Descrizione delle proprietà spettroscopiche dei pigment

In questa sezione saranno descritte le proprietà spettroscopiche delle due tipologie di pigmenti presenti nella Peridinin – chlorophyll-a protein. Sia per la peridinina che per la clorofilla a, le caratteristiche dei relativi spettri di assorbimento ed emissione saranno discusse alla luce della natura degli stati elettronici interessati. I dati calcolati saranno presentati e commentati anche con riferimento alle principali evidenze sperimentali.

5.1.2.1 Peridinina

La peridinina (vedi Fig. 5.2) appartiene a una famiglia di carotenoidi altamente sostituiti, le cui proprietà spettroscopiche sono sensibilmente influenzate dalla presenza di un gruppo carbonilico.

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In letteratura si riscontra la tendenza a classificare gli stati eccitati dei carotenoidi sulla base delle caratteristiche di simmetria della loro catena coniugata, ovvero in prima approssimazione si assume che essi presentino la simmetria caratteristica dei polieni puri. Secondo tale classificazione, gli stati elettronici S , S e S di un carotenoide possiedono rispettivamente simmetria 1A , 2A e 1B . Ciò risulta in una transizione S → S proibita per simmetria; la transizione S → S è invece permessa ed è responsabile dell’intensa banda di assorbimento dei carotenoidi situata nella regione spettrale attorno ai 400-550 nm. Dato il carattere proibito della transizione S → S , tali molecole presentano generalmente una fluorescenza dallo stato S estremamente debole. Fanno tuttavia eccezione i carotenoidi con un gruppo carbonilico nella catena coniugata, i quali sono caratterizzati da intensità di fluorescenza più alte rispetto ai loro analoghi senza il suddetto gruppo: ciò è verosimilmente causato da maggiori deviazioni dalla simmetria ideale .

In particolare, la peridinina presenta un’emissione dallo stato S insolitamente intensa per un carotenoide, con una resa quantica di fluorescenza di ~ 10-3 nei solventi non polari e ~ 10-5 nei solventi polari. Studi spettroscopici risolti nel tempo hanno evidenziato che la variazione polarità- dipendente della resa quantica di fluorescenza dello stato S si accompagna a una significativa alterazione del tempo di vita dello stato S stesso, pari a ~ 160 ps nei solventi non polari, ma più corto di ~ 10 ps nei solventi più polari. Tale riduzione del tempo di vita è stata spiegata postulando l’esistenza di un ulteriore stato eccitato, chiamato S , con caratteristiche di tipo charge-transfer (risultante, più precisamente, da un trasferimento di carica elettronica dalla catena coniugata all’anello lattonico). Nei solventi non polari, tale stato S si troverebbe a energia più alta dello stato S : pertanto, successivamente alla transizione S → S e alla conversione interna dallo stato S allo stato S , si osserverebbe direttamente il rilassamento S → S . Viceversa, nei solventi polari, l’energia dello stato S sarebbe inferiore a quella dello stato S : quest’ultimo sarebbe dunque rapidamente depopolato in conseguenza della transizione S → S , a cui seguirebbe infine il decadimento dello stato S [54, 55].

Ad ogni modo, al di là delle speculazioni avanzate, è significativo ricordare che per la peridinina (così come per altri carotenoidi caratterizzati dalla presenza del gruppo carbonilico) si osservano sensibili differenze negli spettri di assorbimento (sia stazionari che risolti nel tempo) e in quelli di emissione, a seconda che essi siano registrati in solventi polari o non polari (vedi Fig. 5.3 e 5.4).

Fig. 5.3

Spettro di assorbimento della peridinina in

n-esano (linea continua) e metanolo (linea

tratteggiata). Tratto dal Rif. 55.

Fig. 5.4

Spettro di fluorescenza della peridinina in n-esano (linea continua; = 455nm) e metanolo (linea tratteggiata; = 473nm). Tratto dal Rif. 55.

