Determinazione dei coupling elettronici in vuoto e nella proteina

Studio di sistemi fotosintetic

5.1 Peridinin – chlorophyll-a protein (PCP)

5.1.3 Determinazione dei coupling elettronici in vuoto e nella proteina

Le dinamiche di Energy Transfer interne alla Peridinin – chlorophyll-a protein sono state oggetto di indagini approfondite, ma restano ancora piuttosto controverse [48-53, 58]. Negli studi sperimentali sono state impiegate in modo integrato diverse tecniche spettroscopiche, sia di stato stazionario che risolte nel tempo (in particolare, assorbimento e fluorescenza, quest’ultima sia di emissione che di eccitazione). Negli studi teorici l’attenzione è stata invece principalmente

§_{Nello schema ESP (Electrostatic Potential) si proietta su una griglia il potenziale elettrostatico prodotto}

dalla densità di carica elettronica della molecola e si determinano quindi i valori delle cariche puntiformi centrate sui singoli atomi per i quali tale potenziale è meglio riprodotto.

1° stato eccitato 2° stato eccitato 3° stato eccitato

Ea fb c Ea fb c Ea fb c Vuoto 2.61 3.22 7.10 3.75 0.00 0.21 4.06 0.43 2.07 +Asn89 (MMPol) 2.57 3.17 7.09 3.74 0.01 0.34 4.02 0.44 2.12 +Asn89 (QM) 2.57 3.09 7.01 3.74 0.01 0.33 4.02 0.42 2.08 Tabella 5.4

Proprietà dei primi tre stati eccitati della Peridinina 614 calcolate in vuoto con metodo cam-b3lyp e base 6-31+G(d), rispettivamente in presenza e in assenza dell’Aspargina 89 (trattata a livello quantistico (QM) o classico (MMPol)).

focalizzata sul calcolo delle proprietà di transizione dei vari pigmenti, nonché sulla determinazione, a partire da queste ultime, dei coupling elettronici.

In generale, è stata postulata per la peridinina la classificazione degli stati eccitati propria del gruppo puntuale , sebbene ciò costituisca, come già discusso in sezione 5.1.2.1, una discutibile approssimazione. Inoltre, nella quasi totalità delle indagini spettroscopiche si è ritenuto sensato elucidare le dinamiche di Energy Transfer peridinina-clorofilla a postulando per la peridinina l’esistenza di un ulteriore stato eccitato a carattere charge-transfer, la cui esistenza non è stata dimostrata in modo definitivo, ma che si ritiene comunque caratterizzato da energia comparabile o inferiore a quella dello stato S . In base a tale schema, l’Energy Transfer dalle peridinine alla clorofilla a può teoricamente procedere secondo i due percorsi principali illustrati in Fig. 5.10:

Tramite spettroscopia di eccitazione allo stato stazionario, è stata determinata un’efficienza complessiva dell’Energy Transfer dalle peridinine alla clorofilla a pari a ~ 90% [50]; l’entità relativa dei due possibili percorsi di Energy Transfer, ovvero S → Q e S → Q , è stata invece oggetto di ampio e controverso dibattito. Sulla base del confronto tra i tempi di vita dello stato S in solvente e nella PCP, nonchè di quanto emerso dal fitting di dati ottenuti dalla spettroscopia di assorbimento transiente [52], è stato decretato in modo pressochè univoco che il percorso privilegiato dovrebbe essere quello S → Q (o, postulando l’esistenza di un ulteriore stato charge-transfer, quello S / → Q ), sebbene il contributo del percorso S → Q non sia

comunque del tutto trascurabile. Per di più, indagini teoriche hanno evidenziato che i coupling coulombiani calcolati tra le varie peridinine e la clorofilla a forniscono, insieme agli integrali di sovrapposizione spettrale, ragionevoli costanti di Energy Transfer solo per il percorso S → Q [51], supportando in tal modo (pur nei limiti derivanti dalle approssimazioni adottate nel metodo di calcolo impiegato) le tesi basate sui dati sperimentali.

E’ inoltre rilevante ricordare che è stato dimostrato un efficiente Energy Transfer anche tra la coppia di molecole di clorofilla a appartenenti ai due distinti domini di un singolo monomero della Peridinin – chlorophyll-a protein. Più nel dettaglio, misure di anisotropia di fluorescenza hanno rivelato per tale processo nella PCP nativa una costante di Energy Transfer pari a 6.8 ps [64]. Tale costante è stata inoltre determinata anche per le proteine ricostituite artificialmente e varia a seconda delle particolari forme di (batterio)clorofille impiegate per sostituire una o entrambe le clorofille a [53]. Ad ogni modo, nel presente studio l’Energy Transfer tra le clorofille a non è stato oggetto di indagine, in quanto ci si è limitati a considerare i processi attivi all’interno del singolo dominio di una data subunità monomerica della PCP.

