ESPRESSIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO

3.5.1 Maxi preparazione di DNA plasmidico in assenza di endotossine

E’ stato utilizzato il “Plasmid Maxi kit LPS (‘Lipopolysaccharide’) - free” (Qiagen), secondo il protocollo della casa produttrice, impiegando materiali appositamente trattati per la rimozione delle endotossine batteriche in quanto la contaminazione del DNA plasmidico con

3.5.2 Trasfezione di cellule di mammifero

I plasmidi ricombinanti pcDNA3.1 sono stati utilizzati per la trasfezione transiente della linea cellulare di mammifero HEK 293. La trasfezione è stata eseguita mediante agenti lipidici non liposomali (“Effectene Transfection Reagent”, Qiagen).

Il metodo impiegato prevede la condensazione del DNA plasmidico, diluito in un apposito tampone, in presenza di un “enhancer”; l’Effectene, aggiunto successivamente. Questo circonda il materiale genetico condensato, generando strutture micellari, atte fondersi con la membrana plasmatica cellulare (Fig.

39).

La trasfezione è stata effettuata su cellule alla confluenza del 40 ÷ 50% in piastre da 6 pozzetti, impiegando 500 ng di DNA per pozzetto.

Fig. 39: Principio d’azione dell’agente lipidico Effectene e metodica di trasfezione

Ciascun plasmide ricombinante, diluito in tampone di condensazione sino al volume di 100 µl, è stato incubato a temperatura ambiente per 5’, in presenza di “enhancer” (3.2 µl/pozzetto), per consentire un’ulteriore condensazione dell’acido nucleico, necessaria per il successivo

inglobamento nelle vescicole lipidiche formate dall’Effectene. Quest’ultimo è stato addizionato a ciascuna miscela di reazione (10 µl/pozzetto) e incubato con il DNA condensato a temperatura ambiente per 10’, per la formazione dei complessi. A ciascuna miscela così ottenuta sono stati aggiunti 600 µl di DMEM completo e ogni preparazione è stata dispensata goccia a goccia nel rispettivo pozzetto già contenente 1.6 ml di terreno completo fresco (Fig.

39).

La trasfezione è stata effettuata sia in assenza sia in presenza degli inibitori del proteasoma Lactacistina (10 µM) ed MG-132 (25 µM) aggiunti al terreno di coltura a 24 ore dalla trasfezione, al fine di verificare la sensibilità dei prodotti di fusione codificati dai plasmidi ricombinanti al processo di degradazione proteasomale ubiquitina-mediato.

La lactacistina (“synthetic lactacystin”, Calbiochem; ricostituita in H2Odd prima dell’uso) è, infatti, un metabolita di Streptomyces che agisce come inibitore irreversibile del proteasoma inibendone l’attività chimotripsino e tripsino-simile. Ha anche attività apoptogena.

MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-CHO, Carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal, Calbiochem; dissolto in DMSO prima dell’uso) è un inibitore irreversibile del proteasoma, permeabile alle membrane con attività apoptogena.

3.5.3 Analisi dei lisati cellulari

3.5.3.1 SDS-PAGE ed “Immunoblotting”

Trascorse 48 ore dalla trasfezione, si è proceduto al distacco delle cellule trasfettate, precedentemente sottoposte a tre lavaggi in PBS 1x, dalla superficie dei pozzetti, per mezzo di raschietto sterile, per le successive analisi. Le cellule staccate dalla piastra, risospese in PBS 1x, con inibitori di proteasi (Roche), sono state poi bollite per 10’ in tampone di caricamento per la denaturazione delle proteine, prima della separazione mediante SDS-PAGE e dell’“immunoblotting” (effettuato sviluppando i filtri sia con anticorpo pAb α-E7 1:1000, sia con anticorpo pAb α-PVX 1:1000 e con i corrispondenti anticorpi secondari biotinilati seguiti da incubazione con streptavidina perossidasata, e sviluppati come descritto in precedenza, § 3.3.5).

3.5.3.2 Immunoprecipitazione

Alternativamente, i lisati chiarificati sono stati incubati con l’anticorpo primario α-E7 (diluito 1:1000) su ruota per due ore a 15 ÷ 25°C. Alla miscela sono stati successivamente aggiunti 100 µl di Proteina L (Pierce), coniugata ad agarosio e capace di interagire, ad alta affinità, con la regione variabile della catena leggera di tipo κ di numerose classi e sottoclassi di

immunoglobuline. In seguito ad incubazione per quattro ore su ruota a 15 ÷ 25°C, si realizza il legame della Proteina L all’anticorpo primario che determina la precipitazione dell’immunocomplesso formato dall’antigene di interesse e dall’anticorpo murino. Il pellet di resina, lavato più volte con PBS 1x, dopo l’incubazione, è stato risospeso in “gel loading buffer” per proteine, bollito per 4’ e centrifugato per recuperare il sovranatante contenente gli immunocomplessi per l’analisi mediante SDS-PAGE oppure “immunoblotting” secondo le modalità già descritte.