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Come si vede in Fig. 5.3, nei solventi polari la struttura vibrazionale sparisce: al suo posto compare una banda di assorbimento non strutturata e allargata in modo asimmetrico in corrispondenza delle basse energie. Analogamente, in Fig. 5.4 si osserva che lo spettro di fluorescenza misurato nei solventi non polari esibisce una certa struttura vibronica, mentre quello registrato nei solventi polari è allargato e non strutturato. Un dato rilevante che emerge dalla comparazione degli spettri di Fig. 5.3 e 5.4 è il marcato red shift tra lo spettro di emissione e quello di assorbimento: tale circostanza è stata attribuita alla differente natura delle transizioni elettroniche interessate, che sarebbero rispettivamente la S → S in assorbimento e la S → S in emissione [50].

Nel presente studio sono stati eseguiti calcoli delle proprietà di transizione elettronica della molecola di peridinina in vuoto e in ambiente proteico. A questo scopo sono stati testati il metodo TDDFT con funzionale cam-b3lyp e base 6-31+G(d), il metodo CIS con base 6-31+G(d) e il metodo semiempirico ZINDO. I calcoli sono stati realizzati sulle strutture cristallografiche di due distinte molecole di peridinina (per la precisione, quelle indicate nel file pdb della PCP con la notazione 611 e 613; vedi Fig. 5.1), così da permettere il confronto tra le due; i risultati ottenuti nei due casi sono molto simili, per cui nel seguito saranno presentati solo quelli relativi alla Peridinina 611. L’ambiente proteico è stato trattato come un dielettrico continuo polarizzabile impiegando il modello PCM illustrato in sezione 1.1; più nel dettaglio, per le sue costanti dielettriche statica e ottica sono stati selezionati, rispettivamente, i valori = 15 e = 2. Questi ultimi sono stati ottenuti da misure di dispersione elettrica eseguite su polveri di lisozima idratate [60] e sono ritenuti idonei a descrivere le dinamiche di solvatazione anche di altri contesti proteici. D’ora in avanti essi saranno pertanto impiegati in tutti i calcoli in cui si renderà necessario modellare un generico ambiente proteico, quale per esempio quello della PCP.

Nella Tabella 5.1 sono riportati i risultati dei calcoli eseguiti sulla Peridinina 611 con livello di teoria cam-b3lyp. Tale metodo è stato infatti ritenuto il più idoneo per la determinazione dei coupling elettronici peridinina-clorofilla a, in quanto esso coniuga una ragionevole accuratezza con un costo computazionale accessibile. Ad ogni modo, anche gli altri metodi qui testati riproducono, pur con qualche differenza nei valori assoluti, l’ordine e le intensità di assorbimento relative dei primi tre stati eccitati della peridinina calcolati a livello cam-b3lyp (dati non mostrati).

Stato a Eb fc d Composizione 1 472 2.63 3.14 48.85 H → L (0.69) Vuoto 2 337 3.68 0.00 0.04 H-1 → L (0.66) 3 305 4.07 0.46 4.60 H → L+1 (0.68) 1 510 2.43 3.09 51.86 H → L (0.68) Proteina 2 351 3.53 0.02 0.28 H-1 → L (0.66) 3 308 4.02 0.51 5.22 H → L+1 (0.65) Tabella 5.1

Proprietà dei primi tre stati eccitati della Peridinina 611 calcolate con metodo cam-b3lyp e base 6-31+G(d).

a

Lunghezze d’onda di eccitazione in nanometri. b Energie di eccitazione in eV. c Forze dell’oscillatore. d Dipoli elettrici di transizione in unità atomiche. Nell’ultima colonna sono indicate le coppie di orbitali (H=HOMO, L=LUMO) tra cui avvengono le eccitazioni che più contribuiscono a definire la natura di ciascuno stato eccitato (tra parantesi si riporta il peso di ciascuna coppia nella composizione complessiva dello stato eccitato considerato).