Fig. 5.10

Energie di eccitazione della peridinina e della clorofilla a. Gli stati elettronici della peridinina sono indicati con S (stato fondamentale), S (primo stato eccitato) e S (secondo stato eccitato). I corrispondenti stati della clorofilla sono indicati rispettivamente con S , Q e Q . Le linee solide denotano i livelli energetici determinati spettroscopicamente, mentre quella tratteggiata l’energia di eccitazione stimata dello stato S . Con la freccia verticale si rappresenta la conversione interna dallo stato S allo stato S , mentre con quelle oblique i due possibili percorsi secondo cui può teoricamente procedere l’ET. Immagine tratta dal Rif. 51.

In particolare, l’attenzione è stata focalizzata sulla determinazione dei coupling elettronici (e delle relative costanti di Energy Transfer) tra le varie peridinine (Per 611, Per 612, Per 613, Per 614) e la clorofilla a (Chl 601). Tali coupling sono stati calcolati, per mezzo del modello quantomeccanico presentato in sezione 3.2, in ambienti caratterizzati da un grado di complessità crescente, così da avvicinarsi in modo progressivo a una descrizione sufficientemente realistica dei processi attivi all’interno della matrice proteica reale.

Prima di passare ai dati calcolati, è bene soffermarsi su un punto fondamentale. L’impiego del metodo computazionale precedentemente indicato fornisce i valori dei coupling elettronici tra tutte le possibili coppie di stati eccitati della peridinina e della clorofilla a. Ciò costituisce senza dubbio un vantaggio e difatti nel seguito i coupling determinati per le diverse possibili coppie saranno presentati, così da permettere il confronto tra di essi.

Per prima cosa, per le quattro possibili coppie peridinina x -clorofilla a (ciascuna nella rispettiva struttura cristallografica), i coupling elettronici sono stati calcolati con livello di teoria b3lyp/6- 31+G(d), a partire dalle densità di transizione dei singoli cromofori determinate a livello cam- b3lyp/6-31+G(d). I calcoli sono stati eseguiti sia in vuoto che in ambiente proteico (descritto quest’ultimo in termini del modello PCM, con uso delle costanti dielettriche = 15 ed = 2, e con impiego della cavità propria del n.eptano), così da poter valutare gli effetti tipo “bulk” della matrice proteica sull’entità delle interazioni peridinina x – clorofilla a. Si vedano a questo proposito i grafici di Fig. 5.11-5.14, in cui sono messi a confronto i coupling coulombiano e totale calcolati nei due ambienti per le quattro possibili coppie derivanti dal considerare i primi due stati eccitati di ciascun cromoforo.

50 100 150 200 250 300 350 611 612 613 614 C o u p lin g (c m -1) Peridinina

Coupling elettronico

(1° stato eccitato Per - 1° stato eccitato Chl a)

Coulombiano (vuoto) Coulombiano (proteina) Totale (vuoto) Totale (proteina)

Fig. 5.11

Coupling elettronici, calcolati con livello di teoria b3lyp/6- 31+G(d) (coulombiano e totale), relativi all’interazione tra il primo stato eccitato della peridinina (identificabile con lo stato S ) e il primo stato eccitato della clorofilla a

Dai grafici delle Fig. 5.11-5.14 si ricava che: (i) l’interazione tra le coppie di cromofori è di natura prevalentemente coulombiana, come evidenziato dal fatto che in vuoto il coupling coulombiano e quello totale sono pressochè coincidenti (si ricordi a questo proposito l’eq. 3.19, in cui il termine

0 100 200 300 400 500 600 700 611 612 613 614 C o u p lin g (c m -1) Peridinina

Coupling elettronico

(2° stato eccitato Per - 1° stato eccitato Chl a)

Coulombiano (vuoto) Coulombiano (proteina) Totale (vuoto) Totale proteina

Fig. 5.12

Coupling elettronici, calcolati con livello di teoria b3lyp/6- 31+G(d) (coulombiano e totale), relativi all’interazione tra il secondo stato eccitato della peridinina (forse identificabile con lo stato S / ) e il primo

stato eccitato della clorofilla a (corrispondente alla banda Qy).

