:10), epitelio della cisterna e mucosa del capezzolo.

EXPRESSION IN BOVINE MAMMARY GLAND AND SECRETION OF A MILK