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L’analisi dei dati di Tabella 5.1 evidenzia che non vi è accordo tra l’ordine e la natura dei primi tre stati eccitati calcolati per la peridinina e quanto teorizzato in letteratura sulla base di evidenze sperimentali e di congetture relative all’attribuzione ai carotenoidi delle proprietà di simmetria caratteristiche del gruppo . Più nel dettaglio, il primo stato eccitato calcolato è caratterizzato da forza dell’oscillatore elevata e da un’energia di eccitazione abbastanza vicina al massimo di assorbimento sperimentale (vedi, per confronto, Fig. 5.3); tale stato corrisponde a una transizione di tipo prevalentemente HOMO → LUMO e, come si vede dalle illustrazioni degli orbitali molecolari riportate in Fig. 5.5, presenta parziale carattere charge-transfer (con spostamento, in seguito all’eccitazione, di parte della densità di carica elettronica dalla catena coniugata all’anello lattonico). Il secondo stato eccitato, corrispondente a una transizione di natura principalmente HOMO-1 → LUMO, è caratterizzato da forza dell’oscillatore del tutto trascurabile e presenta anch’esso parziale carattere charge-transfer, di entità ancora più marcata rispetto al primo stato. Infine, il terzo stato eccitato, che corrisponde a una transizione di tipo prevalentemente HOMO → LUMO+1, è connotato da forza dell’oscillatore di media entità ed evidenzia parziale carattere charge-transfer di natura però inversa (ovvero con migrazione di densità di carica elettronica dall’anello lattonico alla catena coniugata). I risultati calcolati in ambiente proteico non differiscono sostanzialmente da quelli ottenuti in vuoto.

HOMO LUMO

HOMO-1 LUMO+1

Fig. 5.5

Orbitali molecolari HOMO, LUMO, HOMO-1, LUMO+1 della Peridinina 611 (struttura cristallografica non ottimizzata) calcolati con metodo cam-b3lyp e base 6-31+G(d). Immagine riprodotta con il programma

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Inoltre, le geometrie dello stato fondamentale e del primo stato eccitato della Peridinina 611 sono state ottimizzate in vuoto a livello di calcolo cam-b3lyp (con ambedue le basi 6-31G e 6-31G(d)). Su tali geometrie ottimizzate sono stati eseguiti calcoli rispettivamente di assorbimento e di emissione (con metodo cam-b3lyp e base 6-31+G(d)). Calcoli analoghi sono stati ripetuti in solventi di polarità crescente, così da poter correlare l’andamento dello Stokes shift (definito come la differenza tra l’energia di emissione e quella di assorbimento in un dato solvente) alle caratteristiche di polarità del mezzo (vedi Tabella 5.2). Da tale analisi emerge che lo Stokes shift è tanto maggiore quanto più il solvente è polare, in accordo con i dati sperimentali [54]. Poiché in tutti i calcoli fin qui discussi è sempre stato considerato esclusivamente il primo stato eccitato, i risultati ottenuti sembrerebbero suggerire che non è in realtà necessario, come è stato invece fatto in letteratura, invocare la presenza di due distinti stati eccitati S e S (né tantomeno di un ulteriore stato di tipo charge-transfer) per spiegare i significativi Stokes shift sperimentalmente osservati (vedi Fig. 5.3 e 5.4). Ciò appare ancora più sensato se ci considera che le proprietà di simmetria di un carotenoide altamente sostituito quale la peridinina difficilmente sono assimilabili a quelle del gruppo puntuale , per cui non vi è motivo alcuno di ritenere che i suoi stati elettronici debbano rispondere a una classificazione propria di tale gruppo. Ciononostante, è comunque doveroso menzionare studi teorici pregressi [57] in cui sono stati compiuti sforzi in tal senso.

5.1.2.2 Clorofilla a

In Fig. 5.6 sono sovrapposti gli spettri di assorbimento e di fluorescenza della clorofilla a. Le lunghezze d’onda corrispondenti ai massimi delle bande spettrali sono orientative, in quanto esse dipendono dal particolare ambiente in cui lo spettro è registrato. Ad ogni modo, si vede chiaramente che: (i) nello spettro di assorbimento sono individuabili due bande intense, centrate rispettivamente attorno a 430 nm (Soret) e a 662 nm (Qy), e una banda poco intensa, centrata

attorno a 620 nm (Qx); (ii) lo Stokes shift tra la banda Qy e lo spettro di fluorescenza è modesto.

E E SS Vuoto 2.84 2.27 -0.57 Cicloesano 2.81 2.20 -0.60 THF 2.77 2.06 -0.72 Acetonitrile 2.76 2.01 -0.76 Tabella 5.2

Proprietà spettroscopiche della Peridinina 611 calcolate a livello camb3lyp/6-31+G(d) sulle strutture di stato fondamentale e di stato eccitato ottimizzate in vuoto e nei vari solventi a livello camb3lyp/6-31G(d). a

Energia di assorbimento in eV. b Energia di emissione in eV. c Stokes shift in eV.