0 25 50 75 100 125 150 175 200 611 612 613 614 C o u p lin g (c m -1) Peridinina

Coupling elettronico

(1° stato eccitato Per - 2° stato eccitato Chl a)

Coulombiano (vuoto) Coulombiano (proteina) Totale (vuoto) Totale (proteina)

Fig. 5.13

(corrispondente alla banda Qx).

0 25 50 75 100 125 150 175 200 611 612 613 614 C o u p lin g (c m -1) Peridinina

Coupling elettronico

(2° stato eccitato Per - 2° stato eccitato Chl a)

Coulombiano (vuoto) Coulombiano (proteina) Totale (vuoto) Totale (proteina)

Fig. 5.14

stato eccitato della clorofilla a (corrispondente alla banda Qx).

, responsabile dell’effetto di screening del mezzo solvente, in vuoto è ovviamente nullo); (ii) il coupling coulombiano calcolato in ambiente proteico è sempre un po’ superiore rispetto a quello calcolato in vuoto: in ciò consiste il cosiddetto effetto del “campo di reazione” del mezzo dielettrico, qui costituito dalla proteina (vedi sezione 3.2); (iii) il coupling totale calcolato in ambiente proteico è lievemente ridotto (a parte alcuni casi di trascurabile enhancement) rispetto al coupling totale calcolato in vuoto. Ciò significa che l’effetto di tipo “bulk” della proteina si esplica sostanzialmente attraverso un moderato screening delle interazioni tra le coppie di cromofori; l’entità di tale screening è ovviamente correlata alle specifiche caratteristiche della cavità molecolare, le quali dipendono dalla distanza e dall’orientazione relativa di ciascuna coppia (vedi Fig. 5.15).

Si noti infine che i coupling totali calcolati corrispondono a costanti di Energy Transfer dell’ordine di 1 ÷ 10 ps (dati non mostrati). Tali valori sono stati ottenuti tramite uso della regola d’oro di

Fermi ( =

ℏ ), con integrali di sovrapposizione spettrale ricavati, per le diverse possibili

coppie di stati eccitati, dal Rif. 51.

Fig. 5.15

Cavità molecolari delle coppie peridinina x – clorofilla a (x = 611, 612, 613, 614) nelle rispettive strutture cristallografiche (estratte dal pdb 1PPR). Immagine riprodotta con il software Geomview.

Per 611 - Chl a

Per 612 - Chl a

Per 613 - Chl a

5.1.3.1 Confronto con i coupling elettronici calcolati in ambiente PCM/MMPol

I coupling elettronici calcolati per le quattro possibili coppie peridinina x – clorofilla a sono stati rideterminati includendo esplicitamente per ciascuna coppia l’effetto delle tre peridinine “spettratrici”. Queste ultime sono state introdotte con ricorso al metodo ibrido QM/PCM/MMPol (o, per i calcoli in vuoto, semplicemente QM/MMPol), presentato in sezione 3.2.1. In pratica, la coppia di cromofori direttamente partecipanti all’Energy Transfer è descritta a livello di teoria quantomeccanico (per la precisione, cam-b3lyp/6-31+G(d)), mentre le tre peridinine “spettatrici” sono trattate a livello di teoria classico, ovvero introdotte in termini delle rispettive cariche e polarizzabilità con un approccio di tipo MMPol (si veda a questo proposito anche la discussione di sezione 5.1.2.3). Infine, gli effetti tipo “bulk” del resto della proteina sono descritti per mezzo del modello continuo polarizzabile PCM, assumendo per le costanti dielettriche statica e ottica valori rispettivamente pari a = 15 ed = 2 (tali effetti non sono ovviamente introdotti nei calcoli eseguiti in vuoto). I risultati così ottenuti sono rappresentati, per l’interazione tra il primo stato eccitato delle peridinine e il primo stato eccitato della clorofilla a, nei grafici di Fig. 5.16 (coupling coulombiano) e Fig. 5.17 (coupling totale). La scelta di tali stati è dettata dalla considerazione che la coppia che probabilmente meglio rispecchia il processo sperimentale è proprio quella in cui il primo stato stato eccitato della peridinina (identificabile con lo stato S delle indagini spettroscopiche, ma qui direttamente coinvolto anche nei processi di emissione e di Energy Transfer) interagisce con il primo stato eccitato della clorofilla a (corrispondente alla banda Q ).