3.5.3.3 Immunofluorescenza

Le cellule della linea HEK-293 sono state fatte crescere in “multi-chamber slides” e trasfettate come descritto. A 48 ore dalla trasfezione, le cellule adeseal vetrino sono state sottoposte a 3 lavaggi in PBS 1x freddo in presenza di inibitori di proteasi, fissate in paraformaldeide al 4% in PBS per 10’ e permeabilizzate con Triton X-100 0.1% in PBS 1x. I campioni sono stati sottoposti a “blocking” in MPBS al 5%. Le cellule sono state incubate con l’anticorpo pAb α- E7 1:1000, seguito dall’anticorpo anti-mouse biotinilato 1021 1:300 e da streptavidina coniugata con FITC 1:50. I nuclei sono stati contro-colorati con Dapi 1x in PBS, alla fne della procedura, prima dell’allestimento finale del vetrino per l’osservazione con microscopio a fluorescenza “Axiolab Zeiss” (Oberkochen, D) interfacciato ad una “Coolsnap CCD camera” (Roper Scient., Princeton, NJ, USA).

3.5.3.4 Estrazione dell’RNA totale dalle cellule trasfettate ed RT-PCR (“Reverse transcription”-PCR).

L’RNA totale è stato estratto dalle cellule a 48 ore dalla trasfezione utilizzando strumenti appositamente trattati, con il reagente “Extract All Buffer” (Eurobio) seguendo le indicazioni della casa produttrice.

L’estrazione è stata verificata separando l’RNA su gel di agarosio all’1% in TBE 0.5% in “denaturation buffer” + “loading buffer” per RNA.

1 µg di RNA estratto è stato quindi incubato con 1 unità di DNAsi “RNAse-free” (Promega) in 10 µl di volume di reazione contenente tampone di reazione 1x, a temperatura ambiente per 30’. La reazione è stata bloccata con 2 µl di EDTA 10 mM.

La trascrizione inversa è stata eseguita su 1 µg di RNA trattato con DNAsi in un volume di reazione di 25 µl contenente:

- H2Odd a volume

- 0.5 µl di oligo(dT) primer (0.5 µg/µl) Tale miscela contenente l’RNA è stata

denaturata a 70 °C per 5’ e poi

posta in ghiaccio e completata con:

- 1.25 mM di ciascun dNTP,

- 5 µl Reaction Buffer 10x 42°C per 1 ora - 1 unità di Inibitori porcini di ribonucleasi

- 200 U of M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)

L’amplificazione mediante PCR è stata effettuata nelle condizioni e con i primers già descritti per le amplificazioni delle sequenze clonate in pcDNA 3.1(+), ed è stata verificata su gel di agarosio.

3.5.4 Analisi dei mezzi condizionati per l’individuazione di prodotti di secrezione 3.5.4.1 Ultracentrifugazione

Con riferimento al protocollo sperimentale di Savelyeva et al. (2001), relativo all’espressione in cellule COS-1 e alla successiva identificazione nel terreno di coltura della proteina di fusione scFv-CP, i mezzi condizionati derivanti dalle HEK trasfettate con i plasmidi ricombinanti in pcDNA3-PGIPss-E7GGG e pcDNA3-PGIPss-E7GGG-KDEL, pcDNA3- PGIPss-E7GGG-CP e pcDNA3-PGIPss-E7GGG-linker-CP, centrifugati a 1000 x g per 5’, per eliminare eventuali cellule residue, sono stati sottoposti ad ultracentrifugazione a 135000 x g per 2 ore. I precipitati sono stati poi risospesi in PBS 1x con inibitori di proteasi (Roche) per l’effettuazione di un saggio ELISA o bolliti in presenza di “gel loading buffer” per proteine, per la separazione mediante SDS-PAGE e dell’analisi per “immunoblotting”.

3.5.4.2 Immunoprecipitazione

Un volume di 15ml di mezzo condizionato prelevato dalle cellule trasfettate con i costrutti pcDNA3.0/PGIPss-E7GGG e pcDNA3.0/PGIPss-E7GGG-KDEL, pcDNA3.0/PGIPss- E7GGG-CP e pcDNA3.0/PGIPss-E7GGG-linker-CP, è stato immunoprecipitato nelle condizioni già descritte per i lisati (§ 3.5.3.2)

3.5.4.3 ELISA (“Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay”)

I mezzi condizionati tal quali ed i precipitati, derivanti dalla loro ultracentrifugazione e risospesi in PBS, sono stati sottoposti a saggio ELISA.

L’immobilizzazione degli antigeni di interesse sulle piastre da microtitolazione è stata ottenuta per incubazione, all’interno di ciascun pozzetto, di 100 µl di mezzo condizionato, per una notte a 4°C. Effettuati tre lavaggi in PBST e uno in PBS 1x, gli eccedenti siti di legame del pozzetto sono stati saturati mediante incubazione in MPBS 10%, mantenuto per 2 ore a 37°C. Ripetuti i lavaggi, sono stati aggiunti, in ciascun pozzetto, 100 µl di MPBS 2% contenente l’anti-corpo primario (α-E7 o α-PVX, entrambi diluiti 1:1000), mantenuto a contatto con l’antigene per 2 ore a 37°C. Dopo un’altra serie di lavaggi, si è proceduto all’incubazione con l’anticorpo secondario (“anti-mouse” o “anti-rabbit” coniugati a perossidasi, diluiti rispettivamente 1:10000 e 1: 5000 in MPBS 2%), per un’ora a 37 °C. La reazione colorimetrica è stata indotta aggiungendo, in ciascun pozzetto, 100 µl di soluzione di sviluppo contenente, in rapporto 1:1, H2O2 e il substrato ABTS [acido 2’,2’-azino bis-(3- etilbenzotiazolin) solfonico] della perossidasi.

3.6 VACCINAZIONI TERAPEUTICHE A DNAIN MODELLO PRE-CLINICO