Fig. 5.6

Spettri di assorbimento (linea tratteggiata) e di fluorescenza (linea continua) della clorofilla a. Le intensità e le lunghezze d’onda corrispondenti ai massimi delle bande spettrali sono orientativi.

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La notazione dei differenti picchi di assorbimento presenti nello spettro elettronico della clorofilla è generalmente basata sul modello a quattro orbitali utilizzato per i derivati porfirinici [61]. A causa della simmetria della porfirina, l’orbitale non occupato di più bassa energia (LUMO) è doppiamente degenere. I due orbitali occupati di più alta energia (HOMO e HOMO-1) presentano inoltre una quasi-degenerazione accidentale. Le configurazioni generate dall’eccitazione di un elettrone rispettivamente dall’HOMO o dall’HOMO-1 al LUMO sono pertanto quasi degeneri e interagiscono fortemente. Tale interazione di configurazione dà origine a due stati e pertanto a due bande di eccitazione, le cosiddette bande Q e B (vedi Fig. 5.7). Nei derivati porfirinici a bassa simmetria, quali per esempio le clorofille, la degenerazione del LUMO scompare: pertanto, la banda Q si splitta in due distinte bande, caratterizzate da dipoli di transizione giacenti nel piano del macrociclo (Qx e Qy). Le eccitazioni nelle molecole di clorofilla non sono generalmente pure

transizioni tra singoli orbitali, tuttavia tale notazione è impiegata nei casi in cui il contributo principale all’eccitazione può essere assegnato alla corrispondente transizione orbitalica prevista per un’eccitazione Qx o Qy idealizzata.

Nell’ambito del presente studio sono stati eseguiti calcoli delle proprietà di transizione elettronica della clorofilla a nella sua struttura cristallografica estratta dal file pdb della PCP. I calcoli sono stati eseguiti con i livelli di teoria camb3lyp/6-31+G(d) e ZINDO, sia in vuoto che in ambiente proteico (quest’ultimo rappresentato, al solito, secondo il modello PCM e tramite l’uso delle costanti dielettriche = 15 e = 2). Nella Tabella 5.3 sono riportati i risultati ottenuti con il più accurato tra i due metodi. Essi sono in ragionevole accordo con i dati sperimentali, sia per quanto riguarda le energie che per quanto riguarda le intensità relative dei vari stati eccitati: più precisamente, i primi tre stati calcolati sono identificabili, nell’ordine, con le bande Qy, Qx e Soret.

Stato a Eb fc d 1 625 1.98 0.24 4.88 Vuoto 2 539 2.30 0.06 1.04 3 382 3.24 0.23 2.86 1 644 1.92 0.35 7.50 Proteina 2 555 2.24 0.12 2.15 3 396 3.13 0.66 8.64 Fig. 5.7

Spettro di assorbimento della clorofilla a registrato in cloroformio. Sono evidenziate le bande B (Soret) e Q.

Tabella 5.3

Proprietà dei primi tre stati eccitati della clorofilla a (estratta dal file pdb della PCP) calcolate a livello di teoria cam-b3lyp/6- 31+G(d). a Lunghezze d’onda di eccitazione in nm. b Energie di eccitazione in eV. c Forze dell’oscillatore. d Dipoli elettrici di transizione in unità atomiche.

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5.1.2.3 Complesso proteico

Si riportano in Fig. 5.8 gli spettri di assorbimento e di fluorescenza della Peridinin – chlorophyll-a protein ricostruita a partire dai suoi pigmenti costitutivi [49]. Le peridinine sono responsabili della banda di assorbimento dominante localizzata nella regione spettrale blu-verde (350-550 nm), mentre la clorofilla a assorbe attorno a 668 nm (banda Qy), 620 nm (banda Qx) e 440 nm (banda di

Soret). La fluorescenza della proteina trae origine dalla transizione Qy della clorofilla a ed è

centrata a 673 nm.