50 100 150 200 250 300 350 611 612 613 614 C o u p lin g co u lo m b ia n o ( cm -1) Peridinina

Coupling coulombiano

(1° stato eccitato Per - 1° stato eccitato Chl a)

VAC VAC/MMPol PCM PCM/MMPol 50 100 150 200 250 300 350 611 612 613 614 C o u p lin g to ta le ( cm -1) Peridinina

Coupling totale

(1° stato eccitato Per - 1° stato eccitato Chl a)

VAC VAC/MMPol PCM PCM/MMPol

Fig. 5.16

Coupling coulombiani, calcolati a livello di teoria b3lyp/6- 31+G(d), relativi all’interazione tra il primo stato eccitato della peridinina (identificabile con lo stato S ) e il primo stato eccitato della clorofilla a

(corrispondente alla banda Qy).

Legenda: VAC = calcolo in vuoto; PCM = calcolo in cui è introdotto l’effetto di tipo “bulk” del mezzo proteico; MMPol= calcolo in cui le peridinine “spettatrici” sono incluse a livello di teoria classico

Fig. 5.17

Coupling totali, calcolati con livello di teoria b3lyp/6-31+G(d), relativi all’interazione tra il primo stato eccitato della peridinina (identificabile con lo stato S ) e il primo stato eccitato della clorofilla a

(corrispondente alla banda Qy).

Con riferimento ai grafici di Fig. 5.16 e 5.17, è doverosa una precisazione in merito alla natura della cavità molecolare impiegata nei calcoli in cui gli effetti di “bulk” del mezzo proteico sono descritti in termini del modello PCM: infatti, mentre nel caso dei coupling indicati come “PCM” si utilizza la cavità caratteristica della specifica coppia di pigmenti partecipanti all’Energy Transfer (vedi Fig. 5.15), nel caso dei coupling indicati come “PCM/MMPol” si utilizza una cavità complessiva che racchiude tutti i pigmenti (4 Per + Chl a) e che è quindi la stessa per ogni coppia. Ad ogni modo, dal grafico di Fig. 5.16 si vede che per tutte le coppie il coupling coulombiano subisce un moderato enhancement passando dal vuoto ad ambienti in cui sono incluse porzioni di proteina progressivamente più rilevanti: più precisamente, si osserva che l’effetto medio della proteina (contributo PCM) è maggiore rispetto a quello dei pigmenti trattati discretamente (contributo MMPol), circostanza questa verosimilmente dovuta alle caratteristiche geometriche del sistema complessivo. Dal grafico di Fig. 5.17 si vede invece che i coupling totali calcolati nei diversi ambienti sono sempre lievemente ridotti rispetto a quelli calcolati in vuoto (per il caso qui esaminato di interazione tra il primo stato eccitato della peridinina e il primo stato eccitato della clorofilla a): più nel dettaglio, anche per lo screening dei coupling totali si verifica quanto già osservato per l’enhancement dei coupling coulombiani, ovvero che l’effetto medio della proteina è decisamente più importante rispetto a quello dei pigmenti trattati discretamente.

Gli effetti complessivi dell’ambiente sui coupling elettronici totali si possono opportunamente rappresentare per mezzo del fattore di screening s (definito in eq. 3.26). Si veda a tal riguardo il grafico di Fig. 5.18, nel quale l’andamento di tale fattore è illustrato in funzione della distanza di separazione centro-centro tra la peridinina x e la clorofilla a di ciascuna coppia, ed è inoltre visualizzato il confronto con il fattore di screening costante ( = (1⁄ ) ≈ 0.5) impiegato nella teoria di Förster (vedi sezione 3.3).

Si ricordi che il fattore di screening assume valori tanto più bassi quanto maggiore è l’effetto di schermo es ercitato dall’ambiente sull’interazione tra i pigmenti di ciascuna coppia. Dal grafico di Fig. 5.18 si vede che l’effetto medio della proteina (contributo PCM) è maggiore rispetto a quello dei pigmenti trattati discretamente (contributo MMPol), come peraltro già rilevato. Si osserva inoltre che lo screening determinato dalla cavità complessiva contenente tutti i pigmenti (PCM complesso) è un po’ inferiore rispetto a quello prodotto dalle cavità caratteristiche delle singole coppie di pigmenti partecipanti all’Energy Transfer (cavità PCM): ciò risulta ragionevole, in quanto l’effetto di esclusione del mezzo dielettrico dalla regione intercromoforica, che fa sì che lo

Fig. 5.18

Nel documento Studio computazionale dei fenomeni di Electronic Energy Transfer in ambiente complesso (pagine 71-77)