Come risulta abbastanza evidente, le proprietà spettroscopiche di ciascun pigmento contenuto nella proteina sono influenzate dal suo particolare intorno chimico, il quale esercita effetti di tipo sia strutturale che elettronico. I primi possono essere introdotti nel calcolo utilizzando per i vari pigmenti le geometrie determinate tramite analisi cristallografica della proteina, piuttosto che quelle rilassate (come è già stato fatto per i calcoli presentati nelle sezioni 5.1.2.1 e 5.1.2.2). I secondi sono invece più complessi da introdurre e, in generale, se può tenere conto a vari livelli di accuratezza. Più nel dettaglio, gli effetti di tipo bulk esercitati dall’ambiente proteico sui vari pigmenti possono essere validamente descritti tramite l’uso di un modello continuo, quale quello PCM (vedi sezione 1.1) impiegato per calcolare i risultati delle Tabelle 5.1 e 5.3. Gli effetti risultanti da interazioni specifiche tra ciascun pigmento e il suo intorno possono essere invece introdotti includendo esplicitamente nel calcolo le porzioni di ambiente più significative (per esempio, singoli residui amminoacidici, molecole di acqua, altri pigmenti), in termini di una loro descrizione a livello di teoria classico o, eventualmente, quantistico. Ciò è stato fatto con riguardo a: (i) la molecola d’acqua che occupa il quinto sito di coordinazione dell’atomo di magnesio della clorofilla; (ii) il residuo amminoacidico, indicato nel file pdb come Aspargina 89, che si trova vicino alla catena coniugata della Peridinina 614; (iii) tutte le peridinine che, data una particolare coppia Peridinina x – clorofilla a, non ne fanno parte (vedi Fig. 5.9).

Fig. 5.8

Spettri di assorbimento (in nero) e di fluorescenza (in rosso) della Peridinin – chlorophyll-a protein ricostruita a partire dai suoi pigmenti costitutivi. La fluorescenza è stata eccitata a = 532 nm. Tratto dal Rif. 62.

Fig. 5.9

Componenti di un singolo dominio della Peridinin – chlorophyll-a protein: la Peridinina 614, la Clorofilla 601 e l’Aspargina 89 sono rappresentate in grossetto, mentre le altre peridinine sono illustrate con linee sottili. La molecola d’acqua che occupa il quinto sito di coordinazione dell’atomo di magnesio (in giallo) della clorofilla a non è mostrata. Immagine tratta dal Rif. 49.

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Per i tre casi sopra elencati, i calcoli delle proprietà di transizione elettronica sono stati ripetuti con le seguenti modalità: (i) una molecola di acqua è stata aggiunta “a mano” in posizione e con orientazione opportuna rispetto all’atomo di magnesio della clorofilla. I primi tre stati eccitati di quest’ultima sono quindi stati ricalcolati includendo anche tale molecola d’acqua, descritta a livello di teoria quantistico (in pratica con lo stesso metodo di calcolo già impiegato per la clorofilla) o classico (per la precisione con un approccio di tipo MMPol, in cui i vari atomi sono rappresentati in termini delle rispettive cariche e polarizzabilità, ottenute le prime da un analisi di popolazione di tipo ESP§ e ricavate le seconde dal Rif. 63; vedi sezione 3.2.1). (ii) L’effetto dell’Aspargina 89 sulle proprietà di assorbimento della Peridinina 614 è stato valutato secondo le modalità già indicate al punto precedente, con la differenza che però in questo caso la geometria e la posizione relativa del residuo amminoacidico considerato sono quelle determinate tramite analisi cristallografica. (iii) Data una certa coppia Peridinina x – clorofilla a, le proprietà di transizione elettronica di entrambi i componenti della coppia sono state ricalcolate includendo l’effetto di tutte le altre peridinine, descritte queste ultime con metodo MMPol.

In tutti e tre i casi esaminati, si osservano variazioni modeste delle energie, delle forze dell’oscillatore e dei dipoli di transizione relativi ai primi tre stati eccitati di ciascun pigmento studiato. In Tabella 5.4 sono riportati, a titolo d’esempio, i dati calcolati per il caso (ii). Merita comunque di essere evidenziato fin da ora che tali analisi sono servite anche e soprattutto per la determinazione degli effetti esercitati dall’ambiente proteico, trattato a livelli di complessità crescente, sui coupling elettronici calcolati (vedi sezione 5.1.3.2).